硃砂煙 基因表達模式及煙堿轉化率分析

宋中邦，隋學藝，張誼寒，王亞輝，趙高坤，李勇，王丙武，劉加紅，解燕，楊世波，顧華國*

1 云南省煙草農業科學研究院/煙草行業煙草生物技術育種重點實驗室/國家煙草基因工程研究中心，昆明 650021；2 云南省煙草公司曲靖市公司，曲靖 655000；3 云南香料煙有限責任公司，保山 678000

栽培煙草（Nicotiana tabacum）是兩個祖先絨毛狀煙草（N. tomentosiformis）和林煙草（N. sylvestris）通過種間雜交形成的異源四倍體，其葉片生物堿譜與兩個祖先種存在顯著差異。大部分栽培煙草的綠色及衰老葉片中煙堿是主要生物堿，約占生物堿總量的90%～95%。絨毛狀煙草在綠色及衰老葉片中均積累去甲基煙堿；而林煙草在綠色葉片中主要積累煙堿，但在葉片衰老過程中大部分煙堿轉化為去甲基煙堿[1-2]。白肋煙“非轉化株”（Non-converter）葉片的主要生物堿為煙堿，但其子代群體中約有20%單株能發生自發突變，煙葉內的煙堿通過去甲基酶的作用轉化為去甲基煙堿，從而使去甲基煙堿成為煙葉中積累的主要生物堿之一，這樣的突變株稱為“轉化株”（Converter）[3]。烤煙也會發生類似自發突變導致其煙葉主要累積去甲基煙堿，且突變株烤后煙葉表面呈現紅色斑點，國外學者稱為“Cherry-red”[4-6]，我國民間稱之為“硃砂煙”。硃砂煙出現概率極低，有研究表明在538個單株中發現3株硃砂煙，概率僅為0.56%[5]。硃砂煙具有獨特的“糯米香”，云南地區煙民抽吸水煙筒時會將硃砂煙葉作為調香原料。

煙堿去甲基酶催化煙堿脫甲基產生去甲基煙堿，目前煙草基因組中煙堿去甲基酶基因家族共有4個功能基因被克隆，分別為CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10、CYP82E21[7-12]。CYP82E21基因雖能編碼具有活性的煙堿去甲基酶，但僅在花藥中表達，不影響葉片去甲基煙堿含量[11]。研究表明白肋煙“轉化株”中CYP82E5、CYP82E10基因對去甲基煙堿合成無明顯貢獻，而CYP82E4在白肋煙“轉化株”受未知機制誘導高水平表達，是導致“非轉化株”自發突變成“轉化株”的關鍵基因[12]。“非轉化株”中過表達該基因可以顯著提高葉片煙堿轉化率（nicotine conversion rate，NCR，去甲基煙堿/（煙堿+去甲基煙堿）×100%），而通過RNAi抑制轉化株CYP82E4基因表達、轉化株中CYP82E4基因突變均能導致煙堿轉化率顯著下降[9-10]。烤煙中CYP82E4基因表達水平極低，煙堿去甲基化反應主要由CYP82E5、CYP82E10催化。云煙87中CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10基因三突材料的葉片去甲基煙堿含量比對照下降約90%[13]。因堿譜類似白肋煙“轉化株”，推測烤煙“轉化株”（硃砂煙）中CYP82E4基因也可能被誘導高水平表達，導致其煙葉中主要累積的生物堿為去甲基煙堿。

硃砂煙作為一種自發突變材料，其突變概率可能受到品種、土壤、營養、生態等因素的影響。本研究對硃砂2號開展農藝、遺傳、基因、化學等特征特性分析，可為今后進一步研究硃砂煙成因提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

2019年在云南省煙草農業科學研究院玉溪研和試驗基地發現云煙87部分單株烤后產生硃砂煙，留杈套袋自交收種獲得硃砂2號種子。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗

2020年度硃砂2號在云南省煙草農業科學研究院玉溪研和試驗基地進行品比試驗，田間生產參考當地云煙87的配套措施。設3個小區，每個小區種植100株左右，打頂后隨機選取10株調查農藝性狀。烤后煙葉根據硃砂紅色深淺程度人工分成淺紅、中等紅色、深紅3組進行相關研究。硃砂煙比率=當爐硃砂煙葉重量/當爐烤后煙葉總重×100%。

1.2.2 定量PCR分析

分別在煙株田間生長的團棵期、現蕾期、打頂后3個時期對煙株中部葉片液氮取樣后-80℃保存備用。提取總RNA，反轉錄獲得cDNA第一鏈（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，Takara）。采用SYBR Green法（SYBR Green l Master Mix，Roche）對目標基因進行熒光實時定量PCR（qRT-PCR）分析（LightCycler 480，Roche），定量引物如表1所示。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.2.3 生物堿檢測

烤后取中部煙葉用于化學成分檢測，設6個生物學重復。生物堿檢測：內標喹啉、去甲基煙堿購自Sigma-Aldrich公司，煙堿購自TRC公司，檢測儀器為Bruker 450GC-300MS氣相色譜-串聯質譜儀（Bruker）。準確稱取煙樣0.5 g于50 mL離心管中，加入5 mL 10%的NaOH溶液，搖勻，浸泡15 min，加入20 mL含內標的萃取液，超聲60 min，在離心機上5000 r/min離心5 min，取2 mL下層二氯甲烷清液過裝有2 g無水硫酸鈉的微孔過濾器后，用氣相色譜-串聯質譜儀分析[14]。

2 結果與分析

2.1 硃砂2號田間農藝性狀及硃砂煙葉產出規律

國外有文獻記載[4-6]，烤煙品種高轉化株的烤后煙葉也呈紅色，被命名為“Cherry-red”。2019年烤煙生產季在云南省煙草農業科學研究院玉溪研和試驗基地發現云煙87部分單株烤后煙葉呈紅色（圖1），這種外觀初烤煙葉在云南煙區長期存在，被煙農稱為“硃砂”煙，因此推測“硃砂”煙葉即是“Cherryred”煙，將該資源命名為硃砂2號。2020年烤煙生產季，對硃砂2號和對照云煙87進行了品系比較試驗。田間試驗結果表明，硃砂2號田間長勢強、煙株整齊度較高，株型、葉色、生育期等性狀與云煙87基本一致。硃砂2號打頂株高130.2 cm，有效葉片數26.5，莖圍10.0 cm，腰葉長寬分別為64.2 cm和30.5 cm，各項指標與對照云煙87相當（表2）。烘烤試驗分5次采烤完畢，按每一爐烤后獲得煙葉總質量及硃砂煙葉質量計算硃砂煙比率。根據圖2所示，下部葉也有一定比率硃砂煙葉產生，隨著葉位增高，硃砂煙比率迅速上升，最后一爐硃砂煙比率高達87.5%，整體硃砂煙產出率為64.3%。

圖1 硃砂煙葉烤后表型Fig. 1 Cherry-red phenotype of Zhusha tobacco leaves

圖2 不同烘烤階段硃砂煙葉比例Fig. 2 The percentage of Zhusha tobacco leaves in different curing stages

表2 硃砂2號農藝性狀Tab. 2 The agronomic traits of Zhusha2 tobacco

2.2 硃砂煙特征基因和化合物研究

生物堿分析表明，同田種植的云煙87烤后煙葉煙堿含量為1.59%，去甲基煙堿含量為0.09%，煙堿轉化率為5.12%（圖3）。硃砂2號煙葉的堿譜與云煙87不同，其主要生物堿為去甲基煙堿，顏色呈淺紅、中等紅色、深紅的硃砂煙葉去甲基煙堿含量依次增加，分別為0.97%、1.25%、1.78%，對應的煙堿轉化率分別為86.95%、90.86%、93.85%（圖3）。硃砂煙葉煙堿含量顯著低于云煙87，分別為0.15%、0.13%、0.12%（圖3）。目前已知CYP82E2基因家族的4個成員能夠編碼具有功能的煙堿去甲基酶基因，為明確硃砂2號高煙堿轉化率的原因，利用qPCR分析了鮮煙葉中上述基因的表達水平（圖4）。CYP82E21在云煙87和硃砂2號中均不表達，CYP82E5、CYP82E10表達水平在硃砂2號中更低。云煙87中CYP82E4不表達，但該基因在硃砂2號中高水平表達，可能是硃砂煙高煙堿轉化率的內在原因。

圖3 硃砂煙葉生物堿譜Fig. 3 Alkaloid profile of Zhusha tobacco leaves

注：誤差線代表6個生物學重復，*表示與對照云煙87相比差異有統計學意義（P<0.05）。

2.3 硃砂煙不同生育期CYP82E4基因表達模式及煙堿轉化率分析

為明確硃砂2號生長過程中CYP82E4基因表達水平變化及其導致的堿譜變化規律，采集團棵期、現蕾期、打頂后大田植株的中部煙葉進行分析（圖5）。各時期云煙87樣品中均未檢測到CYP82E4基因表達，但硃砂2號中CYP82E4基因隨著煙株生長發育水平逐步上升。云煙87中煙堿轉化率在不同生長時期無明顯差異，而硃砂2號煙堿轉化率在不同時期均顯著高于云煙87，且隨著生長發育逐步上升，與CYP82E4基因表達水平變化趨勢一致（圖5）。

圖5 全生育期CYP82E4基因表達模式及煙堿轉化率分析Fig. 5 The CYP82E4 expression pattern and NCR during different growth periods

2.4 硃砂煙遺傳穩定性分析

硃砂2號套袋自交收種后在漂浮盤播種，苗期隨機選擇單株進行CYP82E4基因表達水平分析及生物堿檢測（圖6）。云煙87葉片中無法檢測到CYP82E4基因表達，但所有硃砂2號樣品的CYP82E4基因高水平表達。相比之下，所有硃砂2號樣品的煙堿轉化率均遠高于云煙87。上述硃砂2號單株烤后煙葉均呈現明顯的硃砂特征，表明硃砂煙可以穩定遺傳。

圖6 CYP82E4基因表達水平及煙堿轉化率分析Fig. 6 Analysis of the CYP82E4 expression level and NCR

3 討論

栽培煙草中的去甲基煙堿含量通常低于總生物堿的5%，然而在白肋煙“轉化株”中，煙堿被大量轉化為去甲基煙堿，使后者比例可高達95%。通過比較“轉化株”和“非轉化株”葉片基因微矩陣[15]差異，發現CYP82E2基因家族基因表達存在差異。基于RNAi沉默CYP82E2基因家族基因和酵母異源表達實驗發現CYP82E4基因為煙堿轉化為去甲基煙堿的重要基因[12]。根據qPCR結果，栽培烤煙品種云煙87煙葉中CYP82E4基因表達水平極低，往往低于檢測限。相比之下，硃砂2號中CYP82E4基因被誘導表達，從而導致煙葉中煙堿大部分被轉化成去甲基煙堿。這與白肋煙中CYP82E4基因被誘導表達，導致“非轉化株”向“轉化株”轉化相似。

硃砂煙和白肋煙“轉化株”子代中CYP82E4基因仍保持高表達，表明該性狀能穩定遺傳，但烤煙和白肋煙中誘導CYP82E4基因高表達的機制尚不明確。據統計，烤煙品種自然條件下，自發突變產生硃砂煙的概率約為0.56%，遠低于白肋煙“轉化株”產生概率20%，這可能由烤煙和白肋煙基因組水平差異引起。Sanger測序表明普通烤煙、硃砂煙、白肋煙“轉化株”、白肋煙“非轉化株”的CYP82E4基因上游啟動子2000 bp區域堿基序列完全一致（數據未發表），可以推測CYP82E4基因誘導表達與啟動子DNA一級結構關聯不大。因此，推測與白肋煙“轉化株”形成相似，田間硃砂煙自發突變形成可能也受到表觀遺傳控制。CYP82E4基因誘導機理、白肋煙和烤煙中是否存在不同誘導機制需要進一步研究。

4 結論

硃砂煙基因及化學特征主要表現為煙堿去甲基酶基因CYP82E4被激活表達，導致去甲基煙堿成為主要生物堿，硃砂煙農藝性狀與對照相比無顯著差異，烤后煙葉硃砂紅性狀能夠穩定遺傳。