基于“熵增驅動凝膠形成”理論的魔芋葡甘聚糖
——表沒食子兒茶素沒食子酸酯拓撲微凝膠的制備及其抗氧化性研究

王雅立， 龐 杰，顏吉強

（1.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002；2.福建農林大學計算機與信息學院，福建 福州 350002）

茶多酚是一種植物多酚，是綠茶中有效的天然抗氧化劑，作為一種抗氧化劑和品質保持劑（防腐劑）[1]，其價值已經被世界所公認。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）是茶多酚中清除自由基、抗氧化能力最強的一種，但有研究表明，其在強酸、強堿、光照和高熱條件下不穩定，而且在體內生物利用度也較低[1-2]，這些因素都限制了EGCG的推廣應用[3]。目前，以多糖微凝膠為載體的高分子-功能因子的軛合物體系在改善EGCG親水性、提高靶向性，以及增加生物利用度[3-5]方面都具有比較顯著的優越性。但真正進入生產應用的此類軛合物還是比較少，這是因為多糖凝膠體系形成缺乏有效控制，因而影響其力學性質。由于凝膠形成過程總是伴隨著系統熵的變化[6-7]。因此，通過一定條件下調控系統熵的變化，可以有效促進凝膠的形成，優化凝膠的力學性質。

魔芋葡甘聚糖（Konjac glucomman，KGM）是由葡萄糖和甘露糖以β-1,4糖苷鍵連接起來的高分子雜多糖，具有良好的生物兼容性和可降解性[8]。在一定條件下，KGM可形成拓撲結構，有利于提高活性物質的穩定性[9-10]。因此，嘗試運用試驗分析手段、計算機模擬和拓撲學分析相結合的方法，基于“熵增驅動凝膠形成”理論，以KGM為對象，促進KGM拓撲微凝膠的形成，制備功能化拓撲型KGM微凝膠并驗證其抗氧化性。以期為基于拓撲網絡的KGM功能凝膠的研究提供理論依據，也為綠茶的深加工和實用價值的提升提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魔芋精粉（KGM純度95%），廣西多環公司提供；纖維素酶，無錫酶試劑廠提供；表沒食子茶多酚沒食子酸酯（EGCG），成都生物制藥有限公司提供；DPPH，日本東京工業公司提供；KH2PO4、K2HPO4，國藥控股化學試劑有限公司提供。

1.2 KGM-EGCG微凝膠的制備

1.2.1 低分子量KGM的制備

精密稱取KGM（3 g），置于燒杯中，加入100 mL蒸餾水，使KGM在水中充分溶脹形成凝膠。以180 U/g的纖維素酶，在酶解后，在pH值6，溫度50℃下，酶解30 min，用80%乙醇做沉淀劑，不停攪拌，逐漸有白色絮狀沉淀產生，繼續加入乙醇溶液直至不再產生沉淀為止，用玻璃棒小心將白色沉淀轉移到燒杯中，用95%的乙醇洗滌2次，最后將此產品轉移到表面皿中，真空冷凍干燥得樣品。隨后超微粉碎過200目篩獲得KGM低聚物顆粒。

1.2.2 EGCG溶液的制備

稱取一定量的EGCG（0.2 g），溶解在100 mL水溶液中，在50℃條件下，充分混合即得EGCG溶液。

1.2.3 KGM-EGCG微凝膠的制備

稱取一定量的EGCG，溶解在100 mL一定濃度的低分子量KGM溶液中，在適宜溫度條件下，兩者混合后繼續以轉速600 r/min攪拌60 min，使KGM和EGCG兩者充分溶脹，得到微凝膠。使用冷凍干燥機進行凍干，12 h之后取出。過200目篩，得到微凝膠。

綜合考查試驗條件，共設計了3個單因素試驗，對EGCG/KGM微凝膠的制備進行考查，3個單因素分別為KGM質量分數（A）、EGCG/KGM質量比（B）和溫度（C），以微凝膠的包埋率為指標，得出每種因素對微凝膠包埋率的影響。包埋率的公式（1）[11]為：

采用溶劑對微凝膠表面進行清洗，并測量微凝膠外未包裹的EGCG。EGCG含量測量參照國家標準GB/T 8313—2018[12]，通過HPLC法進行測定。

（1）KGM質量分數的選擇。固定EGCG/KGM的質量比為1∶10，反應溫度為50℃，制備一定體積的KGM溶液，按照KGM溶液的質量分數比1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%來稱取KGM，并制備微凝膠，遴選最佳KGM質量分數。

（2）EGCG/KGM質量比的選擇。固定KGM質量分數為2%，反應溫度為50℃，按照EGCG與KGM質量分數比為1∶3，1∶5，1∶10，1∶15，1∶20來制備微凝膠，篩選出最佳的EGCG/KGM質量比。

（3）反應溫度的選擇。固體微凝膠的KGM質量分數為2%，EGCG/KGM質量比為1∶10，設定KGM溶液與壁材膠體混合時的反應溫度為40，45，50，55，60℃，并制備微凝膠，篩選出最佳反應溫度。

1.3 KGM-EGCG微凝膠的表征

1.3.1 掃描電子顯微鏡

在掃描電子顯微鏡下觀察KGM粉末、KGMEGCG微凝膠的表面形貌，最大加速電壓為15 kV。

1.3.2 紅外光譜掃描

充分碾碎KGM和KGM-EGCG并采用KBr粉末壓片，紅外光譜測定波長為4 000~400 nm，儀器分辨率0.5 nm，掃描次數為32/64。

1.4 KGM-EGCG微凝膠抗氧化性能力的測定

1.4.1 O2-·清除率的測定

O2-·清除率的測定參照參考文獻[13-15]的方法并作修改。將鄰苯三酚溶于10 mmol/L HCl中配制濃度為3 mmol/L的溶液。取pH值8.2的Tris-HCl緩沖液（濃度100 mmol/L）4.5 mL于25℃水浴保溫20 min，再加入鄰苯三酚1 mL（試驗前于25℃保溫），迅速搖勻并開始計時，每隔30 s于波長325 nm處測定吸光度A325，反應4.5 min后結束。計算公式（2）為：

式中：v空——KGM-EGCG微凝膠抑制鄰苯三酚自氧化的速率；

v樣——空白管中以蒸餾水作對照抑制鄰苯三酚自氧化的速率。

1.4.2 DPPH·清除率的測定

參照參考文獻[16-18]的方法，用95%乙醇溶液配制濃度為0.2 mmol/L的DPPH溶液。取2 mL DPPH溶液于試管中，在暗室下避光反應30 min后于波長517 nm處測定吸光度（As）。以95%乙醇溶液作為對照（Ac），空白對照以95%乙醇溶液代替DPPH溶液（Ab）。DPPH清除率按公式（3）計算：

1.5 計算機模擬方法

應用AutoDock Vina軟件對EGCG和PPO中的酪氨酸酶分子進行對接[4]。建立EGCG和酪氨酸酶分子坐標文件，確定EGCG和酪氨酸酶發生相互作用的格子參數條件。將準備好的EGCG和酪氨酸酶分子坐標文件和格子參數文件輸入對接程序，運行后給出配體分子對接的構象，分析預測能量。對配體分子進行相似構象聚類分析和配體分子構象進行可視化分析。

1.6 理論方法

根據玻爾茲曼的理論，一個系統的自由能與所有可能的能量有關。對于一種給定狀態的能量，其依賴于每個分子鏈與它周圍物質之間的交互作用[18]。KGM拓撲微凝膠的形成是一個拓撲分子鏈重新平衡的過程，過程中伴隨著能量變化和熵增。因此，依據熱力學理論，可以通過減少溶劑熵，增加溶質熵來促進“熵增驅動下的凝膠形成”。

2 結果與分析

2.1 EGCG與酪氨酸酶相互作用的計算機模擬分析

多酚氧化酶（PPO）廣泛存在于自然界中，在動植物組織中均可檢測到。在廣義上，多酚氧化酶可分為三類，廣泛分布于植物和微生物中，微生物中包括酪氨酸酶和漆酶。研究表明，EGCG對于酪氨酸酶有抑制作用，且抑制率會隨著濃度增大而提升[19]。為了分析EGCG與酪氨酸酶的相互作用，通過AutoDock Vina軟件對EGCG與酪氨酸酶的相互作用的分子對接進行分析。

2.1.1 疏水作用下的EGCG與酪氨酸酶分子對接

疏水作用下的EGCG與酪氨酸酶分子對接見圖1。

圖1 疏水作用下的EGCG與酪氨酸酶分子對接

圖1中的虛線為疏水鍵，根據模擬結果，酪氨酸酶分子結構復雜，在水中會以疏水軸為中心形成卷曲螺旋結構，進行蛋白質折疊，折疊過程中，酪氨酸酶傾向于將疏水基團埋藏在分子內部，將親水基團暴露在外部的現象。此時，系統呈現熵值增加的情況，由于分子鏈運動活躍，疏水作用進一步增強，使酪氨酸分子產生自我聚集現象，形成分子內部空間。而反應中EGCG通過疏水鍵向酪氨酸酶分子表面靠近，并通過疏水作用進入到酪氨酸的疏水空間中與酪氨酸酶分子鏈產生相互作用，體系整體熵值增加，并且熵增成為疏水作用的驅動力，促進EGCG與酪氨酸酶進一步結合，這結果符合“手套2手”的反應模式[20]。

2.1.2 EGCG與酪氨酸酶的分子結合

EGCG/酪氨酸酶分子結合的氫鍵見圖2。

圖2 EGCG/酪氨酸酶分子結合的氫鍵

圖2中的虛線為氫鍵，根據模擬結果，當EGCG進入酪氨酸酶的疏水內空間后，兩者之間通過多點氫鍵結合，形成緊密接觸，形成一定的空間網絡結構，從而減小酪氨酸酶的水力學半徑，使其產生一定的構象變化。氫鍵的形成有利于整體系統的穩定，降低系統能量。據此可得，隨著EGCG濃度增大，其對疏水作用的貢獻會增大，氫鍵連接數量會增多。兩者的結合過程中，分子間作用力增強，存在明顯的焓熵補償現象。

2.1.3 EGCG與酪氨酸酶結合的穩定性

EGCG與酪氨酸酶兩者結合會帶來體系構象的變化。可以通過運動學描述來考查結合前后2個狀態坐標的差異來評價分子結構變化的程度[4]。假定體系中所選粒子組有n個粒子，計算狀態的體系坐標為vi，參考狀態的體系坐標為wi，則粒子（組）的參考位置的偏差平均大小（RMSD）為：

EGCG/酪氨酸酶分子對接的能量見表1。

RMSD描述粒子（組）與參考位置的偏差平均大小，RMSD越小說明分子構象變化越小，體系越穩定[4]。由表1可知，通過多次模擬，在EGCG/酪氨酸酶最佳分子對接下，分子間作用力變化幅度較少，但系統的RMSD均較大。說明了熵增體系中，兩者結合分子鏈的動態變化多，粒子位移大，構象變化大，兩者對接體系不穩定。

表1 EGCG/酪氨酸酶分子對接的能量

2.1.4 最佳對接情況三級結構下的穩定性

最佳對接情況三級結構下的溫度因子圖見圖3。

圖3 最佳對接情況三級結構下的溫度因子圖

由圖3可知，藍色結構是柔性較小、比較穩定的部分，而紅色部分則是柔性較大，在模擬過程中不太穩定的部分。以此作為評價EGCG-酪氨酸酶系統的穩定性或選取功能設計部分的依據，可知分子對接中EGCG分子鏈不穩定性較高。EGCG分子鏈的斷裂會造成對接網絡體系構象和力學半徑的變化，因此保證EGCG構象的穩定性是調控對接體系穩定性的關鍵點。

2.2 溶質熵增下的KGM拓撲微凝膠的形成

根據玻爾茲曼的理論，一個系統的自由能與所有可能的能量有關。對于一種給定狀態的能量，其依賴于每個分子鏈與它周圍物質之間的交互作用[18]。應用熵的多粒子相關函數理論可以把溶液的熵及內能分成3個部分：①溶劑-溶劑相互作用“ss”；②溶質-溶劑相互作用“sp”；③溶質-溶質“pp”相互作用[18]。

整體能量可以表述為：

式中：z——給定格子空間內的配位數；

M——空間內的高分子鏈的數目；

φ——溶劑的體積分數。

當考慮高分子鏈為單個分子鏈時，可以得到相應的熵為：

當考慮高分子鏈而不是單個分子鏈時，高分子分子鏈數量為N時，可以得到相應的熵項為：

KGM凝膠的形成是其拓撲分子鏈結構重新平衡的過程，是個溶質-溶質相互作用起主導作用的能量變化的過程[21]，是一個包含熵增的過程；溶質-溶劑熵的存在有利于系統平衡；溶劑熵增大會提高凝膠的溶解度。結合以上數學公式，在環境條件不變的情況下，要促進KGM拓撲凝膠的形成，需要降低體系的溶劑熵并對分子鏈的長度進行調整。由公式（4）可知，在溫度、壓力等環境條件不變的情況下，KGM拓撲分子鏈只有獲得足夠的自由能和熵才能形成穩定的分子間纏結，從而達到新的拓撲結構穩態，因此需要減少溶劑熵[22]。KGM分子量大，分子鏈長，會減少構型，它們的熵減少為1/N。當高分子鏈非常長的時候，熵只包含溶劑的貢獻。因此，需要通過適當調控KGM分子鏈的長度。在試驗對KGM高分子進行水解，以提高溶質熵，并促進拓撲微凝膠的形成。

2.3 KGM-EGCG微凝膠制備

2.3.1 EGCG含量的篩選

參照國家標準GB/T 8313—2018[23]，制備供試品，按標準色譜條件檢測，進樣量為10.0μL，樣品進樣2次，測定EGCG含量。

EGCG色譜圖見圖4。

圖4 EGCG色譜圖

2.3.2 KGM質量分數的篩選

固定EGCG/KGM質量比及反應溫度，用5種KGM質量分數制備出微凝膠的包埋率。

KGM質量分數對KGM-EGCG微凝膠包埋率的影響見圖5。

圖5 KGM質量分數對KGM-EGCG微凝膠包埋率的影響

由圖5可知，微凝膠的包埋率隨著KGM質量分數的增加而上升，但當低分子量KGM質量分數到達2%之后包埋率上升趨于平緩。可能的原因是在質量分數大于2%之后，分子鏈的空間位阻增多，阻礙了EGCG進入KGM拓撲網絡，導致EGCG的包埋量并沒有隨著KGM的增加繼續增加，與增加量不呈正比。在KGM質量分數大于3%之后，溶液濃度太大，已無法攪拌，故選擇KGM質量分數為2%。

2.3.3 EGCG/KGM的質量比篩選

固定KGM濃度和反應溫度，用5種不同EGCG/KGM質量比制備微凝膠的包埋率。

EGCG/KGM質量比對KGM-EGCG微凝膠包埋率的影響見圖6。

圖6 EGCG/KGM質量比對KGM-EGCG微凝膠包埋率的影響

由圖6可知，微凝膠的包埋率先上升后下降，最高峰出現在EGCG/KGM質量比為1∶10處，所以質量比選擇為1∶10。結果分析，KGM濃度增大，分子鏈間作用力增大，分子鏈纏結增多，增大了空間位阻，從而阻礙了EGCG分子進入KGM拓撲網絡。

2.3.4 最適反應溫度的篩選

固定KGM質量分數和EGCG/KGM質量比之后，在5個反應溫度下制備微凝膠的包埋率。

溫度對KGM-EGCG微凝膠包埋率的影響見圖7。

由圖7可知，微凝膠的包埋率隨著溫度的增加而增加，在50℃之后升高的速度減慢。因為隨著溫度升高體系能量增加，出現熵增情況，KGM拓撲分子鏈運動加劇，分子鏈之間形成有序的空間拓撲網絡結構，可以較好地包埋并保護EGCG分子，但是溫度過高會造成EGCG分子的不穩定和分解，從而降低了包埋率，所以選用50℃為反應溫度。

圖7 溫度對KGM-EGCG微凝膠包埋率的影響

2.4 KGM-EGCG微凝膠的表征

2.4.1 掃描電子顯微鏡譜圖分析

KGM粉末（a）和KGM-EGCG微凝膠（b）掃描電鏡圖見圖8。

圖8 KGM粉末（a）和KGM-EGCG微凝膠（b）掃描電鏡圖

由圖8（a）可知，圖KGM在粉末狀態下，外表呈現規則的微纖維狀，表明KGM分子量很大，長分子鏈以列向形態排列，長鏈之間以氫鍵相互作用，形成凝聚纏結為主的微觀構。

由圖8（b）可知，降解后KGM長分子鏈仍然存在，由于分子量降低，部分長分子鏈被降解為小分子鏈，空間位阻減小，有利于KGM-EGCG分子鏈之間形成非共價相互作用。KGM表面的羥基與水形成剛性結構，內部形成疏水空腔或間隙，接著通過疏水相互作用驅使EGCG進入空腔或間隙，并且形成分子鏈間氫鍵增強其結合效果，其結果導致微凝膠體系內部形成不同的微觀結構形態。調節控制下的KGM-EGCG的混合使得體系混合過程勻化，避免了局部過度纏結，避免分子鏈混亂纏結的發生，使得網絡體系形成有序的分子間拓撲纏結網絡體系。

2.4.2 紅外光譜譜圖分析

KGM和KGM-EGCG微凝膠的紅外光譜圖見圖9。

由圖9可知，相較于KGM凝膠，KGM-EGCG微凝膠在波數3 435 cm-1處（-OH的吸收峰）的吸收峰減弱，表明KGM-EGCG微凝膠中有更多氫鍵的形成。同時，KGM-EGCG微凝膠在波數2 928 cm-1出現了一個明顯的吸收峰，這是甲基中C-H的吸收峰，證明了KGM-EGCG微凝膠中，KGM與EGCG分子鏈之間形成拓撲纏結，與電鏡測定結果相一致。

圖9 KGM和KGM-EGCG微凝膠的紅外光譜圖

2.4.3 KGM-EGCG微凝膠抗氧化能力分析

（1）O2-·清除率分析。

不同濃度下EGCG與KGM-EGCG對于O2-·清除率對比測定見圖10。

圖10 不同濃度下EGCG與KGM-EGCG對于O2-·清除率對比測定

O2-·清除率是物質抗氧化能力指標之一，O2-·清除率越強表示物質的抗氧化能力越強。由圖10可知，以KGM微凝膠為載體的EGCG對于O2-·清除率隨著質量濃度增大而增大，與EGCG溶液表現出等同的清除能力。

（2）DPPH·清除率分析。

不同質量濃度下EGCG與KGM-EGCG對于DPPH·清除率對比測定見圖11。

DPPH·清除率也是物質抗氧化活性能力的表征之一，DPPH·清除能力越大，表明物質的抗氧化活性越強。由圖11可知，EGCG和KGM-EGCG兩者都隨質量濃度的增大而增強DPPH·清除率。當質量濃度為25 mg/mL時，KGM-EGCG微凝膠的DPPH清除率達到了93%。

圖11 不同質量濃度下EGCG與KGM-EGCG對于DPPH·清除率對比測定

3 結論

微凝膠和相應的宏觀凝膠具有相同的化學組成和熱力學性質，但是微凝膠對環境引發的溶脹和分子結合的變化反應更加迅速，使其能夠在受控和限制的條件下得到更好的應用[6，24]。而且微凝膠能夠將化學官能團對于高分子整體結構的適應性、滲透性和變形性結合起來，以獨特的方式將膠體聚合物和表面活性劑結合起來[25-26]。

在大多數情況下，凝膠網絡中的連接是局部化的，是短距離相互作用的結果，但是在短距離的連接的基礎上，長鏈會連接并形成宏觀的網絡。因此，大多數凝膠的分子網絡結構形成是通過分子鏈在有限空間內的擴展連接局部連接來實現的。KGM作為高分子長鏈物質，在可逆凝膠形成以下2種途徑：①通過自身連接組裝形成長鏈來組裝形成宏觀的網絡，如KGM單體凝膠；②通過與其他物質的分子鏈互相穿插交聯形成網絡結構，如KGM與卡拉膠、黃原膠、蛋白質等物質的復配，在協同作用下形成機械強度較好的凝膠。研究表明，復配凝膠的特點是分子間的疏水相互作用、氫鍵和靜電相互作用力增強，復配膠體的膠束緊密纏繞鏈接。

通過分子模擬研究了EGCG和酪氨酸酶的分子結合，明確了兩者結合是在熵焓補償現象下，通過疏水作用進行分子鏈間的相互作用，并通過氫鍵增強結合效果，但是EGCG在與酪氨酸酶結合過程中表現出不穩定性，需要加以調控。以微凝膠為載體，實現EGCG的有效承載和釋放是一個有效的調控途徑。研究中根據熵增驅動拓撲KGM凝膠形成理論，通過酶降解KGM，降低分子量，降解部分長分子鏈為短鏈，減少網絡體系的空間位阻，增加分子鏈內部纏結的空間，并形成有效的拓撲纏結，來調控KGM有序拓撲網絡結構的形成，從而促進KGM-EGCG微凝膠的形成。

KGM-EGCG微凝膠制備過程中，沒有使用改性劑和催化劑，沒有引入毒性基團，不會對樣品造成二次污染，通過合理調控，使之產生有序的拓撲網絡結構，并保留了KGM的生物活性，從而產生較好的控釋效果。試驗結果為KGM功能凝膠用于對活性成分的保護的研究提供理論依據和有益補充，也為綠茶的深加工和實用價值的提升提供參考。