五個煙草野火菌株的生理小種鑒定

于爽，于洋,，喬嬋，楊鵬九，劉琳，潘洪杏，崔曉，劉德育，孫劍萍，萬秀清，郭兆奎，李若*

1 牡丹江師范學院生命科學與技術學院，牡丹江市愛民區文化街191號 157011；2 黑龍江省公司煙草科學研究所，哈爾濱市哈藥路17號 150076；3 中國煙草總公司黑龍江省公司科技處，哈爾濱市地段街173號 150010

煙草野火病（Tobacco Wildfire）是危害煙葉生產的主要細菌性病害之一。我國自上世紀四十年代有報道記錄以來，野火病已在國內所有煙區發生并逐步上升為主要病害之一[1]。野火病在煙草整個生育期均可發生，病菌侵染初始產生褐色水漬樣小圓點，周圍被寬的圓形黃色暈圈環繞。該黃色暈圈是病菌產生的野火毒素所致，此為野火病區別于煙草角斑病（Angular Leafspot of Tabacco）的主要特征。遇到陰雨連綿的適宜氣候條件，野火病斑迅速擴大融合，對煙葉產量和質量常造成重大損失。

野火病致病菌為野火菌（Pseudomonas syringaepv. tabaci，Pta），為丁香假單胞桿菌屬煙草致病變種。除侵染煙草外，人工接種還能侵染大豆、菜豆、番茄、辣椒、馬鈴薯、黃瓜、龍葵等植物。迄今為止，以長花煙和黃花煙為抗性鑒定宿主，野火菌至少存在4個生理小種，即0、1、2和3號生理小種[2-4]。其中，既不能侵染長花煙也不能侵染黃花煙但能侵染（不含任何抗野火基因的）普通栽培煙草的野火菌株歸為0號小種；能侵染長花煙但不能侵染黃花煙的歸為1號小種；能侵染包括長花煙、黃花煙等抗病煙草在內的所有已知煙草的歸為2號小種；能侵染黃花煙但不能侵染長花煙的歸為3號小種。

國際上，1955 年Heggestad等育成第一個抗野火菌0號小種的栽培品種 Burley21[5]。之后，Stavely和Skoog將黃花煙N. rustica pumila的0和1號野火菌小種抗性導入普通煙草[6]。雖然2號小種能克服已知所有煙草的野火病抗性，但煙草育種人員將長花煙和黃花煙來源的抗性聚合起來育成的品種則能減輕2號小種所產生病癥的嚴重程度[4]。目前，國內烤煙主栽品種均感野火病，不排除有個別中等抗性栽培品種，但也主要是水平抗性，未明確報道有長花煙或黃花煙垂直抗性來源。國內煙草植保、育種人員前期主要以生理生化試驗來鑒別野火菌[7]，以各煙區主栽品種作為鑒別宿主對野火菌進行生理小種劃分，在抗野火病抗性遺傳規律方面側重較少[8-9]。本研究首次在國內開展了基于抗病遺傳規律的煙草野火菌生理小種鑒定，為今后加快培育垂直抗性的抗野火病煙草和克隆煙草特異抗0號和1號小種抗病基因提供了重要基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

煙草材料黃花煙（寧安）（下文簡稱黃花煙）、長花煙、KRK26、Burley 21（B21）、Ky14、龍江911（LJ911）和Kutsaga E1（KE1）種子由黑龍江省煙草科學研究所高新技術室保存。其中，黃花煙為晾曬煙栽培種，KRK26為津巴布韋烤煙普通栽培品種（雄性不育雜交種），黃花煙和KRK26抗野火菌0和1號小種，KRK26抗性來源于黃花煙。長花煙為煙草野生種，B21為白肋煙普通栽培品種，長花煙和B21抗野火菌0號小種，B21抗性來源于長花煙。LJ911為黑龍江省自育主栽烤煙品種，KE1為津巴布韋烤煙普通栽培品種，LJ911和KE1均感野火菌各小種，作為感病對照品種。Ky14為白肋煙普通栽培品種，抗0號小種[10]。各煙草材料相關信息見表1。

表1 試驗所用煙草材料Tab. 1 Tobacco materials used in tests

煙草野火菌ATCC11528訂購自美國ATCC機構，作為0號小種標準對照[11]。野火菌株ZD、M109、D151和W11分別采集自黑龍江省肇東市、穆棱市、東寧市和寧安市。采集的菌株經涂板—挑選單克隆—菌落PCR鑒定等多輪循環純化至無雜菌[12]。煙草角斑菌217為黑龍江省煙草科學研究所高新技術室保存，作為菌種鑒定對照菌株。

1.2 方法

試驗采用黃花煙、長花煙等晾曬煙栽培種、野生種，以及B21、Ky14等白肋煙栽培種等開展接種試驗，煙草材料的異質性會使試驗結果均一性不高；又由于抗野火病煙草材料在接種高濃度、大劑量野火菌時因超敏反應（Hypersensitive Response，HR反應）產生的壞死斑與感病煙草上的野火病斑難于區分。本研究在田間及溫室分別設計了1個和3個接種試驗，力圖采用具有不同優點的多個試驗來交叉驗證野火菌的生理小種分類。

1.2.1 野火菌的PCR鑒定

以煙草角斑菌217為陰性對照，以野火菌ATCC11528為陽性對照，參照張萌等[12]方法對收集的野火菌株進行菌液PCR驗證，具體方法如下。取各野火菌株菌液10 μL，12000 r/min離心2 min，移去上清液后，菌體沉淀作為PCR擴增模板。煙草野火菌特異性鑒定PCR引物序列如下：上游引物：tabB1F：5’-ATTGAAGAAGCGTTCGAGCG-3’；下游引物：tabB1R：5’-GTTTCGGGTCGGCACGATTG-3’，擴增片段大小為709 bp。PCR反應體系加入Premix Ex Taq Hot Start Version 5 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1μL，用雙蒸水補足反應體系至10 μL并混勻。PCR反應條件為，95℃ 5 min；95℃ 40 s，58℃ 40 s，72℃ 1 min，72℃ 5 min，33個循環。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 野火菌田間生理鑒定

2020年在黑龍江省煙草科學研究所賓西實驗場大田種植了黃花煙、KRK26、長花煙、B21、Ky14、LJ911和KE1等7個煙草材料，每個材料種植20壟，每壟12株，株距0.5 m，行距1.15 m。對7個煙草材料接種了ATCC11528、ZD、D151、M109和W11等5個野火菌株。取出-80℃保存的野火菌株，在超凈工作臺中將野火菌液加入到500 mL LB液體培養基中，180 r/min，28℃震蕩培養過夜。接種前用蒸餾水稀釋至5 L，并加入表面活性劑Silwet L-77至終濃度0.01%。待煙草長至團棵期，用噴壺對田間煙草進行噴霧接種，每菌種接種2壟各煙草材料。兩周后拍攝記錄各煙草材料的病理表現，兩周后葉片上出現壞死斑點且圍繞寬的黃色暈圈的典型煙草野火病癥狀的即判定為感病。試驗重復2次。

1.2.3 煙草對野火菌接種濃度的病理反應

參照Knoche等[11]的試驗方法在溫室中進行野火菌接種濃度梯度試驗，具體方法如下。將ATCC11528等5個野火菌株用LB液體培養基28℃振蕩培養過夜，搖起的菌液5000 r/min離心10 min，菌體沉淀用PBS溶液重懸洗滌，再次離心沉淀，并用PBS溶液重懸，配制成濃度為0.1 OD（約108CFU/mL）的懸液。以此濃度為起始濃度，用PBS溶液依次5倍稀釋，制成12個濃度梯度。用1 mL規格注射器針頭在葉片上穿刺，在小孔處用一手按住葉片上表面，從葉片下表面注射入菌液。待煙草長至團棵期，將5個野火菌株12個濃度的菌液注射到黃花煙、KRK26、長花煙、B21、LJ911和KE1等6種煙草材料上。其中每個菌株接種每個煙草材料的4株煙，每株煙接種頂部完全展開的2片葉，每片葉片上接種6個濃度的菌液，各濃度的接種位置隨機。接種后1～10 d，每天觀察記錄葉片上出現的病斑數量。試驗重復2次。設定每個菌株菌液的最低一個濃度為基準C0，以菌液濃度的對數值（以5為底，起始濃度為0對應實際濃度為C0）為橫坐標、以時間（天數）為縱坐標，繪制不同煙草接種了不同菌株、不同濃度野火菌液后最早出現的病理反應時間與野火菌濃度的關系圖。

1.2.4 基于病斑大小的野火菌定量評價

參照Cole等[4]的試驗方法，稍作改動，在溫室中進行野火菌無損傷接種試驗，具體方法如下。ATCC11528等5個野火菌株28℃在LB液體培養基中振蕩培養過夜后，用PBS溶液洗滌后再用PBS溶液制備成濃度為106CFU/mL濃度的菌液，作為接種液備用。打開與噴槍（Hansa Aero-pro 251，0.2 mm nozzle）連接的真空泵，向噴槍液體槽中加入菌液。在葉片下表面，噴槍噴嘴距葉面1 cm左右，噴射葉面，菌液在葉片內擴展達到直徑約0.5 cm大小。待煙草長至團棵期，把5個野火菌株接種到黃花煙等6個煙草材料上。每菌種接種各煙草的2株煙，每株煙接種頂部完全展開的2片葉，每片葉接種4個點，在葉片上的接種位置隨機。接種10 d后，測量病斑直徑（測病斑兩條互相垂直的直徑，最終使用兩條直徑長度相乘再開平方值）。試驗重復2次。用SPSS軟件對數據進行統計分析。

1.2.5 同一片葉上的對比試驗

五個野火菌株接種液的制備同上節（接種液濃度為106CFU/mL），野火菌接種操作同1.2.3節（針刺結合無針頭注射）。待煙草長至團棵期，在溫室中將ATCC11528等5個野火菌株接種到黃花煙等6個煙草材料上，每個煙草材料接種2株煙，每株煙接種頂部完全展開的2片葉，每片葉上接種5個菌株。接種10 d后，拍攝記錄各煙草材料的病理反應。試驗重復2次。

2 結果

2.1 野火菌的PCR鑒定

如圖1所示，對收集的野火菌株進行PCR鑒定。PCR反應檢測靶標為煙草野火菌特有的野火毒素合成基因tabB基因，因為煙草角斑菌（Pseudomonas syringaepv. angulata，P. S. angulata）不能產生野火毒素，故用其作為陰性對照。如圖所示，包括陽性對照野火菌株ATCC11528在內的所有檢測野火菌株均能擴增出與預設片段大小709 bp一致的單一條帶。這表明所收集的菌株均為野火菌，這些菌株可用于后續接種試驗。

圖1 PCR鑒定野火菌Fig. 1 Identification of Pta using PCR

2.2 野火菌田間生理鑒定

表2總結了田間5個野火菌株在7種不同野火病抗性煙草上的病理反應，圖2展示了大田野火菌接種試驗的代表性圖片（未展示陰性結果）。如表2和圖2所示，所有5個野火菌株均能侵染感病對照煙草LJ911和KE1，2周后均能在它們的葉片上產生典型的野火病癥即點狀壞死斑且周圍環繞寬的黃色暈圈（如圖2“LJ911-D151”和“KE1-D151”兩小圖所示）。這表明整個試驗系統正常。野火菌D151能感染感病煙草LJ911和KE1，但既不能使長花煙抗性來源的B21感病，也不能使黃花煙和黃花煙抗性來源的KRK26感病，這表明D151屬于0號小種。ZD和M109既能感染感病野草，也能在B21上產生病斑（如圖2“B21-ZD”和“B21-M109”），但不能感染黃花煙和KRK26，因此將野火菌ZD和M109歸為1號小種。ATCC11528和W11既能感染感病野草，也能感染黃花煙和KRK26（如圖2“NR-W11”、“NR-11528”、“KRK26-W11”和“KRK26-11528”），因此把野火菌ATCC11528和W11歸為3號小種。這里，野火菌W11在黃花煙葉片上產生的野火病斑發生合并、蔓延，表明其具有比ATCC11528更強的侵染黃花煙的能力。另外，ATCC11528原本是作為0號小種標準對照從美國引進，但在本試驗中卻被判定為3號小種，與先前其他研究人員結果不一致[11]，而且后面的幾個試驗結果也把ATCC11528歸為3號小種，具體結果詳見下文。

圖2 野火菌大田接種試驗結果Fig. 2 Result of Field trial of Pta inoculation

表2 野火菌大田接種試驗結果Tab. 2 Result of field trial of Pta inoculation

2.3 煙草對野火菌接種濃度的病理反應

參照Knoche等[11]的試驗方法，在溫室中進行的野火菌接種濃度梯度試驗可以反應不同野火病抗性的煙草當接種不同濃度、不同小種野火菌株時所產生病理反應的差別。圖3展示了5個野火菌株在6個煙草材料上不同接種菌液濃度與發生病理反應時間（壞死斑）之間的關系。菌液濃度由100～108CFU/mL的12個梯度組成（對應關系圖中的菌液濃度對數值0，1，2，…，11），病害調查時間為10 d。每個野火菌-病理反應時間組合用4株煙，關系圖中顯示的數據點為首次出現病理反應的最低濃度梯度（1個以上濃度梯度同一天出現壞死斑，只顯示最低濃度梯度數據），對應的病理反應時間為4株煙的均值（平均反應時間）。

圖3 野火菌接種濃度與煙草病理反應時間的關系圖Fig. 3 Relationship of Pta inoculation concentration and pathological response time of tobacco plants

如圖4黃花煙和KRK26小圖，野火菌株ZD、D151、M109在菌液濃度對數值4（約103CFU/mL）以下的低濃度梯度時，接種黃花煙和KRK26不能使其感病，說明三者歸類為0號或1號生理小種。野火菌株ATCC11528和W11在低菌液濃度時仍可使黃花煙和KRK26感病，說明二者歸類為2號或3號生理小種。如圖4長花煙和B21小圖，野火菌株ATCC11528、D151、W11在菌液濃度對數值4以下的低濃度梯度時（對于長花煙濃度對數值則相應為8，約106CFU/mL），接種長花煙和B21不能使其感病，說明三者歸類為0號或3號生理小種。野火菌株ZD和M109在低菌液濃度時仍可使長花煙和B21感病，說明二者歸類為1號或2號生理小種。如圖4 LJ911和KE1小圖，5個野火菌株在所有濃度梯度均能感染兩種感病對照煙草。

綜上所述，依據各野火菌株在抗性鑒別宿主上的病理表現，將D151歸類為0號生理小種，ZD和M109為1號生理小種，ATCC11528和W11為3號生理小種。試驗發現，各煙草材料展現了不同抗性水平。其中，長花煙對野火菌0號小種D151和3號小種ATCC11528和W11展現了強的抑制作用，表現為3個野火菌株在高濃度梯度106CFU/mL（相當于對數濃度值8）以下時，已不能出現任何癥狀。B21的0號小種抗性來自長花煙，但其抗性弱于長花煙，表現在3個野火菌株在達到濃度梯度103CFU/mL（相當于對數濃度值4）以下時，才不表現病理癥狀。其中，試驗發現，黃花煙和KRK26表現出的對野火菌0號小種D151的抗性弱于長花煙，它們的抗性水平略高于B21。

2.4 基于病斑大小的野火菌定量評價

圖4統計了5個野火菌株接種在6個煙草材料上所產生病斑的大小。野火菌D151在黃花煙和KRK26上產生小病斑（<0.2 cm2），在長花煙和B21上則不產生病斑或小病斑，說明D151屬于0號小種。ZD和M109在黃花煙和KRK26上產生小病斑，在長花煙和B21上誘發大病斑，說明二者歸類為1號小種。野火菌ATCC11528和W11在黃花煙和KRK26上誘發大病斑，在長花煙和B21上則不產生病斑或小病斑，說明二者屬于3號生理小種。試驗中ATCC11528仍表現出對黃花煙和KRK26強的侵染性。

圖4 野火菌無損傷接種試驗結果Fig. 4 Result of non-invasive inoculation of Ptas

M109表現出對黃花煙和KRK26的侵染，這使它類于能侵染目前所有已知抗性煙草的2號小種。另外，W11雖未在長花煙上產生病斑，但在同一抗源的B21上產生較大病斑。綜合這些結果，參考上節濃度梯度試驗結果，原因是不同抗性材料抗性水品不同，而本試驗所用的接種濃度（106CFU/mL）偏高，也即對于長花煙這樣抗性強的煙草采用此濃度適合，將此接種濃度用在黃花煙、KRK26和B21上則偏高。

2.5 同一片葉上的對比試驗

如圖5，把5個相同濃度（106CFU/mL）的野火菌株接種到6個煙草材料的同一葉片上，對比不同野火菌株在同一煙草材料上的病理反應。在黃花煙上，5個菌株均造成了病斑，但ZD、D151和M109的病斑僅局限于接種區域內，而W11和ATCC11528的病斑則突破接種區域并蔓延擴大；在KRK26上，5個菌株均造成病斑，但W11產生的病斑則發生明顯蔓延擴大。這表明，野火菌W11和ATCC11528能克服黃花煙類抗源抗性，而ZD、D151和M109不能（盡管它們也造成病斑，可能是由接種濃度偏高造成，但壞死斑不發生擴散）。在長花煙和B21上，ATCC11528、D151和W11沒有產生病斑（3個菌株在B21上只在接種部位產生褪綠現象），說明三者不能侵染長花煙和B21；而ZD和M109則能在長花煙和B21上造成較大病斑，說明二者可以突破長花煙類抗源的抗性。5個菌株在LJ911和KE1等兩個感病對照煙草上均能產生典型野火病斑。綜合以上結果，可以判定，D151屬于野火菌0號生理小種，ZD和M109屬于1號小種，11528和W11屬于3號生理小種。本試驗結果與上述幾個抗性鑒定試驗一致。

圖5 野火菌接種對比試驗Fig. 5 Comparative test of Pta inoculation

綜合大田接種試驗和溫室接種試驗，四個試驗得到的5株野火菌生理小種分類情況基本一致，分類情況見表3。此處將ATCC11528歸類為3號小種的原因將在討論中具體論述。

表3 煙草野火菌生理小種分類Tab. 3 Race classification of Ptas

3 討論

3.1 野火菌接種方法

煙草野火病抗性鑒定存在接種方法和接種結果判定方面的困難。如在大田中采用噴霧方法接種野火菌，由于自然環境下紫外線強、溫濕度條件差，低濃度的菌液不易在煙草葉片上定殖就過早死亡。另外，在無傷口情況下野火菌只能通過葉面氣孔侵入，侵染效率低，發病時間長，需2周時間才能出現病癥。如在溫室中采用針刺法接種野火菌，則難于控制接種量，同時，抗病煙草在高接種量情況下所表現出的超敏反應形成的壞死斑與野火病斑難于區分，造成結果判定困難。

考慮到這些情況，設計多個具有不同優點的平行試驗，從多方面鑒定、驗證野火菌的生理小種分類。首先，大田接種試驗能模擬野火菌在自然條件下侵染煙草，也可避免損傷式接種（如注射）接種量過大的缺點。其次，接種濃度梯度試驗反映了不同小種野火菌在不同抗性煙草上病理反應出現的時間與其接種濃度的關系，是對具有不同特征生理小種的驗證試驗。同時，該試驗也有利于區分野火病斑和由超敏反應造成的壞死斑（由野火菌超敏反應產生的壞死斑常常表現為短時間內出現、壞死斑顏色發白且周圍黃色暈圈較小或沒有）：如果在高接種濃度梯度下（如對于長花煙106CFU/mL以上，對于B21 103CFU/mL以上）某野火菌株可以短時間內（1～2 d內）造成某煙草材料出現壞死斑，而在低濃度梯度下對該煙草材料長時間后卻不出現任何病理反應（見濃度梯度接種試驗），則能據此判定出現的壞死斑為超敏反應造成。無損傷接種試驗則是在不產生創口的情況下，實現對接種試驗所產生野火菌病斑大小的精確量化，是對大田試驗這樣的定性試驗及造成創口的注射接種試驗的較好補充。接種對比試驗是在同一煙草材料的同一片葉上接種所有野火菌株，以更清晰地呈現各野火菌株的差異。

3.2 試驗結果討論

首先試驗將收集的野火菌株用特異性分子標簽進行多輪純化，得到了純的野火菌株，排除了其他雜菌干擾，這是進行下面接種試驗的必要步驟（因為實驗室培養條件下，即使有極少雜菌，其增殖速度也比野火菌快得多）。四個平行接種試驗獲得的五株野火菌生理小種分類的結果基本一致，即把野火菌D151歸為0號小種，把ZD和M109歸為1號小種，把ATCC11528和W11歸為3號小種，試驗中未檢測到2號小種。綜合幾個實驗結果來看，同為1號小種的M109比ZD毒力強，表現在能以更低接種濃度、更短時間內使長花煙類抗源發病（濃度梯度試驗），同一接種濃度下使長花煙類抗源更早出現、出現更大的病斑（無損傷接種試驗及接種對比試驗）；同為3號小種的W11比ATCC11528毒力強，表現為能以更低接種濃度、更短時間內使黃花煙類抗源發病（濃度梯度試驗），同一接種濃度下使黃花煙類抗源更早出現、出現更大的病斑（無損傷接種試驗及接種對比試驗）。從接種用煙草材料來看，長花煙表現出了對0和3號小種強的抑制能力；B21的抗性由長花煙而來，但其抗性水平相對長花煙減弱不少（濃度梯度試驗及無損傷接種試驗）。黃花煙與KRK26對0和1號小種的抗性水平與B21對0和3號小種的抗性水平相當。

與先前的研究結果對比，試驗中發現原本引進作為0號小種對照的野火菌株ATCC11528[11]在多個試驗中均表現出了對黃花煙類抗源的侵染能力（盡管其毒力弱于W11），這使它在本研究中被歸為3號小種。這種情況類似3號小種的發現過程[4]，在本試驗中有可能再次發生。這一結果，也會在后續煙草野火菌基因組測序試驗中進一步驗證。與先前的研究結果對比，大田接種試驗中發現Ky14品種不抗野火菌任何小種，甚至比作為感病對照的LJ911和KE1病情更嚴重，這與先前研究中用其作為抗0號小種材料不一致[10]。與先前的研究結果對比[4]，本試驗由于采用了野生煙（長花煙）、黃花煙栽培種（黃花煙）、白肋煙普通栽培煙草（B21），使得試驗結果的勻質性受到影響，尤其表現在用同一接種濃度接種各煙草材料時，出現與其他幾個試驗結果不相一致的情況，如無損傷接種試驗中野火菌M109的表現。參考濃度梯度接種試驗結果，如用不同接種濃度接種不同煙草材料（但同一種煙草材料各野火菌株接種濃度相同），應能達到與其他幾個試驗相一致的試驗結果。這也同時提示，在以后做抗病基因功能驗證時，需要考慮到轉基因煙草抗性水平很有可能并不能達到其抗性來源一樣高的抗性的情況。

4 結論

由于目前國內尚未以國際通行的抗性鑒別宿主區分煙草野火菌生理小種，本文首次基于抗性遺傳規律對收集的野火菌株進行了生理小種鑒定。通過野火菌大田接種、濃度梯度接種、無損傷接種及同一葉片上的對比試驗等4個各具優勢的平行試驗，將收集的野火菌D151、ZD和M109、ATCC11528和W11分別鑒定為0、1、3等3個小種。這為下一步培育野火菌小種專化抗性煙草品種及克隆小種專化抗病基因提供了重要基礎。