慢性阻塞性肺疾病病證結合動物模型研究進展*

張 婷 林 也 陳小娟 唐 琳 陸曉珊劉樂平 宋厚盼 廖 菁1， 陳 聰 蔡 雄△

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學中醫診斷學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學中藥粉體與創新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410208）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種以持續氣流受限為特征，嚴重威脅人類健康的疾病[1]。據2018年流行病學調查顯示，我國COPD患者人數高達9 990萬，約占全球COPD患者的25%[2]。西醫學認為COPD的發生主要與氣道炎癥、蛋白酶失衡、氧化應激、微生物病原體、自身免疫及細胞凋亡[3]等有關。中醫學則根據咳嗽、咳痰、喘息等臨床表現，將其歸屬于“咳嗽”“喘證”“肺脹”“肺痿”等范疇[4]，并認為本病的發生與久病肺虛、感受外邪及年老體虛等有關，且涉及肺、脾、腎、心、肝等多臟。

COPD作為一種世界性的常見疾病，其發病機制尚未完全明了。構建病證結合的動物模型是探討其發病機制及研發相應藥物的一種有效途徑。筆者梳理當前文獻資料，從COPD動物模型和COPD病證結合動物模型兩類進行探討。

1 常見COPD動物模型

COPD具有多種建模方法，目前主要由外源蛋白酶、脂多糖、煙霧刺激以及基因調控誘導。模型復制的思路主要是誘使實驗動物產生組織病理學改變，從而使其具有與人類COPD相似的特征。

1.1 蛋白酶誘導型 研究表明，蛋白酶∕抗蛋白酶系統的失衡是引起彈性蛋白過度破壞分解，外周氣道擴張，從而產生肺氣腫的主要原因[5]。常用的蛋白酶有木瓜蛋白酶、中性粒細胞彈性蛋白酶、基質金屬蛋白酶等。Paul等[6]在研究中發現，反復氣管內注射木瓜蛋白酶，可使大鼠出現實驗性的肺氣腫。毛旻等[7]測定支氣管內注入木瓜蛋白酶建立豬肺氣腫模型的可靠性，取小型豬，支氣管鏡下左肺葉內注入木瓜蛋白酶，測得其PO2降低，PCO2及氣道阻力升高，動態肺順應性下降，周邊肺組織肺紋理減少，肺野透光度增強，呈典型的肺氣腫表現。Lynn等[8]研究表明中性粒細胞彈性蛋白酶和基質金屬蛋白酶通過破壞細胞外基質和調節炎癥的方式參與COPD的病理生理學過程。

α-1抗胰蛋白酶是一種重要的蛋白酶抑制劑，在預防COPD方面具有重要作用。Kolarich等[9]在研究中發現α-1抗胰蛋白酶能中和中性粒細胞彈性蛋白酶，保護肺結締組織免受傷害。

1.2 煙霧誘導型 吸煙是導致COPD的主要原因，煙霧中含有許多氧化劑和自由基，會破壞細胞功能，引發白細胞聚集，從而形成氣道炎癥[8]。曹君等[10]為探討單純煙霧暴露所致肺氣腫小鼠模型，將C57BL∕6J小鼠暴露于煙霧90 d，結果顯示小鼠氣道阻力增加，動態肺順應性降低，巨噬細胞和中性粒細胞數量增加，且出現肺特征性的病理改變。Anna等[11]研究香煙煙霧對小鼠銅綠假單胞菌感染后細菌清除率和免疫炎癥參數的影響。鼻飼銅綠假單胞菌及煙霧熏吸誘導COPD模型，結果顯示，小鼠細菌清除速率有所延遲，炎癥反應加強。

煙霧誘導的COPD模型在研究中應用廣泛，其較急性傷害性模型能更好地模擬人長期吸煙引發的慢性發病過程。然而煙霧誘導也存在其局限，如無論這些動物暴露多長時間，由此產生的病理改變都是輕微的，相當于COPD的早期，并不會像COPD晚期那樣功能喪失。

1.3 脂多糖誘導型 脂多糖（LPS）是一種重要的致炎因子，主要存在于革蘭陰性細菌的細胞壁。通過對模型動物氣道內反復滴注LPS，可誘發氣道炎癥，形成COPD。宋小蓮等[12]取Wistar大鼠，通過吸煙和氣道內滴加脂多糖建立COPD大鼠模型。結果顯示，大鼠體重減輕，間歇性咳嗽，呼吸急促，外周血白細胞和中性粒細胞百分比增加，肺組織HE染色有慢性支氣管炎和典型的肺氣腫病變。王瑋等[13]取雄性Wistar大鼠，通過吸煙和氣道內輸注LPS復制COPD模型。結果顯示，模型組大鼠出現攝食、飲水減少，舌下靜脈曲張，活動減少，反應遲鈍，咳嗽，噴嚏，口鼻分泌物增加等癥狀及體征。血清中腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、干擾素-γ等炎性因子均明顯升高。

1.4 基因調控型 COPD的發病也受到基因調控的影響，不少研究者應用基因敲除、轉基因技術等復制COPD動物模型。Florie等[14]通過敲除小鼠近親基因SERPINA1，可使其自發形成肺氣腫。Iizuka等[15]研究發現敲除小鼠Nrf2基因，能加速中性粒細胞性肺炎和通透性肺損傷，誘導形成肺氣腫。Witusik等[16]研究表明髓過氧化物酶編碼基因-463位點的AA基因型能增加COPD的患病風險?；蛘{控是誘發COPD的一種新型方式，將是未來研究的重點。

2 常見的COPD病證結合動物模型

單純的疾病模型不能很好地模擬COPD和中醫證候之間的關系。因此，在中醫藥研究領域，許多學者在疾病模型的基礎上增加中醫的致病因素，以復制COPD中醫證候。

使其既具備西醫的病理特征，又滿足中醫的證型。目前常見的病證結合動物模型有肺氣虛證動物模型、肺脾氣虛證動物模型、肺腎兩虛證動物模型、寒飲蘊肺證動物模型、痰熱壅肺證動物模型、痰瘀阻肺證動物模型等。

2.1 肺氣虛證動物模型 見表1。肺氣虛證是指以咳嗽乏力、氣短而喘、衛外不固為臨床表現的一種證候。其病情較為單一，造模方式多樣，是肺病證候模型中研制最早、最為完善的一種動物模型。

表1 常見肺氣虛證COPD動物模型

2.2 肺脾氣虛證動物模型 見表2。脾在五行屬土肺屬金，土能生金，故脾為肺之母，肺病日久，則子病及母，形成肺脾氣虛之證。目前肺脾氣虛證動物模型主要采用煙熏聯合脂多糖，并輔以苦寒瀉下類中藥進行造模。

表2 常見肺脾氣虛證COPD動物模型

2.3 肺腎兩虛證動物模型 見表3。COPD發展到后期也可影響及腎，形成肺腎兩虛之證。楊士瀛在《仁齋直指方論·咳嗽》指出“肺為氣之主，腎為氣之藏。凡咳嗽暴重，動引百骸，自覺氣從臍下逆奔而上者，此腎虛不能收氣歸元也”。肺腎兩虛證病情復雜，目前擁有的造模方式有限。

表3 常見肺腎兩虛證COPD動物模型

這些模型均能在一定程度上模擬肺腎兩虛證，然則與臨床實際仍存在一定差距。如臨床COPD的肺腎兩虛證多呈進行性發展，一般先累及肺，日久及腎。而在造模之時，腎虛證模型與肺氣虛證模型多同時進行復制，因而有待進一步完善。

2.4 寒飲蘊肺證動物模型 見表4。寒飲蘊肺證是COPD的一個常見證型，多由肺陽氣虛衰，脾失轉輸，飲邪上犯所致。目前多采用煙熏聯合脂多糖或滴加肺炎克雷白桿菌的方法復制COPD模型，再輔以寒涼食物或風寒濕刺激，所謂形寒飲冷皆可傷肺。

表4 常見寒飲蘊肺證COPD動物模型

2.5 痰熱阻肺證動物模型 見表5。痰熱壅肺證多出現在COPD的急性加重期，具有“痰”和“熱”的雙重病機[30]，二者互為因果，正如宋·楊士瀛《仁齋直指方論·病機賦》中所道“痰因火動，有因火而生痰，有因痰而生火”。其臨床可見咳嗽、黃痰、發熱、口干、便干便秘、舌紅苔黃等證候表現。

表5 常見痰熱阻肺證COPD動物模型

2.6 痰瘀阻肺證動物模型 痰瘀阻肺證多由肺氣受損，脾失健運，氣血運行失司，阻滯于肺所致。氣虛、痰凝、血瘀是其發病的關鍵，早在《丹溪心法》中便有提及“肺脹而咳，或左或右不得眠，此痰挾瘀血礙氣而病”。痰瘀阻肺證臨床表現為氣喘、胸悶、肢冷面青、舌暗、舌下絡脈曲張、脈沉或澀等[34]。目前擁有的造模方法較為單一，主要通過煙熏配合勞累、缺氧等方式。李澤庚等[35]每天強迫大鼠游泳30 min，使其勞傷肺氣，而后將其置于熏煙箱內煙熏1 h，最后置入常壓低氧裝置內以建立COPD痰瘀阻肺證模型。王傳博等[34，36-37]參照李澤庚的造模方法構建COPD痰瘀阻肺證大鼠模型，觀察到大鼠肺小動脈管壁變薄、管腔變大，管壁面積占血管總面積的百分比明顯減少，Rock-1、Rock-2蛋白表達及炎癥因子等明顯降低。

3 思考與展望

COPD動物模型造模方式多樣，是探索其發病機制的一種有效途徑。病證結合COPD動物模型更是結合現代醫學“病”和中醫“證”的優勢，在單純疾病模型基礎上模擬氣虛、寒飲、痰熱、痰瘀、腎虛等多種不同的證候，具有較高的可信度與重復性，大大推動了COPD的研究進展，為探討其發病機制及開發相應的中醫藥提供了良好的平臺。然而目前還存在些許不足，主要體現在以下幾個方面。

3.1 動物選取品類 目前常用的COPD模型動物有豚鼠、大小鼠、狗、豬、兔、羊等，其中大鼠由于基因組與人類基因組非常相近，且飼養成本低，性情溫順，繁殖較快，因而在COPD動物模型中應用普遍。但也存在一些不足，如大鼠的支氣管分支較少，左肺葉僅1片，且電鏡下無法觀察到氣管黏膜下的杯狀細胞，這均與人類不符[38]。

3.2 造模方法 COPD動物模型制作方法多樣，優劣各異。如采用煙熏法時經濟實惠，且能很好地模擬人的吸煙過程，但它所造成的病程是輕微的，相當于疾病的早期；采用氣管內滴加脂多糖時往往急性起?。徊捎没蚯贸齽t價格高昂，技術尚未完全成熟。

不僅如此，在制作COPD各證候之時，也存在諸多問題。首先，造證方式不統一，如同為COPD肺氣虛證，有采用煙熏聯合脂多糖，有采用滴菌配合寒冷疲勞刺激，也有采用煙熏配合木瓜蛋白酶霧化吸入。這些方法均能對肺產生明確、特異的病理損害，然而究竟何種更符合臨床實際，尚有待考究。其次，煙熏時所使用材料各異，有香煙，有硫磺粉，有鋸末，有刨花，且同一個模型，不同的研究者進行煙熏的時間不一致。再者，在造證之時，往往通過改變外在環境使動物具有與患者相同或相似的表現，以達到模擬“證”的目的。然而，這些單純的致病因素在實際施加過程中存在著一定程度的不可控性，如在強迫大鼠游泳時，由于大鼠先天個體差異，其游泳所能耐受的強度不一致，最終達到的效果也不一致，因而導致模型的代表性和穩定性均較弱[39]。

3.3 評價標準 在COPD病證結合動物模型的判定中，有通過觀察大鼠的癥狀、體征，有通過檢測相關實驗室指標，也有通過光鏡、電鏡等考察肺特征性的病理改變，然而這些均只能說明模型“造病”成功，卻無法判斷其“造證”成功與否。而模型的“證”主要通過對動物一般癥狀、體征的觀察得到，由人的主觀意識進行判定，缺乏一定的科學性。如在肺脾兩虛證動物模型制造中，對模型動物灌以苦寒瀉下類中藥，大鼠出現納呆，便溏，甚則泄瀉，因而判定有脾虛證形成，然而究竟一天飲食多少才算納呆，大便一天幾次才算泄瀉，糞質溏稀到何種程度才算便溏，尚沒有一個數字化的診斷標準。且不同證之間也會出現相似癥候的兼夾，在造模后期更有可能由于疾病的自然演化而形成其他證候，導致模型動物偏離原來的造模證候，造成實驗結果的偏差。

總之，COPD病證結合動物模型仍處于發展中，尚有待繼續完善，建立一種經濟方便、科學全面且符合人類COPD病證表現的造模方法及建立一個完善的病證結合動物模型的評價標準是未來研究工作的方向所在。