中期因子調(diào)控巨噬細(xì)胞活化在腎間質(zhì)纖維化中的作用

羅鋼，祝雪妍，朱迪

（1.遼寧省婦幼保健院兒科，沈陽(yáng) 110005；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，沈陽(yáng) 110001）

慢性腎臟病是不可逆的腎組織損傷性疾病，腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是慢性腎臟病的主要病理特點(diǎn)。盡管有藥物用于治療RIF，但大多數(shù)患者的療效并不理想。RIF的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，目前尚無(wú)有效的治療策略［1］。因此，研究RIF及其相關(guān)機(jī)制，可為防治RIF、阻止慢性腎臟病進(jìn)展提供策略。單側(cè)輸尿管結(jié)扎（unilateral ureteral obstruction，UUO）是常用的建立研究腎臟炎癥反應(yīng)和瘢痕形成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的方法，通過(guò)UUO可建立RIF模型。慢性炎癥反應(yīng)在RIF中發(fā)揮關(guān)鍵作用，巨噬細(xì)胞可釋放多種促炎性細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1b和IL-6等，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與RIF的病理形成過(guò)程［2］。中期因子（midkine，MK）是一種肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、分化和遷移等功能［3］。最新研究［4］結(jié)果顯示，MK具有多種免疫調(diào)節(jié)作用，與多種炎癥疾病密切相關(guān)。本研究通過(guò)UUO建立小鼠RIF模型，觀察MK參與RIF的形成及其相關(guān)機(jī)制，為RIF的防治提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)雄性小鼠24只（北京維通利華科技公司），飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g。小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；流式抗體、抗CD206同型對(duì)照、F4/80、CD11b、CD86抗體（美國(guó)Biolegend公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)R&D公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備和分組：將24只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為假手術(shù)（0 d）組、UUO 7 d組、UUO 14 d組，每組8只。0周時(shí)，小鼠以10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉，固定于手術(shù)臺(tái)上，腹部備毛，正中左側(cè)旁切口，打開(kāi)腹腔，暴露左腎，游離輸尿管。UUO組小鼠在輸尿管中間1/3處以4.0絲線結(jié)扎，中間離斷關(guān)腹。假手術(shù)組小鼠僅游離左側(cè)輸尿管，不進(jìn)行結(jié)扎。將小鼠放入飼養(yǎng)籠內(nèi)等待蘇醒，自由飲食。術(shù)后7 d處死8只小鼠，術(shù)后14 d處死余下8只小鼠，留取手術(shù)側(cè)腎組織用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2.2 Masson染色：取小鼠手術(shù)側(cè)腎組織固定48 h，脫水，透明，包埋，切片后烘干。染色前，切片脫蠟，梯度乙醇脫水，放入Masson復(fù)合染液5 min，醋酸洗液洗片，磷鎢酸染色8 min，醋酸洗液再次洗片，甲苯胺藍(lán)染色3 min，醋酸洗液沖洗，經(jīng)乙醇脫水、透明后封片。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)：分離小鼠腎組織，經(jīng)膠原酶、透明質(zhì)酸酶和DNANaseⅠ消化處理后，利用Percoll密度梯度離心法收集組織中的單個(gè)核細(xì)胞，4 ℃、1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入各種流式抗體，避光常溫孵育15 min，加0.5 mL PBS洗滌后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)mRNA表達(dá)：常規(guī)培養(yǎng)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2.5×105/mL。鋪于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，使用無(wú)血清 DMEM饑餓培養(yǎng)30 min后添加1 μg/mL脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），同時(shí)分別添加不同濃度的MK（10、50、100 ng/mL），即分為4組：LPS組、LPS+10 ng/mL MK組、LPS+50 ng/mL MK組、LPS+100 ng/mL MK組。加入MK阻斷劑——MK反義寡脫氧核糖核苷酸（oligodeoxyribonucleotide，ODN），阻斷MK表達(dá)。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。收集上述處理細(xì)胞，用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用Prismcript cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)Gen-Bank的基因序列設(shè)計(jì)PCR引物。引物序列IL-1b，正義，5’-CCTGCAGCTGGAGAGTGTG-3’，反義，5’-TG TGCTCTGCTTGTGAGGTGC-3’；IL-6，正義，5’-AGT TGCCTTCTTGGGACTGA-3’，反義，5’-TCCACGATT TCCCAGAGAAC-3’；IL-4，正義，5’-TGGGTCTCAAC CCCCAGCT-3’，反 義，5’-TGCATGGCGTCCCTTCTC CTGT-3’；Arg-1，正義，5’-TTAGGCCAAGGTGCTTG CT-3’，反義，5’-TACCATGGCCCTGAGGAGGTTC-3’。檢測(cè)IL-1b、IL-6、IL-4、Arg-1mRNA表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參照。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃預(yù)變性15 s；63 ℃退火60 s，共40個(gè)循環(huán)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。以2-△△Ct值計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Graphpad Prism8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用表示，采用方差分析或兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MK在小鼠腎組織中的表達(dá)水平

Masson染色結(jié)果（圖1）顯示，與假手術(shù)組相比，UUO 7 d組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)紊亂，部分腎小球皺縮深染，腎間質(zhì)區(qū)出現(xiàn)膠原蛋白沉積（呈藍(lán)色）；UUO 14 d組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)損傷較UUO 7 d組明顯加重，腎小球和腎小管皺縮加重，腎間質(zhì)區(qū)有大量膠原蛋白沉積（圖1）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果（圖2）顯示，假手術(shù)組小鼠腎組織MKmRNA的表達(dá)水平較低（P＜ 0.05），UUO 7 d組和UUO 14 d組小鼠腎組織MKmRNA的表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組（P＜ 0.05）。

圖1 腎組織Masson 染色 ×400Fig.1 Masson staining of the renal tissues ×400

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腎組織MK mRNA表達(dá)水平Fig.2 Expression of MK mRNA in renal tissues detected using real time-polymerase chain reaction

2.2 小鼠腎組織中巨噬細(xì)胞數(shù)量和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果（圖3）顯示，假手術(shù)組小鼠腎組織中CD11b+F4/80+巨噬細(xì)胞數(shù)量較低；隨時(shí)間延長(zhǎng)，UUO 7 d組和UUO 14 d 組小鼠腎組織中CD11b+F4/80+巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯高于假手術(shù)組（P＜ 0.05）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果（圖4）顯示，雖然UUO組小鼠腎組織中IL-4mRNA表達(dá)水平有升高趨勢(shì)，但UUO 7 d組和UUO 14 d組與假手術(shù)組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05）；UUO組小鼠腎組織中IL-1b、IL-6、Arg-1mRNA表達(dá)水平顯著升高，UUO 7 d組和UUO 14 d組明顯高于假手術(shù)組（P＜ 0.05），且隨時(shí)間延長(zhǎng)，IL-1b、IL-6、Arg-1mRNA的表達(dá)水平逐漸升高，UUO 14 d組明顯高于UUO 7 d組（P＜ 0.05）。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析腎組織中巨噬細(xì)胞的比例Fig.3 Proportion of macrophages in the renal tissue analyzed using flow cytometry

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腎組織巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)水平Fig.4 Expression of cytokines in the renal tissue macrophages detected using real time-polymerase chain reaction

2.3 MK對(duì)巨噬細(xì)胞活化的影響

應(yīng)用MK處理RAW264.7巨噬細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子IL-1b、IL-6、IL-4、Arg-1mRNA的表達(dá)水平。與LPS組比較，MK作用呈劑量依賴性方式增強(qiáng)，分別用10、50、100 ng/mL MK處理巨噬細(xì)胞，可見(jiàn)RAW264.7巨噬細(xì)胞中IL-6mRNA的表達(dá)水平升高，但未見(jiàn)IL-1b、IL-4、Arg-1mRNA表達(dá)水平升高（圖5）。應(yīng)用MK反義ODN處理后，可顯著降低RAW264.7巨噬細(xì)胞IL-6mRNA的表達(dá)水平（P＜ 0.05），見(jiàn)圖6。

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MK刺激后的巨噬細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平Fig.5 Expression of cytokines in the macrophages stimulated by MK detected using real time-polymerase chain reaction

圖6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MK反義ODN阻斷MK表達(dá)后巨噬細(xì)胞中IL-6 mRNA的表達(dá)水平Fig.6 Expression of IL-6 mRNA in macrophages blocked by MK antisense oligodeoxyribonucleotide detected using real time-polymerase chain reaction

3 討論

RIF是慢性腎臟病的主要病理特點(diǎn)，反復(fù)或持續(xù)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致組織修復(fù)不良是導(dǎo)致RIF的主要原因［5］。本研究通過(guò)UUO建立小鼠RIF模型，發(fā)現(xiàn)MK通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞活化參與RIF過(guò)程。體外阻斷MK可顯著抑制巨噬細(xì)胞活化，提示MK可能是引起巨噬細(xì)胞活化、參與腎纖維化的關(guān)鍵調(diào)控因子。

RIF與腎組織中多種組織細(xì)胞的異常活化密切相關(guān)。腎小管上皮細(xì)胞是腎臟中含量最豐富的細(xì)胞，在腎臟損傷、修復(fù)以及纖維化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究［6］顯示，在急性炎癥條件下，腎小管上皮細(xì)胞可通過(guò)去分化增殖再分化修復(fù)腎小管；而在持續(xù)的慢性感染刺激下，腎小管上皮細(xì)胞不僅可以上調(diào)表達(dá)促纖維化因子，促進(jìn)RIF的形成，還可經(jīng)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞。另外，在持續(xù)炎癥條件下，腎臟成纖維細(xì)胞也可轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。肌成纖維細(xì)胞通過(guò)合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原蛋白和纖維，在腎臟瘢痕化和萎縮過(guò)程中發(fā)揮重要作用［7］。本研究顯示，RIF小鼠腎組織結(jié)構(gòu)紊亂，腎小球和腎小管均發(fā)生病理形態(tài)改變。特別是腎間質(zhì)中膠原蛋白沉積呈進(jìn)行性增加，提示腎間質(zhì)的肌成纖維細(xì)胞高度活化，是導(dǎo)致RIF的主要原因。

MK是肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，在細(xì)胞的發(fā)育分化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究［4］發(fā)現(xiàn)，MK可作為重要的免疫調(diào)節(jié)因子，廣泛參與免疫系統(tǒng)的生物學(xué)功能，如促進(jìn)淋巴細(xì)胞存活，調(diào)控固有免疫細(xì)胞活化和功能，以及維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)。最近的研究［8］證明，MK通過(guò)促進(jìn)T細(xì)胞活化，參與腎臟炎癥反應(yīng)以及組織損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，RIF小鼠腎組織中MK水平呈進(jìn)行性上調(diào)，提示MK與RIF過(guò)程密切相關(guān)，MK的細(xì)胞來(lái)源以及產(chǎn)生特點(diǎn)需要深入探討。

巨噬細(xì)胞是組織定居的固有免疫細(xì)胞，在介導(dǎo)組織炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。持續(xù)活化的巨噬細(xì)胞可分泌多種炎性介質(zhì)，誘導(dǎo)組織炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷。巨噬細(xì)胞在不同的微環(huán)境因子刺激下可分化為具有不同功能的巨噬細(xì)胞亞群：經(jīng)典活化的M1型細(xì)胞可分泌炎性細(xì)胞因子IL-1、IL-6和腫瘤壞死因子-α等，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和吞噬功能；而替代途徑活化的M2型細(xì)胞則分泌IL-4、Arg-1和基質(zhì)金屬蛋白酶9等，具有抑制免疫應(yīng)答、促進(jìn)血管新生和組織修復(fù)等作用［9］。極化的M1型和M2型巨噬細(xì)胞在腎纖維化過(guò)程中的作用仍不清楚［10］。研究［11］顯示，M1型巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)腎臟的局部炎癥反應(yīng)，進(jìn)而活化肌成纖維細(xì)胞，誘導(dǎo)RIF；然而，也有研究［12］認(rèn)為，持續(xù)活化的M2細(xì)胞可通過(guò)產(chǎn)生多種介質(zhì)如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β和基質(zhì)金屬蛋白酶9等，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)積累和間質(zhì)纖維化。因此，巨噬細(xì)胞極化的多樣性在腎纖維化過(guò)程中的作用有待深入研究。

本研究顯示，在第7和14天，RIF小鼠腎組織的巨噬細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子IL-1、IL-6、Arg-1顯著升高；體外研究顯示，MK可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-6，抑制MK表達(dá)可顯著抑制巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-6。雖然本研究檢測(cè)到RIF小鼠腎組織中巨噬細(xì)胞細(xì)胞上調(diào)表達(dá)IL-1b和Arg-1，但是體外實(shí)驗(yàn)未能觀察到MK促進(jìn)巨噬細(xì)胞IL-1b和Arg-1表達(dá)升高。上述研究結(jié)果提示，MK可通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，進(jìn)而使其向M1型極化，促進(jìn)腎組織纖維化。

活化的M1樣巨噬細(xì)胞促進(jìn)腎纖維化的機(jī)制有待深入研究。組織浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞活化可協(xié)同腎小管上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞促進(jìn)RIF。一方面，激活的巨噬細(xì)胞可通過(guò)多種炎性細(xì)胞因子作用于腎小管上皮細(xì)胞，促進(jìn)其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)分化為肌纖維細(xì)胞，進(jìn)而有助于RIF［13］；另一方面，持續(xù)活化的巨噬細(xì)胞還可表達(dá)黏附分子galectin-3，與成纖維細(xì)胞相互作用，促進(jìn)其活化并合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分如膠原和纖維［14］。也有研究［15］發(fā)現(xiàn)，活化的巨噬細(xì)胞可轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)RIF。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，活化巨噬細(xì)胞可介導(dǎo)慢性炎癥反應(yīng)，在腎纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。MK可通過(guò)激活M1型巨噬細(xì)胞促進(jìn)RIF。因此，靶向阻斷MK能夠調(diào)控巨噬細(xì)胞的活化，改善RIF程度，進(jìn)而抑制慢性腎臟病的進(jìn)程。本研究有助于理解MK在RIF病理形成中的作用，為RIF以及慢性腎臟病的診治提供新思路。