非小細胞肺癌中IGF1、IGFBP2表達與預后的相關性分析

閆明 程紀偉 孫海波 鄭燕 邢文群

肺癌是一種源于支氣管黏膜的高度惡性腫瘤，80%左右的肺癌患者為非小細胞肺癌，其早期癥狀不典型，多數患者確診時已為晚期[1-2]。盡管目前肺癌治療方法不斷進步，更加個體化和多樣化，但其療效和預后仍不理想，嚴重威脅患者的生命健康[3]。尋找與非小細胞肺癌發生發展及預后相關的分子標記物，可能對預后改善有重要意義。胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)可通過與其受體特異性結合，參與腫瘤細胞分化[4]。胰島素樣生長因子結合蛋白2(IGF binding protein 2，IGFBP2)是一種潛在的腫瘤相關抗原，在多種人類惡性腫瘤患者中均存在表達異常[5-6]。本研究通過免疫組織化學法檢測非小細胞肺癌組織IGF1、IGFBP2蛋白表達，探討二者與非小細胞肺癌臨床病理特征及預后的關系，以期為非小細胞肺癌治療提供新靶點。

資料與方法

一、一般資料

選取2015年2月～2016年2月于本院就診且經胸部影像學及組織病理學等確診的226例非小細胞肺癌患者癌組織為非小細胞肺癌組，患者年齡49～76歲，平均年齡(60.48±9.26)歲，男136例(60.18%)，女90例(39.82%)；選取其癌旁正常組織為癌旁對照組。

納入標準：①非小細胞肺癌患者符合診療規范[7]；②術前未接受過放療、化療等輔助治療；③病歷資料齊全；④患者年齡>18歲，符合倫理學標準，且所有受試者均自愿參加，同時簽署知情同意書。排除標準：①有嚴重肝功能異常、其他感染性疾病或腎功能異常者；②有精神障礙或認知功能障礙者；③伴有其他惡性腫瘤或有惡性腫瘤史者；④孕婦或哺乳期婦女。

二、主要試劑與儀器

IGFBP2抗體(貨號：bs-1108R)購自上海科敏生物科技有限公司；IGF1抗體(貨號：SPC-699D)購自加拿大StressMarq公司；通用型免疫組化試劑盒(貨號：ZK-SP10449)購自深圳子科生物科技有限公司。

三、研究方法

1 一般資料收集 收集整理非小細胞肺癌患者一般資料，主要包括性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、腫瘤位置、淋巴結轉移、組織分化程度、TNM分期。

2 治療方案 所有患者術后1周內接受化療，21 d為一個周期，共4個周期。化療方案分別為：吉西他濱+奈達鉑、吉西他濱+奧沙利鉑、培美曲塞+奈達鉑、多西他賽+奈達鉑、多西他賽+順鉑。患者均未接受抗血管生成、放療及靶向藥物治療。

3 IGF1、IGFBP2蛋白表達檢測 采集非小細胞肺癌患者術中癌組織及癌旁正常組織，10%甲醛固定標本后，進行梯度脫水、透明、浸蠟、包埋及切片(厚度4 μm)。用免疫組織化學法檢測癌組織及癌旁正常組織IGF1、IGFBP2蛋白表達水平。按照通用型免疫組化試劑盒說明書中操作步驟進行操作，用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性的肺組織切片作陽性對照。隨機選10個視野于200倍鏡下進行觀察，計數100個細胞，以胞漿內出現棕黃色或棕褐色定義為陽性細胞，采用半定量法進行評分。按染色強度計分：棕褐色、棕黃色、淺黃色、無色分別為3分、2分、1分、0分；按陽性細胞比例計分：陽性細胞比例1/3以下、1/3～2/3、2/3以上分別為1分、2分、3分。根據二者計分乘積為最終得分進行判定，判定標準為：≤2分為低表達，>2分為高表達。

4 隨訪 采用電話、門診或入戶方式隨訪5年，平均術后第1年每月1次，術后第2年每3個月1次，2年后每半年1次。其生存期從手術之日起計算，隨訪時間截至2021年2月。

四、統計學分析

采用SPSS 23.0統計分析數據，計數資料以例數(n)或百分率(%)表示，組間比較行Pearson卡方檢驗；采用Spearman法分析非小細胞肺癌患者癌組織IGF1與IGFBP2蛋白表達的相關性；采用Kaplan-Meier法分析非小細胞肺癌患者癌組織IGF1、IGFBP2蛋白表達與預后的關系，用Log-rank進行生存曲線顯著性檢驗，檢驗水準為α=0.05；采用多因素COX回歸分析影響非小細胞肺癌患者預后的因素。P<0.05代表差異有統計學意義。

結 果

一、非小細胞肺癌組和癌旁對照組IGF1、IGFBP2蛋白表達水平比較

非小細胞肺癌組IGF1、IGFBP2蛋白高表達率高于癌旁對照組，差異有統計學意義(P<0.05)(見表1、圖1)。

表1 非小細胞肺癌組和癌旁對照組IGF1、IGFBP2蛋白表達水平比較[n(%)]

圖1 非小細胞肺癌組和癌旁對照組IGF1、IGFBP2蛋白表達情況(免疫組化，×200)(A：癌旁對照組IGF1蛋白低表達；B：非小細胞肺癌組IGF1蛋白高表達；C：癌旁對照組IGFBP2蛋白低表達；D：非小細胞肺癌組IGFBP2蛋白高表達)

二、非小細胞肺癌患者癌組織IGF1、IGFBP2蛋白表達與臨床病理特征的關系

根據非小細胞肺癌患者癌組織中IGF1、IGFBP2蛋白是否高表達，將患者分為IGF1低表達組60例、IGF1高表達組166例；IGFBP2低表達組69例、IGFBP2高表達組157例。結果顯示，非小細胞肺癌患者癌組織IGF1、IGFBP2蛋白表達與性別、年齡、吸煙史、腫瘤位置無關(P>0.05)，與腫瘤大小、淋巴結轉移、組織分化程度、TNM分期有關(P<0.05)(見表2)。

表2 非小細胞肺癌患者癌組織IGF1、IGFBP2蛋白表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

三、非小細胞肺癌患者癌組織IGF1與IGFBP2蛋白表達的相關性

Spearman分析結果顯示，非小細胞肺癌患者癌組織IGF1與IGFBP2蛋白表達呈正相關(r=0.472，P<0.05)(見表3)。

表3 非小細胞肺癌患者癌組織IGF1與IGFBP2蛋白表達的相關性(n)

四、非小細胞肺癌患者癌組織IGF1、IGFBP2蛋白表達與預后的關系

采用Kaplan-Meier法分析非小細胞肺癌患者癌組織IGF1、IGFBP2蛋白表達與患者生存率的關系，結果顯示IGF1高表達患者五年生存率(33.33%)低于IGF1低表達患者五年生存率(69.23%)，差異有統計學意義(P<0.05，χ2=10.051)；IGFBP2高表達患者五年生存率(29.41%)低于IGFBP2低表達患者五年生存率(73.33%)，差異有統計學意義(P<0.05，χ2=16.397)(見圖2、圖3)。

圖2 非小細胞肺癌患者癌組織IGF1蛋白表達與預后的關系

圖3 非小細胞肺癌患者癌組織IGFBP2蛋白表達與預后的關系

五、影響非小細胞肺癌患者預后的多因素COX回歸分析

以非小細胞肺癌患者是否發生死亡(是=1，否=0)為因變量，以IGF1(高表達=1，低表達=0)、IGFBP2(高表達=1，低表達=0)、腫瘤大小(≥3.0 cm=1，<3.0 cm=0)、淋巴結轉移(有=1，無=0)、組織分化程度(低分化=1，中/高分化=0)、TNM分期(Ⅲ～Ⅳ期=1，I～Ⅱ期=0)為自變量進行多因素COX回歸分析，結果顯示，IGF1高表達、IGFBP2高表達、TNM Ⅲ～Ⅳ期是影響非小細胞肺癌患者死亡的獨立危險因素(P<0.05)(見表4)。

表4 影響非小細胞肺癌患者預后的多因素COX回歸分析

討 論

非小細胞肺癌是肺癌中常見的組織類型，其具體的分子機制尚未完全闡明，是由多基因參與的復雜過程，其中細胞周期紊亂是引發非小細胞肺癌的重要因素[8]。正常細胞周期受內外信號的調控，以維持其正常的細胞增殖、凋亡，然而癌細胞為非正常凋亡機制，可避免程序性死亡[9]。IGF作為調節細胞分裂的重要因子，在細胞增殖、凋亡及分化中起重要作用，其功能障礙或失調會對機體生長發育及組織穩態產生嚴重的影響，均可能與腫瘤的發生發展有關[10-11]。

IGF1是IGF家族的一員，主要作為一種生長激素在幾乎所有細胞中發揮生物學效應，可通過調控癌細胞對內皮的粘附性以及血管生成，影響腫瘤侵襲能力[12]。此外IGF1也可通過誘導細胞內癌基因的表達，啟動細胞增殖分裂、抑制細胞凋亡[13]。IGFBP2可通過調節IGF的量，來影響IGF系統，增強IGF參與代謝及有絲分裂等方面的作用，進而影響腫瘤生長[14]。IGFBP2也可不經過IGF系統影響腫瘤細胞，其主要通過促進或抑制某些腫瘤相關因子的表達水平，影響腫瘤細胞遷移、侵襲和凋亡[15]。本研究結果顯示，非小細胞肺癌患者癌組織IGF1、IGFBP2蛋白高表達率高于癌旁正常組織，且非小細胞肺癌患者癌組織中二者表達呈正相關。孫宇等[16]研究結果中，IGF1在肺鱗癌患者癌組織中呈高表達，Wang等[17]研究結果顯示非小細胞肺癌患者癌組織中IGFBP2表達上調，與本研究IGF1、IGFBP2表達趨勢一致。提示IGF1、IGFBP2可能通過高表達，影響非小細胞肺癌的發生發展。進一步分析癌組織IGF1、IGFBP2表達與臨床病理特征及預后的關系發現，IGF1、IGFBP2與非小細胞肺癌患者性別、年齡、吸煙史、腫瘤位置無關，而與腫瘤大小、淋巴結轉移、組織分化程度、TNM分期有關，且IGF1、IGFBP2高表達患者5年生存率較低。提示IGF1、IGFBP2可能與非小細胞肺癌的遷移、侵襲等行為密切相關，高水平的IGF1、IGFBP2可能會增加細胞內有絲分裂信號傳導、增加細胞內DNA損傷，從而增加惡性轉化的發生，加速患者病情發展，不利于患者預后。然而陶紹能等[18]研究中IGF1與淋巴結轉移等無關，造成此結果的差異可能與選取樣本量有關，仍需進一步驗證。此外，本研究采用多因素COX回歸分析影響非小細胞肺癌患者預后的因素，結果顯示，IGF1、IGFBP2均是影響患者死亡的獨立危險因素。提示臨床工作中可對IGF1、IGFBP2表達水平給予密切關注，以便及時調整患者治療方案，改善不良預后。

綜上所述，IGF1、IGFBP2高表達與非小細胞肺癌發生發展及預后密切相關，可為化療方案的確定、提高患者診療效果提供新思路，同時對IGF的研究可能為今后尋找新的腫瘤標記物和治療靶點起到積極的推動作用。然而本研究同時存在一定的不足之處，IGF1、IGFBP2蛋白表達可能與腫瘤類型、患者機體狀態等多方面因素有關，有待今后納入更多樣本，進行多層次、多中心的研究來進一步證實。