氣相色譜法同時(shí)測(cè)定苯酰甲硝唑原料藥中乙醇甲苯和吡啶殘留量

胡憶諾，汪夢(mèng)蝶，施春陽(yáng)，張鷹

(1.湖北省宏源藥業(yè)科技股份有限公司注冊(cè)部，黃岡 438000；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430030；3.武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430022)

苯酰甲硝唑即甲硝唑苯酰酯，口服后在胃腸道中水解，釋放出甲硝唑而發(fā)揮作用，藥理作用與甲硝唑相同，臨床上主要用于抗厭氧菌和滴蟲等[1]。該藥在合成與精制過程中可能殘留的有機(jī)溶劑有吡啶、甲苯、乙醇。已有研究者對(duì)其有關(guān)物質(zhì)采用薄層色譜(TLC)或高效液相色譜(HPLC)[2-3]的方法進(jìn)行了研究，但筆者未見研究其殘留溶劑的報(bào)道。本文建立氣相色譜法來測(cè)定苯酰甲硝唑中可能存在的殘留溶劑吡啶、甲苯、乙醇，并進(jìn)行了方法學(xué)研究。

1 儀器與試劑

1.1儀器 Agilent 7890B型氣相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)，包括氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)、Agilent 7697A型自動(dòng)頂空進(jìn)樣器、Agilent OpenLAB CDS ChemStation A.2.3.57工作站。PEAK氣體發(fā)生器(英國(guó)PEAK公司)，包括Precision Air Compressor、Precision Hydrogen、Precision Nitrogen、Precision Zero Air Series。AUW 220D型雙量程分析天平(感量：0.1 mg/0.01 mg，日本Shimadzu公司)。

1.2試劑N’N-二甲基甲酰胺(西班牙Scharlau公司，頂空氣相級(jí)，批號(hào)：18716813)；乙醇(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130106-201904，含量：99.9%)；甲苯(武漢市中天化工有限責(zé)任公司，分析純，批號(hào)：20091126)；吡啶(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130110-201302，含量：100%)。苯酰甲硝唑(湖北宏源藥業(yè)科技股份有限公司，批號(hào)：P-0222007001，P-0222007002，P-0222007003，P-0222007004，0222010001，0222011001，0222011002，0222011003，0222011001F，0222011002F，0222011003F)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：InertCap FFAP毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)；載氣：氮?dú)?N2)；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度200 ℃；分流比20：1；氫火焰離子化檢測(cè)器；檢測(cè)器溫度250 ℃；柱溫，程序升溫：起始溫度為60 ℃，維持1 min，以4 ℃·min-1升溫至100 ℃，維持1 min，再以10 ℃·min-1升溫至200 ℃；進(jìn)樣體積為1 μL 。

2.2溶液制備 ①空白溶劑：N’N-二甲基甲酰胺。②乙醇對(duì)照品儲(chǔ)備液：精密稱取乙醇對(duì)照品247.67 mg，置50 mL量瓶中，用N’N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，即得。③甲苯對(duì)照品儲(chǔ)備液：精密稱取甲苯對(duì)照品42.30 mg，置50 mL量瓶中，用N’N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，即得。④吡啶對(duì)照品儲(chǔ)備液：精密稱取吡啶對(duì)照品18.39 mg，置50 mL量瓶中，用N’N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，即得。⑤混合對(duì)照品溶液：精密量取乙醇對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL，甲苯對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL，吡啶對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置同一20 mL量瓶中，用N’N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，即得。⑥供試品溶液：取本品1.0 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，用N’N-二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3各成分定位 取乙醇對(duì)照品儲(chǔ)備液、甲苯對(duì)照品儲(chǔ)備液、吡啶對(duì)照品儲(chǔ)備液分別進(jìn)樣，乙醇、甲苯、吡啶的保留時(shí)間分別為3.984，5.149，7.718 min。

2.4專屬性 取空白溶劑N’N-二甲基甲酰胺、混合對(duì)照品溶液、供試品溶液分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。見圖1。空白溶劑中溶劑峰不影響乙醇、甲苯、吡啶的測(cè)定；混合對(duì)照品溶液中乙醇、甲苯、吡啶的保留時(shí)間分別為3.978，5.139，7.733 min，峰面積分別為162.02，63.71，12.05，各峰分離度良好(>1.5)，塔板數(shù)均>20 000；供試品溶液中可檢出乙醇，未檢出甲苯和吡啶。

圖1 專屬性實(shí)驗(yàn)疊加圖Fig.1 Overlay of specificity test

2.5儀器精密度 取混合對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。乙醇、甲苯、吡啶的峰面積RSD分別為0.32%，0.36%，0.49%，說明本方法儀器精密度良好。

2.6定量限與檢測(cè)限 分別取乙醇、甲苯、吡啶對(duì)照品儲(chǔ)備液適量制成混合對(duì)照品溶液，用N’N-二甲基甲酰胺逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣，記錄色譜圖，根據(jù)信噪比來確定各成分的檢測(cè)限和定量限。以檢測(cè)信噪比(S/N)≈3/1時(shí)的樣品量為檢測(cè)限；以檢測(cè)S/N≈10/1時(shí)的樣品量為定量限，結(jié)果見表1。

表1 定量限與檢測(cè)限結(jié)果Tab.1 Results of quantitative limit and detection limit

2.7線性關(guān)系考察 精密稱取乙醇對(duì)照品251.90 mg、甲苯對(duì)照品41.72 mg、吡啶對(duì)照品11.25 mg，置50 mL量瓶中，用N’N-二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得線性實(shí)驗(yàn)?zāi)敢骸＞芰咳∩鲜鼍€性實(shí)驗(yàn)?zāi)敢?.2，0.4，1.0，2.0，3.0，4.0 mL，分別置20 mL量瓶中，用N’N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，即得線性溶液1～6。取線性溶液1～6分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見表2。乙醇在50.33～1 006.60 μg·mL-1范圍內(nèi)，甲苯在8.34～166.88 μg·mL-1范圍內(nèi)，吡啶在2.25 ～45.00 μg·mL-1范圍內(nèi)濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

表2 3種化合物的線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of linear experiment of three compounds

2.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)下溶液的制備方法制備混合對(duì)照品溶液和6份供試品溶液，分別進(jìn)樣。按外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算，6份供試品溶液中乙醇含量的RSD為1.97%，均未檢出甲苯和吡啶，說明該方法重復(fù)性較好。

2.9溶液穩(wěn)定性 按“2.2”項(xiàng)下溶液的制備方法制備混合對(duì)照品溶液和6份供試品溶液，于室溫(25 ℃)下放置，分別于0，2，4，6，7，8 h取樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，混合對(duì)照品溶液在室溫放置8 h內(nèi)乙醇、甲苯、吡啶峰面積的RSD分別為1.90%，1.78%，2.60%，穩(wěn)定性較好。供試品溶液在室溫放置8 h內(nèi)乙醇峰面積的RSD分別為0.58%，未檢出甲苯和吡啶，穩(wěn)定性較好。

2.10準(zhǔn)確度 取線性母液作為準(zhǔn)確度混合對(duì)照品母液。精密稱取苯酰甲硝唑(批號(hào)P-0222007003)1 g，置10 mL量瓶中，準(zhǔn)備9份。分別精密加入準(zhǔn)確度混合對(duì)照品母液0.5，1.0，1.5 mL，置10 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。平行制備低、中、高濃度供試品溶液各3份，分別取混合對(duì)照品溶液和準(zhǔn)確度供試品溶液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表3，乙醇的回收率在92.45%～99.67%范圍內(nèi)，甲苯的回收率在91.92%～99.23%范圍內(nèi)，吡啶的回收率在92.22%～97.61%范圍內(nèi)。該方法回收率良好，準(zhǔn)確度高。

表3 乙醇回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of ethanol recovery rate %

2.11耐用性實(shí)驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)下溶液制備方法分別制備混合對(duì)照品溶液、苯酰甲硝唑供試品溶液，精密量取供試品溶液和混合對(duì)照品溶液各1 μL，分別注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算乙醇、甲苯、吡啶的含量。通過改變不同的流速(0.9，1.0，1.1 mL·min-1)、不同的進(jìn)樣口溫度(190，200，210 ℃)、不同檢測(cè)器溫度(240，250，260 ℃)來評(píng)估測(cè)定條件參數(shù)有微小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果的承受程度。結(jié)果不同流速、不同進(jìn)樣口溫度、不同檢測(cè)器溫度下乙醇含量的RSD分別為5.85%，4.59%，5.19%，均未檢出甲苯和吡啶，本方法耐用性較好。

2.12多批樣品測(cè)定 取多批苯酰甲硝唑原料藥，按“2.2”項(xiàng)下溶液的制備方法制備混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中乙醇、甲苯、吡啶的含量。結(jié)果批號(hào)為P-0222007001，P-0222007002，P-0222007003，P-0222007004，0222010001，0222011001，0222011002，0222011003，0222011001F，0222011001F，0222011003F的苯酰甲硝唑原料中乙醇含量分別為212.0，480.5，577.2，670.5，681.6，594.5，623.0，689.4，28.3，29.6，29.6 μg·g-1，均明顯低于0.5%，均未檢出甲苯和吡啶。

3 討論

苯酰甲硝唑合成過程中使用的有機(jī)溶劑有：合成原料-苯甲酰氯，溶媒-甲苯、吡啶，精制過程中的溶劑-乙醇。苯甲酰氯遇水或乙醇逐漸分解，生成苯甲酸或苯甲酸乙酯和氯化氫，實(shí)驗(yàn)過程中也證實(shí)了苯甲酰氯已完全分解。基本可以認(rèn)為，反應(yīng)產(chǎn)物苯酰甲硝唑經(jīng)過乙醇精制后，無苯甲酰氯殘留。因此，苯酰甲硝唑原料合成過程中可能殘留的溶劑有甲苯、吡啶和乙醇。

目前，常用的檢測(cè)殘留溶劑的方法為氣相色譜法[4-8]，其中包括頂空進(jìn)樣法和溶液直接進(jìn)樣法。通常情況下，沸點(diǎn)低的溶劑一般采用頂空進(jìn)樣法，沸點(diǎn)高的溶劑可以采用溶液直接進(jìn)樣法[9]。由于甲苯、吡啶的沸點(diǎn)分別為110，115 ℃，均高于100 ℃，故本方法選擇溶液直接進(jìn)樣法。

吡啶、甲苯屬于二類有機(jī)溶劑，即無基因毒性但有動(dòng)物致癌性的溶劑，應(yīng)該限制使用；乙醇是三類溶劑，即溶劑毒性較低，基因毒性研究結(jié)果呈陰性，但尚無長(zhǎng)期毒性或致癌性的數(shù)據(jù)，應(yīng)按《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》或其他質(zhì)量要求限制使用。《中華人民共和國(guó)藥典》《醫(yī)洲藥典》及國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)指導(dǎo)原則中對(duì)上述3種殘留溶劑的限量范圍一致，均為乙醇不得超過0.5%、甲苯不得超過0.089%、吡啶不得超過0.02%，多批樣品測(cè)定結(jié)果顯示，乙醇的量遠(yuǎn)低于限度，未檢出甲苯和吡啶，均遠(yuǎn)在各標(biāo)準(zhǔn)的限度以下。方法學(xué)研究結(jié)果顯示本方法靈敏度高，重復(fù)性好，能有效控制苯酰甲硝唑中乙醇、甲苯和吡啶的殘留量。