大豆與海藻有機肥對烤煙生長和土壤細菌群落的影響

褚德朋，陳芊如，邰振益，趙福彬，張鑫，張廣雨，尹紹靜，杜本林，賈海江，尚憲超，ILYAS Naila，尤祥偉，黃崇峻*，李義強

1 中國農業科學院煙草研究所，山東青島嶗山區科苑經四路11號 266100；2 山東青島煙草有限公司，山東青島市北區延吉路150號 266000；3 廣西中煙工業有限責任公司，廣西南寧西鄉塘區北湖南路28號 530000

近年來，隨著生態農業的逐步發展，我國煙田以施用無機化肥為主逐漸轉向施用有機肥為主[1]。有機肥對于平衡煙葉煙堿含量和香吃味有重要的作用[2]。研究表明，長期施用有機肥可以增加土壤養分的有效性，提高土壤肥力[3]，提升土壤穩定性和緩沖能力[4]，還可促進細菌繁殖并調節土壤微生物群落的組成和多樣性，使土壤微生物形成更多潛在功能群。Yan等研究發現，施用生物炭基肥料提高了Sphingomonas和Sphingobium等細菌豐度，它們與煙草香氣呈正相關，可增加煙草香氣成分，改善煙葉品質[5]。目前市面所售有機肥質量參差不齊，肥料效果差別很大。本試驗旨在通過海藻肥、大豆肥的試驗，篩選優化土壤結構、改善土壤生態、提高煙葉品質的有機肥種類及用量，以期為煙田土壤環境健康管理和煙草綠色發展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年在山東省青島市黃島區六汪鎮西臺頭村（東經119°44′18″，北緯35°57′16″）進行，試驗地土壤為棕壤，pH 4.18，有機質15.94 g/kg，速效磷28.88 mg/kg，速效鉀276.60 mg/kg，銨態氮0.0187 g/kg，硝態氮0.0309 g/kg。供試烤煙品種為當地主栽品種中煙100。按照煙葉生產實際肥料需求，施用煙草專用肥（N 10%、K2O 20%、P2O510%）450 kg/hm2，硫酸鉀225 kg/hm2。市售普通有機肥（N+P2O5+K2O≥5、有機質≥65%）與大豆有機肥（N+P2O5+K2O≥8、有機質≥95%、蛋白質≥38%）均由青島農特生物科技有限責任公司提供；海藻有機肥（N+P2O5+K2O≥5、有機質≥45%、海藻酸≥4%、有機鈣≥10%）由青島明月海藻集團有限公司提供。

1.2 試驗設計

所用有機肥分別與常規氮磷鉀復合肥和硫酸鉀混合，條施后起壟。試驗采用單因素隨機區組設計，共設置8個處理（見表1），對照（CK）為常規施肥而不施有機肥處理，每小區3壟，每壟50株，重復3次，行株距為120 cm × 50 cm。試驗過程中嚴格按照當地優質煙生產技術規范執行。煙苗于2019年4月28日移栽。

表1 試驗處理Tab. 1 Experimental treatments kg·hm-2

1.3 測定內容及方法

1.3.1 農藝性狀調查

團棵期各處理隨機選取煙株5株，將地上部和地下部于莖基部分離，地下部用清水洗凈泥沙晾干，分別稱取兩部分鮮重后放置于烘箱105℃殺青30 min，65℃烘干至恒重；旺長后期—現蕾期每小區選擇有代表性10株煙，根據《煙草農藝性狀調查測量方法》（YC/T 142—2010）進行農藝性狀調查。

1.3.2 土壤樣品采集及測定

于移栽后60 d左右進行土樣采集，各處理均采用5點取樣法采集0～20 cm土層，采用抖根法收集其根際土壤[6]；在根系周圍2～5 cm的位置采集非根際土，將各處理采樣點土壤等量混合，按四分法分為2份，1份放于-80 ℃保存，用于土壤微生物測定分析；另外1份風干后研磨過0.25 mm篩，進行土壤理化性質檢測。土壤理化性質測定方法參照土壤農化分析標準檢測方法[7]。

1.3.3 煙葉樣品采集及測定

旺長后期每小區隨機采集中部煙葉5～6片放入烘箱105℃殺青30 min，65℃烘干至恒重，粉碎后過20目篩。采用H2SO4-H2O2法消解，煙葉氮、磷、鉀含量測定方法參照植物營養元素標準檢測方法[7]。

1.3.4 高通量測序分析微生物群落

稱取0.50 g土壤，使用DNeasy?PowerSoil?Kit（100）試劑盒提取DNA。參照文獻[8]的方法使用引物341F（CCTAYGGGRBGCASCAG）和806R（GGACTACNNGGGTATCTAAT）以細菌16S rRNA基因的V3～V4區域為靶點，采用熱循環PCR系統進行DNA擴增。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。高通量測序文庫的構建和基于Illumina MiSeq平臺的測序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.4 數據處理與統計分析

通過使用FLASH軟件對Reads拼接過濾后得到優質序列，利用Uparse軟件在相似性為97%的水平上，將序列聚類為操作分類單元（Operational taxonomic units，OTU）。通過對比silva 數據庫（細菌），對OTUs序列進行物種注釋及豐度分析，得到每個OTU對應的物種分類信息，揭示樣品的物種組成，分析樣品之間的微生物群落差異。采用WPS 2019計算原始數據的均值和標準差，并完成圖表制作；采用SPSS 18.0統計軟件Duncan法，比較分析相關數據在P≤0.05水平的差異顯著性。

2 結果

2.1 不同處理對烤煙生長的影響

由表2可以看出，不同用量大豆有機肥和海藻有機肥的施用對煙株團棵期地上部和地下部的鮮重產生了明顯影響。其中BOF30處理團棵期地上部和地下部的鮮重均較CK顯著增加（P＜0.05），分別提高了131.39%和53.10%，而BOF20和BOF40處理與CK差異不顯著（P＞0.05）；施用海藻有機肥的各處理，煙株團棵期地上部和地下部的鮮重與CK相比都有提高，但無顯著差異。說明有機肥施用后煙株生長狀況得到改善。

表2 不同試驗處理團棵期地上部與地下部鮮重Tab. 2 Aboveground and underground fresh weight under different experimental treatments at the cluster stage

反映煙株長勢的指標主要有株高、莖圍、有效葉數、節距、最大葉長、最大葉寬和最大葉面積。由表3可知，施用大豆有機肥后，旺長后期—現蕾期株高、莖圍、節距、最大葉長以及最大葉面積5項指標均高于CK，除莖圍外其它指標與CK差異顯著。有效葉數與最大葉寬的BOF30和BOF40處理分別與CK差異顯著，與COF無顯著差異；施用海藻有機肥后，旺長后期-現蕾期株高、莖圍、節距以及最大葉長亦顯著高于CK，WOF30的有效葉數和最大葉寬顯著高于CK，較CK分別提高了15.58%、28.57%，但與COF差異不顯著，最大葉面積除WOF20外其余處理均顯著高于CK，且WOF30處理為最大值處理。綜上所述，兩種有機肥中施用量450 kg·hm-2的效果好于低用量（300 kg·hm-2）和高用量（600 kg·hm-2）。

表3 不同試驗處理旺長后期-現蕾期農藝性狀Tab. 3 Agronomic traits under different experimental treatments at the vigorous growing and flower budding stage

2.2 不同處理對土壤理化性質的影響

旺長期各處理土壤理化性質如表4所示。根際土壤中各處理pH、速效磷（Available phosphorus，AP）含量與CK均無顯著差異；土壤有機質（Soil organic matter，SOM）WOF30處理較其他處理顯著升高；BOF30處理土壤速效鉀（Available K，AK）、銨態氮（Ammonium nitrogen，NH4+-N）以及硝態氮（Nitrate nitrogen，NO3--N）含量三指標與CK均差異顯著，分別較CK提高了239.12%、46.48%以及216.13%。非根際土壤中BOF30和WOF30兩處理土壤有機質和速效磷含量與CK無顯著差異，但均呈升高趨勢，COF處理土壤速效磷含量顯著高于其他處理；土壤pH、速效鉀和銨態氮含量三指標僅有BOF30處理與CK差異顯著；土壤硝態氮含量各處理顯著高于CK，增幅為222.37%～488.16%。

表4 不同試驗處理旺長期土壤理化性質Tab. 4 Soil physi-chemical properties under different experimental treatments at the vigorous growing stage

2.3 不同處理對煙葉氮、磷、鉀含量的影響

兩種有機肥不同施用量對旺長后期煙草葉片氮、磷、鉀含量具有不同程度的影響（表5）。與CK相比，施用不同量大豆有機肥和海藻有機肥處理的煙葉氮、鉀含量均降低；煙葉磷含量WOF30處理顯著高于CK，較CK提高了47.37%，其他處理與CK均無顯著差異。

表5 不同試驗處理旺長后期煙葉氮、磷、鉀含量Tab. 5 Contents of N, P, K in tobacco leaves under different experimental treatments at the late vigorous growing stage %

2.4 不同處理對土壤微生物多樣性和結構的影響

土壤細菌群落多樣性分析結果顯示（表6），根際土壤和非根際土壤中大豆有機肥和海藻有機肥施用后細菌群落豐富度和多樣性均與CK無顯著差異。此外，根際土壤大豆和海藻有機肥處理中除WOF30處理Chao 1指數、ACE指數高于CK外，其余均較CK降低，表明海藻有機肥施用后根際土壤中細菌群落豐富度升高多樣性降低，而大豆有機肥施用后豐富度和多樣性均降低。與CK相比，非根際土壤中WOF30處理Chao 1指數和ACE指數降低、香農（Shannon）指數和辛普森（Simpson）指數升高，BOF30處理Chao 1指數和ACE指數升高、香農指數降低，表明海藻有機肥施用后非根際土壤中細菌群落豐富度降低多樣性升高，而大豆有機肥施用后豐富度升高多樣性降低。

表6 不同試驗處理根際和非根際土壤細菌群落多樣性指數分析Tab. 6 Diversity index analysis of bacterial communities in rhizosphere and non-rhizosphere soils under different experimental treatments

不同試驗處理根際與非根際土壤微生物屬水平的群落組成及相對豐度如圖1所示。分析根際土壤中不同細菌屬的數量，表明其中優勢細菌屬包括（圖1(a)）：Chujaibacter、Sphingomonas、Phenylobacterium、Rhodanobacter以及Bryobacter。與CK相比，五種優勢菌群在BOF組中Chujaibacter和Bryobacter豐度降低，Sphingomonas、Phenylobacterium和Rhodanobacter豐度升高，然而WOF組中Chujaibacter和Bryobacter豐度升高，Phenylobacterium和Rhodanobacter豐度則降低，兩組之間菌群變化趨勢相反。非根際土壤中（圖1(b)）的優勢菌群則主要為Bryobacter、Chujaibacter、Acidibacter、Rhodanobacter以 及unidentified_Acidimicrobiia，與根際土壤大體一致。同CK相比較，Alicyclobacillus在BOF組中顯著升高，且Dyella為該組的特有菌，其相對豐度分別為0.08和0.02。

圖1 不同試驗處理根際與非根際土壤微生物屬水平的群落組成及相對豐度Fig. 1 The community composition and relative abundance of microbial genus levels in rhizosphere and non-rhizosphere soil under different experimental treatments

PCA主成分分析能夠反映不同試驗處理下煙株根際和非根際土壤細菌群落的變化情況。圖2(a)為根際土壤細菌屬水平上的PCA圖，可知WOF與另外3組均差異明顯，而BOF與CK、COF之間并未表現出明顯差異，表明WOF的施用改變了煙株根際土壤的細菌群落結構，但BOF的使用并未明顯改變。在PC1維度上，可以將WOF處理和其他3組處理分開，說明WOF處理與其他處理間細菌群落結構存在差異性。由圖2(b)可以看出，在非根際土壤中PC1是造成樣品差異性的最大主坐標成分，其次是PC2，分別解釋了21.43%和15.72%的貢獻率，兩個主坐標軸總貢獻率達37.15%。BOF和COF處理位于第1象限，CK和WOF處理位于第3象限，說明不同有機肥的施用改變了細菌群落結構。

圖2 不同試驗處理根際（a）和非根際（b）土壤細菌群落主成分分析（PCA）Fig. 2 Principal component analysis (PCA) of bacterial communities in the rhizosphere soil ( a) and non-rhizosphere soil (b) under different experimental treatments

選取單因素方差分析法基于屬水平微生物的相對豐度分析各處理之間根際土壤和非根際土壤微生物的組成差異（圖3）。分析發現根際土壤中Cutibacterium在CK和WOF以及BOF和WOF中差異顯著，而Actinospica在COF和WOF中差異顯著，且兩種微生物在WOF中的豐度均高于另外3組；非根際土壤中Dyella和Pandoraea分別在CK和WOF以及BOF和WOF中差異顯著，且兩種微生物在WOF中的豐度低于對比組，然而Pseudonocardia在WOF中顯著高于COF。綜上所述，施用海藻有機肥后無論在根際土壤還是在非根際土壤中的細菌群落結構變化程度均大于其他處理組。

圖3 不同試驗處理根際與非根際土壤微生物屬水平組間差異物種Fig. 3 Species difference between rhizosphere and non-rhizosphere soil microbial genus level under different treatments

2.5 不同試驗處理土壤理化性質與土壤微生物的關系

圖4分別估算了6種環境因子[pH值、NH4+-N、NO3--N、速效磷（AP）、AK和土壤有機質（SOM）]對根際土壤和非根際土壤中微生物在屬水平上的相對貢獻。結果表明，根際土壤中pH值、AK和NH4+-N是影響微生物結構的主要環境因子，pH值對Sphingomonas和Bryobacter有正相關作用，AK對Sphingomonas和Bryobacter有負相關作用，而NH4+-N對Sphingomonas和Bryobacter分別有正相關和負相關作用。非根際土壤中AK、NO3--N和NH4+-N則是影響微生物結構的主要環境因子，三者均對Bryobacter有負相關作用。

圖4 不同試驗處理根際（a）和非根際（b）土壤理化性質與土壤微生物的冗余分析Fig. 4 Redundancy analysis of physi-chemical properties and soil microorganism in rhizosphere soil (a) and non-rhizosphere soil(b) under different experimental treatments

3 討論

本研究表明大豆和海藻有機肥的施用促進了煙株的生長發育，煙株團棵期地上部與地下部鮮重以及旺長期農藝性狀都較CK顯著增加，這與前人的研究結果一致。劉麗輝等[9]研究表明，不同施用量生物有機肥對煙草植株的農藝性狀和光合色素含量的提高具有不同程度的促進作用；呂大樹等[10]研究發現有機肥與無機肥配合施用，可以改善煙株的植物學性狀和農藝性狀，降低煙株發病率。本研究表明施用大豆和海藻有機肥后，根際土壤和非根際土壤的有機質和氮磷鉀含量呈升高趨勢，這與前人的研究結果一致。朱益等[11]、蒲全明等[12]研究表明，有機肥施入能改善土壤理化性質，減少養分向深層土壤流失、提高土壤中有機質的含量、提高養分的有效性，從而顯著提高土壤速效養分的含量，且養分含量隨有機肥比例上升而提高。氮、磷、鉀與植物的物質合成和新陳代謝密切相關[13]。本研究表明，大豆和海藻有機肥施用后煙葉的氮、磷、鉀含量與CK相比均降低，可能原因為大豆和海藻有機肥施用后促進了煙株的新陳代謝和物質合成，大量消耗氮、磷、鉀，因而導致煙葉氮、磷、鉀含量降低，具體原因還需進一步研究。

土壤微生物作為評價土壤的重要生物學指標，與土壤質量和土壤健康變化密切相關[14]。微生物群落結構和多樣性、微生物生物量以及微生物活性作為常用的土壤健康微生物指標[15-16]，同時是評價土壤質量和土壤健康的關鍵指標[17]。隨著生物技術的快速發展，土壤微生物群落結構和多樣性在評價土壤健康方面的潛力被充分挖掘。本研究中，大部分處理根際土壤的細菌群落豐富度指數和多樣性指數都高于非根際土壤，表現出了明顯的根際效應。施用海藻有機肥使得根際土壤微生物群落豐富度升高多樣性降低，非根際土壤與之相反；大豆有機肥施用后根際土壤微生物群落豐富度和多樣性均降低，非根際土壤則豐富度升高多樣性降低。可能原因為不同有機肥所包含的成分有所區別，不同細菌生活所需的營養物質也有差異，導致土壤中細菌對其響應出現差別，而且由于某些根系分泌物吸引有益微生物，抑制有害微生物，從而使土壤微生物群落豐富度和多樣性出現變化。有研究已表明根系釋放的各種分泌物可以選擇性地刺激微生物種群生長，并可以為微生物提供營養來源，從而使微生物富集在根際土壤中，因此根際土壤微生物豐度和活性遠高于非根際土壤[18]。本研究發現，根際土壤中Bryobacter、Sphingomonas、Actinospica以及非根際土壤中Pseudonocardia為主要有益菌。Bryobacter隸屬于酸桿菌門（Acidobacteria），能夠降解植物殘體、參與單碳因子代謝且喜貧瘠的土壤，在增加土壤有機質和提高植物抵抗逆境能力等方面有重要作用[19-20]。Sphingomonas是促進植物生長的有益細菌，能夠產生IAA并誘導根系生長，并且該菌與煙草香氣呈正相關，可增加煙草香氣成分[5]。Actinospica可通過調控土壤微環境從而提高植物對生長環境的適應能力[8]。Pseudonocardia參與土壤養分循環，并且與土壤碳、氮含量呈正相關，可促進煙草生長以及改善煙葉品質[5]。

4 結論

大豆與海藻有機肥對烤煙生長和土壤細菌群落的影響主要有：（1）兩種有機肥提高了土壤有機質和氮、磷、鉀含量，對團棵期、旺長期的農藝性狀都有很好的促進效果，其中450 kg/hm2處理為最佳處理。（2）兩種有機肥改變了土壤細菌群落的豐富度和多樣性，Sphingomonas、Actinospica、Pseudonocardia等有益細菌豐度增加。