317L-Cu抗菌不銹鋼對小鼠成纖維細胞生物學行為的影響

馮靖雯，楊澤，楊柯，張揚

（1.中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院·附屬口腔醫(yī)院正畸科，遼寧省口腔疾病重點實驗室，沈陽 110002；2.中國科學院金屬研究所前沿材料研究部，沈陽 110016）

研究［1］顯示，口腔菌群呈動態(tài)平衡狀態(tài)。口腔治療中使用的各種金屬固定裝置會導致患者口腔清潔能力下降，同時改變口內菌群環(huán)境，使細菌數(shù)量增加、菌斑滯留，導致炎癥發(fā)生［2-3］。因此，研究者［4-5］在金屬表面制備抗生素涂層或注入金屬離子，從而有效減少感染的發(fā)生。CHAI等［6］將微量的Cu2+注入醫(yī)用不銹鋼中，研發(fā)了一種含有4.5%Cu2+的317L-Cu新型抗菌不銹鋼（00Cr19Ni13Mo3-4.5 wt pct Cu，317L-Cu SS）。研究表明，317L-Cu SS 不僅廣譜抗菌性能優(yōu)異，抗菌效果持久，且因其所含Cu2+高于316L-Cu約1%～2%而具有更加優(yōu)良的耐腐蝕性和可加工性。317L-Cu SS有望應用于臨床，特別是對于患有全身代謝性疾病的種植體周圍炎易感人群意義重大。

對于新材料安全性、有效性的評價，除機械、物理和化學性能之外，生物相容性同樣至關重要。含有微量Cu2+的317L-Cu SS的生物相容性符合標準是應用于正畸臨床治療的前提條件。本研究采取細胞形態(tài)學觀察、活細胞計數(shù)試劑盒CCK-8法、流式細胞儀Annexin V-FITC/PI雙染法及吖啶橙細胞黏附實驗，探討317L-Cu SS對小鼠成纖維細胞生物學行為（生長、增殖、黏附、凋亡）的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠成纖維細胞L-929購自中國醫(yī)科大學中心實驗室。5種金屬材料包括317L-Cu SS、醫(yī)用不銹鋼（00Cr19Ni13Mo3，317L SS）、純 銅（99.95 Cu，Cu）、醫(yī)用純鈦（99Ti，Ti）、鉛（98.2Pb，Pb）。所有金屬材料均購自中國科學院金屬研究所。

1.2 方法

1.2.1 金屬試件制備：將5種金屬材料分別制作成為直徑30 mm、厚度1 mm的圓片，每種各5片，用于細胞增殖活性檢測和細胞凋亡實驗。另將5種金屬材料分別制成直徑10 mm、厚度1 mm的圓片，每種各10片，用于細胞黏附實驗。

1.2.2 金屬浸提液制備：無菌條件下將制備完成的金屬試件放于培養(yǎng)板中，金屬表面積與培養(yǎng)液配比3 cm2∶1 mL為浸提液制備標準。

1.2.3 CCK-8法細胞毒性檢測及細胞形態(tài)學觀察：實驗分為6組，RPMI1640培養(yǎng)液組（陰性對照組）、Ti組、317L-Cu SS組、317L SS組、Cu組、Pb組（陽性對照組）。L-929細胞生長至對數(shù)生長期，將其制備成懸液并接種于培養(yǎng)板中，每孔加入相應的金屬浸提液或培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h時對細胞形態(tài)進行觀察及細胞毒性檢測。在490 nm波長下酶標儀法測量各孔吸光度（optical density，OD）值，相對增殖率（relative growth rate，RGR）計算方法［7］：RGR=ODe/ODc×100%，ODe為實驗組、陽性對照組平均OD值，ODc為陰性對照組OD值。

1.2.4 細胞黏附實驗：將細胞分為4組，Ti組、317LCu SS組、317L SS組、Cu組。4種金屬試件置于無菌24孔培養(yǎng)板中，材料表面接種L-929細胞，在培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h時各組取出1塊培養(yǎng)板進行吖啶橙染色，熒光顯微鏡下觀察細胞黏附情況。

1.2.5 細胞凋亡實驗：將細胞分為陰性對照組、Ti組、317L-Cu SS組、317L SS組、Cu組5組。培 養(yǎng)L-929細胞長滿約80%孔底面積時，陰性對照組更換為原RPMI1640培養(yǎng)液，而其他組更換為金屬浸提液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后移除各孔中的金屬浸提液或培養(yǎng)液，重懸細胞，使用AnnexinⅤ-FITC/PI 雙標記流式細胞儀測定細胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用表示，組間比較采用t檢驗或方差分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞形態(tài)學比較

倒置相差顯微鏡下觀察L929細胞在培養(yǎng)24、48、72 h后 6種材料浸提液中的細胞形態(tài)，結果顯示，陰性對照組細胞生長旺盛。與陰性對照組比較，Ti組、317L-Cu SS組、317L SS 組細胞生長速度略慢，但貼壁生長情況良好，隨培養(yǎng)時間延長偶見少量細胞的細胞核固縮；Cu組細胞異常，呈空泡狀中毒樣；陽性對照組多見重度中毒樣的懸浮死細胞，見圖1。

圖1 各組L929細胞培養(yǎng)24、48、72 h后的形態(tài)學比較×40Fig.1 Morphological comparison of L929 cells in each group at 24，48，and 72 h ×40

2.2 各組細胞毒性比較

CCK-8法檢測6種材料浸提液培養(yǎng)24、48、72 h后的L929細胞OD值，結果顯示，除Cu組和陽性對照組外，其他4組隨著培養(yǎng)時間的延長L929細胞OD值均增加。在培養(yǎng)24 h、72 h后317L-Cu SS 組L929細胞OD值低于Ti組（P＜ 0.05），而培養(yǎng)48 h后2組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。317L SS 組L929細胞OD值低于317L-Cu SS 組（P＜ 0.05）。Cu組、陽性對照組L929細胞OD值均明顯低于其他組（均P＜ 0.05）。見圖2。

圖2 各組培養(yǎng)24、48、72 h 后L929細胞OD值比較Fig.2 Comparison of optical density values of L929 cells in each group at 24，48，and 72 h

由OD值計算出各組細胞培養(yǎng)24、48、72 h的相對增殖率及細胞毒性。結果顯示，Ti組、317L-Cu SS組、317L SS 組細胞毒性等級均為1級，無明顯細胞毒性；Cu組、陽性對照組細胞毒性等級為3級或4級，表現(xiàn)出較明顯的細胞毒性。見表1。

表1 各組培養(yǎng)24、48、72 h 后細胞增殖率及毒性級別比較Tab.1 Comparison of L929 cell proliferation rates and toxicity levels at 24，48，and 72 h in each group

2.3 AnnexinⅤ-FITC/PI雙標記流式細胞儀檢測細胞凋亡

結果顯示，各組凋亡細胞分布不均勻。陰性對照組、Ti組、317L-Cu SS組、317L SS組、Cu組的細胞凋亡率分別為（1.89±0.12）%、（2.28±0.13）%、（2.72±0.19）%、（5.20±0.27）%、（38.77±1.99）%。陰性對照組、Ti組、317L-Cu SS 組間細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（均P＞ 0.05），而其他各組間差異有統(tǒng)計學意義（均P＜ 0.05），見圖3。

圖3 各組凋亡細胞流式細胞儀檢測結果Fig.3 Flow cytometry results of apoptotic cells in each group

2.4 各組L929細胞的黏附情況

結果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，Ti組、317L-Cu SS 組、317L SS 組黏附細胞數(shù)量逐漸增加，而Cu組逐漸減少。與Ti組比較，細胞培養(yǎng)24、48 h 317L-Cu SS組黏附細胞數(shù)量減少（P＜ 0.05），而在培養(yǎng)48 h時，2組差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。各時間點 317L SS 組黏附細胞數(shù)量均少于317L-Cu SS 組（均P＜0.05）。各時間點Cu組細胞黏附數(shù)量明顯少于其他各組（均P＜ 0.05），見圖4、5。

圖4 L929細胞培養(yǎng)24、48、72 h 時各組的黏附情況比較×200Fig.4 Comparison of the adhesion of L929 cells in each group at 24，48，and 72 h ×200

圖5 L929細胞培養(yǎng) 24、48、72 h 時各組黏附的細胞數(shù)量比較Fig.5 Comparison of the number of adherent L929 cells in each group at 24，48，and 72 h

3 討論

近年來，微種植體支抗廣泛應用于正畸臨床治療中［8］，然而種植體與天然牙在結構上有本質的區(qū)別，它的表面無牙骨質且無牙周膜纖維附著，生物屏障作用較弱，容易產生感染。為減少細菌感染的發(fā)生，本研究采用的317L-Cu SS是傳統(tǒng)結構材料和功能材料完美結合的新一代抗菌不銹鋼，與以往的抗菌不銹鋼比較，其Cu2+含量更接近飽和注入量。體內和體外研究［9-11］已證實317L-Cu SS能夠阻止細菌的黏附或在黏附的短期內有效殺滅金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等常見致病菌，具有比傳統(tǒng)醫(yī)用不銹鋼材料更加優(yōu)越的抗菌性、可加工性和耐腐蝕性。

細胞形態(tài)變化是啟動一系列細胞生物學行為的信號，細胞的生物學行為包括細胞增殖、凋亡和壞死。體外細胞毒性實驗對評價材料生物相容性具有重要意義，已有研究［12］報道，Cu2+的細胞毒性具有濃度依賴性。本研究探討了317L-Cu SS的生物相容性。結果顯示，317L-Cu SS組細胞凋亡率與陰性空白對照組、Ti組比較無統(tǒng)計學差異（均P＞ 0.05），而低于317L-SS組（P＜ 0.05），說明微量的Cu2+不促進或僅輕微促進細胞凋亡。Cu組凋亡率明顯高于其他各組（均P＜ 0.05），說明高劑量的Cu2+可以誘導細胞凋亡，對細胞的正常生物學行為產生影響，與以往研究結果一致。

細胞能否大量黏附于金屬材料表面也是評價植入材料生物相容性的重要指標。本研究結果顯示，細胞培養(yǎng)24、48 h時317L-Cu SS組材料表面黏附的細胞數(shù)量少于Ti組（均P＜ 0.05），而在細胞培養(yǎng)72 h時2組材料表面黏附細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。同時與317L SS組比較，317L-Cu SS組材料表面黏附的細胞數(shù)量增加（P＜ 0.05），且細胞形態(tài)良好，證明317L-Cu SS材料表面較317L SS更有利于細胞黏附。分析其原因可能是材料中含有的微量Cu2+參與了細胞代謝活動，加強了細胞的黏附。

綜上所述，Cu2+的細胞毒性表現(xiàn)為雙向性，純銅材料具有明顯的細胞毒性，但含有微量Cu2+的317LCu SS對細胞的形態(tài)、黏附、增殖、凋亡等一系列生物學行為無明顯不良影響，且生物相容性良好，滿足了口腔生物材料的臨床應用要求。本研究僅局限于細胞水平，今后還需進一步論證。