褪黑素保護心肌缺血再灌注損傷機制的研究進展▲

鄭孝明 徐彤彤 彭麗 覃秋語

1 桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林市 541001；2 桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院綜合科(醫(yī)療保健病區(qū))，廣西桂林市 541001

【提要】 目的 心肌缺血再灌注損傷(MIRI)可加劇缺血心肌的損傷，甚至出現(xiàn)心肌不可逆性損傷，嚴重損害患者健康，其發(fā)生機制包括氧自由基堆積、炎癥級聯(lián)反應(yīng)、細胞內(nèi)鈣超載和線粒體損傷等。褪黑素(MT)是一種具有苯并五元氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)的內(nèi)分泌激素，可以通過抑制細胞凋亡、調(diào)控細胞自噬水平、減輕過氧化損傷、抗炎癥反應(yīng)、減輕細胞內(nèi)鈣超載和減輕線粒體損傷等對再灌注心肌發(fā)揮保護作用。本文就近年來關(guān)于MT對缺血再灌注心肌的保護作用及其作用機制的研究進展綜述如下。

統(tǒng)計結(jié)果顯示，2016年中國居民的急性心肌梗死(AMI)病死率仍保持著往年的上升趨勢，2016年城市地區(qū)的AMI病死率為58.69/10萬，農(nóng)村地區(qū)高達74.72/10萬[1]。雖然及時使缺血區(qū)的血流再通可以挽救AMI患者的生命，但再灌注同時也會加劇心肌細胞的代謝失調(diào)與結(jié)構(gòu)損壞，使心肌組織進一步受損，即發(fā)生心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[2]。如何減輕MIRI對改善AMI患者的預(yù)后具有重要意義。褪黑素(melatonin，MT)是一種由人體內(nèi)部產(chǎn)生并且受到交感神經(jīng)調(diào)節(jié)的典型神經(jīng)內(nèi)分泌激素，但來自于食物中的外源性MT經(jīng)胃腸道吸收后也可對人體多個器官、系統(tǒng)發(fā)揮作用。近年來，MT由于其強效清除自由基的作用而被廣泛應(yīng)用于不同器官的缺血再灌注模型，其對MIRI動物實驗?zāi)Ｐ偷谋Ｗo作用尤為顯著。本文就近年來國內(nèi)外關(guān)于MT及其對MIRI的保護作用及機制的研究進展綜述如下。

1 褪黑素概述

褪黑素(MT)主要是由哺乳動物的松果體腺細胞在黑暗條件下以色氨酸為原料合成的一種吲哚類物質(zhì)。但富含MT的生物卻不限于哺乳動物，還包括單細胞生物、非脊椎動物甚至某些植物。MT的化學(xué)名稱為N-乙酰基-5-甲氧基色胺，結(jié)構(gòu)式如圖1所示，分子式為C13N2H16O2，為一種小分子物質(zhì)，具有非極性。由于這些特點，MT可以輕易地進入各類細胞膜及血腦屏障，被釋放入血后可調(diào)節(jié)機體各系統(tǒng)生理活動，是一種多功能激素。MT除了可以直接發(fā)揮其生物學(xué)作用外，還能通過和特異性受體結(jié)合激活相關(guān)的信號通路間接發(fā)揮作用。MT下游受體有三類：第一類是膜受體，分為MT1和MT2，MT與它們結(jié)合可以調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶、鳥苷酸環(huán)化酶、磷脂酶C和鈣通道的活性，從而影響細胞內(nèi)信號的傳導(dǎo)和細胞內(nèi)離子含量；第二類是胞質(zhì)受體(MT3)，MT3是一種可抑制醌的電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)從而防止氧化應(yīng)激的醌還原酶；第三類是核受體，即維甲酸相關(guān)孤核受體，MT可通過此類受體調(diào)控維甲酸受體超家族的轉(zhuǎn)錄因子而發(fā)揮相應(yīng)作用。最近人們發(fā)現(xiàn)了MT相關(guān)孤兒受體即G蛋白偶聯(lián)受體50，其雖不與MT結(jié)合，但可增強MT與MT1受體的結(jié)合。MT的生物學(xué)作用包括促進睡眠、調(diào)控生物節(jié)律、延緩衰老、抗腫瘤生長、促進正常細胞生長、抗氧化、保護神經(jīng)、抗炎癥損傷、調(diào)節(jié)免疫、對其他內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)等[3]。

圖1 MT結(jié)構(gòu)式

2 褪黑素與心肌缺血再灌注損傷

研究表明，MT可以減輕MIRI，具體表現(xiàn)為MT可以有效保護線粒體、促進三磷酸腺苷(ATP)合成、減少細胞過氧化損傷、抑制凋亡發(fā)生、減輕炎癥反應(yīng)、降低心肌酶的異常表達、減輕心肌水腫、縮小心肌梗死范圍、改善心臟功能和降低心肌再灌注性心律失常發(fā)生率等[4]。Shafiei等[5]報道，冠狀動脈旁路移植術(shù)患者術(shù)前口服N-乙酰半胱氨酸和MT后可通過抗氧化應(yīng)激減輕早期再灌注損傷。Dominguez-Rodriguez等[6]報道，ST段抬高型心肌梗死患者早期使用MT可明顯縮小再灌注治療后的心肌梗死范圍。Dwaich等[7]報道，接受冠狀動脈搭橋術(shù)的缺血性心臟病患者術(shù)前經(jīng)MT預(yù)處理可以減輕氧化應(yīng)激水平和炎癥反應(yīng)，改善左室功能，減輕心肌細胞凋亡，減輕MIRI，且大劑量MT(20 mg/d)較小劑量MT(10 mg/d)效果更為顯著。Stroethoff等[8]通過研究發(fā)現(xiàn)，MT受體激動劑可通過激活線粒體鉀離子通道，減少再灌注心肌細胞死亡數(shù)量，縮小心肌梗死面積，減輕MIRI。由此可見，MT可保護再灌注心肌，主要通過抗細胞凋亡、調(diào)控細胞自噬、抗氧化應(yīng)激、減輕炎癥反應(yīng)、減輕細胞內(nèi)鈣超載、減輕線粒體損傷等機制來實現(xiàn)。

2.1 MT通過抗細胞凋亡減輕MIRI 細胞凋亡是由基因控制的細胞主動程序性死亡，尤其與凋亡相關(guān)基因B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)家族密切相關(guān)，Bcl-2/Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated x, Bax)比值的變化調(diào)控著細胞在接受到凋亡信號傳導(dǎo)后是否發(fā)生凋亡及凋亡程度。細胞接受到凋亡誘導(dǎo)信號時可通過最關(guān)鍵的內(nèi)源性途徑即線粒體途徑的傳導(dǎo)，激活半胱天冬酶(cysteinyl aspartate specific protease, caspase)，觸發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致大量的細胞凋亡。MIRI中的細胞凋亡是多因素、多途徑、多位點的，不只是某條通路的簡單介導(dǎo)，還包括caspase12參與的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和外源性途徑即caspase8依賴的死亡受體途徑的介導(dǎo)，彼此之間相互交聯(lián)[9]。

恢復(fù)血供的缺血心肌細胞的凋亡相關(guān)基因表達水平會發(fā)生改變，并且再灌注過程中引發(fā)的氧化應(yīng)激、炎性細胞及介質(zhì)的浸潤和鈣超載等也會誘發(fā)心肌細胞凋亡。因此，抗凋亡或調(diào)節(jié)特異性抗相關(guān)凋亡信號通路是減輕MIRI的有效方法，MT具有明顯的抗凋亡作用，不僅可通過調(diào)節(jié)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放來影響線粒體途徑的凋亡信號傳導(dǎo)進而減少細胞的凋亡，還能通過直接抑制細胞色素C的釋放而抑制caspase級聯(lián)反應(yīng)，提高細胞的存活率[10]。

在MIRI中，MT可通過下調(diào)促凋亡因子Bax的表達水平并升高抗凋亡因子Bcl-2的表達水平來減少再灌注后的心肌細胞凋亡，促進機體心肌缺血再灌注后血流動力學(xué)的恢復(fù)[11]。Zhang等[12]利用H9C2細胞建立體外MIRI模型進行研究發(fā)現(xiàn)，MT可以激活核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid2 related factor2，Nrf2)信號通路，而Nrf2被激活后又使其下游基因血紅素氧合酶-1的表達增加，最終降低細胞凋亡率，減輕MIRI。Yu等[13]通過MT預(yù)處理雄性大鼠4周后行MIRI手術(shù)的在體實驗，以及用MT處理H9C2心肌細胞后進行MI/R的體外研究發(fā)現(xiàn)，MT可通過受體依賴的方式激活Notch1基因及其下游靶基因Hes1的表達，增加Akt磷酸化，從而激活A(yù)kt抗細胞凋亡信號通路，通過減少心肌細胞的凋亡數(shù)量及縮小心肌梗死范圍，發(fā)揮保護再灌注心肌的作用。酪氨酸激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(janus kinase2/signal transducer and activator of transcription3, JAK2/STAT3)途徑在大鼠死亡后心臟的供體移植實驗?zāi)Ｐ椭斜话l(fā)現(xiàn)，可能是MT減少心肌細胞凋亡、保護心臟免受再灌注損傷的途徑之一[14]；沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator, SIRT1)途徑也在經(jīng)MT預(yù)處理后接受MI/R手術(shù)的大鼠模型中被發(fā)現(xiàn)，是MT抗再灌注心肌細胞凋亡的相關(guān)作用機制[15]。由此可見，MT可以介導(dǎo)多條通路抑制細胞凋亡，減輕MIRI。

2.2 MT通過調(diào)控細胞自噬減輕MIRI 真核生物進行生長發(fā)育、物質(zhì)合成和其他一些病理過程時會出現(xiàn)細胞器破壞和蛋白質(zhì)損傷，此時機體會通過一種自身保護性機制來降解體內(nèi)的這些損傷物質(zhì)，為其余細胞的存活提供原料，以實現(xiàn)自我更新和機體的存活，維持代謝平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，這種機制被稱為細胞自噬。自噬通過降解受損的細胞器以保持細胞內(nèi)ATP的水平并抑制細胞凋亡的發(fā)生，對缺血損傷的心肌具有一定的保護作用。再灌注會激活自噬相關(guān)基因Beclin-1并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、鈣超載、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體功能障礙等一系列病理生理過程的發(fā)生，最終導(dǎo)致細胞自噬過度發(fā)生，引發(fā)大量細胞器和蛋白質(zhì)被溶酶體清除而不利于細胞的存活，使細胞功能發(fā)生障礙甚至出現(xiàn)自噬性細胞死亡，導(dǎo)致心肌損傷加重[16]。MT可以通過調(diào)節(jié)細胞自噬來減少細胞損傷及死亡，發(fā)揮重要的細胞保護作用。徐臣年等[17]在H9C2心肌細胞缺血再灌注實驗?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)，經(jīng)MT處理的細胞自噬相關(guān)蛋白，例如Beclin-1、自噬相關(guān)基因5和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3B, LC3B)均下調(diào)，細胞存活率增高；阻礙Akt/mTOR信號通路時，MT的相關(guān)保護作用會相應(yīng)地減弱，因此認為MT可能是通過激活A(yù)kt/mTOR信號通路，下調(diào)心肌細胞自噬水平來減輕MIRI。Chen等[18]報道，在關(guān)于MT對大鼠MIRI模型的作用和MT對體外心肌微血管內(nèi)皮細胞影響的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，心肌再灌注時MT可通過激活A(yù)MPK/mTOR信號通路減輕細胞自噬的水平，縮小心肌梗死面積，減輕細胞損傷。由此可見，MT可以通過激活A(yù)kt/mTOR和AMPK/mTOR信號通路，減輕過度的細胞自噬水平，減少細胞死亡，從而減輕MIRI。

2.3 MT通過減輕氧化應(yīng)激減輕MIRI 人體進行各項生理活動的同時伴隨著許多代謝產(chǎn)物的生成，其中活性氧(ROS)就是一類含有氧自由基物質(zhì)的總稱，當細胞受到內(nèi)外環(huán)境的一些有害因素刺激時，會產(chǎn)生大量ROS，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶和作為氫載體的硫氧還蛋白(thioredoxin， TRX)等一系列的抗氧化酶，以及一些由還原性物質(zhì)所組成的人體內(nèi)龐大的抗氧化防御體系維持著ROS的平衡。MT具有強抗氧化性，其吲哚環(huán)上的5-甲氧基化學(xué)結(jié)構(gòu)可極大地增強其捕獲自由基的能力，而N-乙酰基則可保護MT不被單胺氧化酶降解；MT除了可直接與自由基結(jié)合外，還可以通過提高體內(nèi)抗氧化酶的活性而增強清除ROS的能力，間接減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)[19]。MT作為體內(nèi)的非酶抗氧化物質(zhì)，其作用不容忽略。

心肌再灌注后恢復(fù)血液供應(yīng)的血管內(nèi)皮細胞中的黃嘌呤氧化酶被大量激活，加上心肌細胞線粒體電子傳遞鏈式反應(yīng)和炎癥細胞NADPH氧化酶(NADPH oxidase，NOX)的激活，會引發(fā)大量ROS生成，同時內(nèi)源性抗氧化酶活性的降低，最終導(dǎo)致機體內(nèi)ROS過多，超過機體的清除能力而發(fā)生氧化損傷。心肌細胞膜和細胞器等結(jié)構(gòu)都可能被ROS氧化而發(fā)生結(jié)構(gòu)破壞繼而出現(xiàn)功能受損，產(chǎn)生的丙二醛等物質(zhì)具有細胞毒性，會引起細胞功能和能量生成障礙，發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，擴大心肌梗死面積并惡化心功能[20]。

MT可通過減輕細胞氧化應(yīng)激對MIRI發(fā)揮保護作用。Yang等[21]報道，MT能通過降低雄性大鼠MIRI模型下丘腦室旁核內(nèi)SOD的表達，增強下丘腦室旁核中NOX2和NOX4的表達，進而減輕氧化應(yīng)激及抑制大鼠的交感神經(jīng)活動以減輕MIRI。Zhai等[22]報道，MT可以通過激活小鼠MIRI模型SIRT3/SOD2信號通路，上調(diào)谷胱甘肽過氧化物酶、醌氧化還原酶和SOD等酶的活性和Nrf2的表達水平，降低NOX2的表達和丙二醛的生成量，提高抗氧化能力，降低ROS水平，減輕MIRI的氧化應(yīng)激水平。Yu等[23]報道，MT能通過激活Notch1/Hes1/Akt途徑來激活急性高糖狀態(tài)大鼠MIRI模型的TRX系統(tǒng)(TRX、TRX還原酶和NADPH)，維持氧化平衡，減輕MIRI。

2.4 MT通過減輕炎癥反應(yīng)減輕MIRI 炎癥反應(yīng)是機體對各種損傷因子的刺激所產(chǎn)生的以保護性反應(yīng)為主的防御過程。適度的炎癥反應(yīng)可以清除壞死的組織、修復(fù)受損傷的組織，對機體受傷組織的愈合和器官功能的恢復(fù)是必不可少的，但不受控制的或過度的炎癥反應(yīng)會對機體造成嚴重危害。

缺血缺氧時會發(fā)生心肌細胞的壞死和血管內(nèi)皮的損傷，再灌注后大量生成的ROS和心肌細胞內(nèi)鈣超載也會加重細胞損傷；缺血再灌注過程中，中性粒細胞等炎性細胞會大量聚集到損傷部位，激活的中性粒細胞可產(chǎn)生大量的黏附分子，降低微血管血流灌注量，甚至出現(xiàn)“無復(fù)流現(xiàn)象”。炎性細胞可產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)和炎性因子，促進炎性細胞的大量浸潤，引發(fā)炎性反應(yīng)過度激活即發(fā)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)，進而加重損傷。例如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)作為炎癥反應(yīng)中的一個十分重要的細胞因子會在MIRI中迅速表達，使再灌注心肌細胞的離子平衡狀態(tài)發(fā)生改變，誘發(fā)再灌注性心律失常，同時通過激活內(nèi)皮細胞中的黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙。

MT在多種疾病實驗?zāi)Ｐ椭卸急粰z測到具有抗炎特性，在MIRI相關(guān)實驗?zāi)Ｐ椭校琈T對MIRI的保護作用與其抗炎癥反應(yīng)的特性密切相關(guān)。Lan等[14]報道，在大鼠MIRI模型中，MT可通過激活JAK2/STAT3信號通路，降低TNF-α和白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等炎性因子的表達水平，從而減輕心肌水腫；Gul-Kahraman等[24]通過是否將松果體切除建立不同的大鼠離體心肌再灌注模型進行研究發(fā)現(xiàn)，MT能通過介導(dǎo)平衡炎癥的核心因子—核轉(zhuǎn)錄因子κB的表達，減少再灌注后TNF-α、細胞黏附分子、IL-1β、IL-6和一氧化氮合酶等炎性因子和炎癥介質(zhì)的表達。Nduhirabandi等[25]通過對MT(75 ng/L)預(yù)處理大鼠或小鼠離體心臟再灌注模型進行研究發(fā)現(xiàn)，MT能使Toll樣受體4被大量激活，進而激活TNFa/STAT3途徑，減少心肌再灌注的炎性損傷。

2.5 MT通過抑制鈣超載減輕MIRI 心肌細胞缺血缺氧時ATP生成顯著減少，細胞膜上的鈉泵活性降低，Na+泵出減少，胞內(nèi)Na+濃度增加。再灌注時，氧和營養(yǎng)物質(zhì)富集于缺血細胞，鈉泵活性得以再激活并迅速激活膜上的反向鈉鈣交換體將集聚的Na+排出，導(dǎo)致胞外Ca2+大量內(nèi)流，使細胞內(nèi)液中的Ca2+濃度可升高至正常時的200倍，最終形成胞內(nèi)鈣超載[26]。Pittas等[27]報道，細胞內(nèi)鈣超載引起MIRI可能與以下因素相關(guān)：(1)胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+進入線粒體時會消耗大量ATP，而且Ca2+會影響線粒體的生物功能，阻礙能量的生成，影響細胞舒縮功能甚至出現(xiàn)心力衰竭；(2)磷脂酶類和鈣依賴性蛋白酶活性因胞內(nèi)Ca2+的增加被激活，進而分解細胞膜及結(jié)構(gòu)蛋白，導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)受損，引發(fā)不可逆性損傷；(3)ATP酶的活性受到Ca2+的干擾，ATP被大量水解釋放出大量H+，加重細胞內(nèi)酸堿失衡，引發(fā)再灌注性心律失常。因此，減輕細胞內(nèi)鈣超載對保護缺血再灌注心肌具有非比尋常的意義。

研究發(fā)現(xiàn)，在MIRI模型中，MT可通過激活衰老標記蛋白30，調(diào)控胞膜Ca2+泵，增強Ca2+外流，使胞內(nèi)大幅升高的Ca2+濃度得以降低，從而減輕細胞損傷[28]。Zhu等[29]報道，MT能通過激活絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶通路調(diào)節(jié)環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白的表達，從而抑制三磷酸肌醇受體和電壓依賴性陰離子通道的表達，降低細胞質(zhì)和線粒體鈣泵的活化，逆轉(zhuǎn)細胞質(zhì)與線粒體中Ca2+的比值，促進胞質(zhì)Ca2+和線粒體Ca2+的穩(wěn)態(tài)，改善心功能，增強微血管對再灌注損傷的抵抗力，從而減輕MIRI。

2.6 MT通過減輕線粒體損傷減輕MIRI 線粒體作為生產(chǎn)ATP的場所，是機體能量代謝的中心，同時還能產(chǎn)生ROS和促凋亡因子，參與細胞的信號傳導(dǎo)等。線粒體的形態(tài)是高度動態(tài)化的，可通過不斷地分裂和融合來滿足細胞不同的生理需求。就細胞的結(jié)構(gòu)與功能而言，線粒體生物學(xué)及動力學(xué)的完整性是必不可少的，心肌細胞因其對能量的需求極高因此含有非常豐富的線粒體。線粒體作為關(guān)鍵的細胞器，在缺血再灌注等許多病理條件下會受到損傷，相反線粒體損傷也可能是引起心臟和其他組織器官損傷的主要原因之一，這可能與能量應(yīng)激和大量產(chǎn)生ROS有關(guān)，并伴隨著氧化應(yīng)激、鈣升高、細胞凋亡和壞死等的發(fā)生。擁有許多復(fù)雜的生物功能的線粒體在MIRI中發(fā)揮著非常重要的作用，因此保護線粒體的穩(wěn)定性和功能對減輕MIRI有著重要的意義。

MT可以通過減輕線粒體損傷來減輕MIRI。Zhang等[30]報道，在小鼠MIRI模型中，MT可通過激活A(yù)MPK/OPA1信號通路，矯正MIRI時線粒體融合和分裂的異常，確保線粒體的質(zhì)量和數(shù)量，為線粒體和心臟發(fā)送促存活信號。Yu等[31]報道，在1型糖尿病大鼠MIRI模型中，MT能通過調(diào)控AMPK/PGC-1α/SIRT3軸來保護線粒體功能，從而減輕MIRI。Zhou等[32]報道，在小鼠MIRI模型中，MT可以通過介導(dǎo)PPARγ/FUNDC1通路改善線粒體電子傳遞鏈的功能，促進ATP生成，從而抑制血小板過度活化，減輕小鼠MIRI。

3 小 結(jié)

近年來，隨著對MT相關(guān)效應(yīng)的深入研究發(fā)現(xiàn)，MT除具有傳統(tǒng)意義上的生物節(jié)律作用外，還能有效保護機體的心血管系統(tǒng)。MT可通過抑制細胞凋亡、調(diào)控細胞自噬、降低細胞氧化應(yīng)激水平、抗機體炎性反應(yīng)、減輕細胞內(nèi)鈣超載和保護線粒體等減少再灌注后心肌梗死面積的進一步擴大，促進心臟功能恢復(fù)。MT是一種內(nèi)源性分子，用于人體的治療是很安全的，闡明MT對再灌注心肌的保護作用可為如何減輕MIRI提供參考。但是，目前有關(guān)MT在心肌缺血再灌注中應(yīng)用的臨床研究仍較局限，MT的使用時間、方法、部位和劑量問題等仍有待進一步探索。