基于eDNA技術的長江上游珍稀特有魚類國家級自然保護區重慶段魚類多樣性研究

王 夢 楊 鑫 王 維 段 聰 劉智皓 陳啟亮 李英文* 沈彥君*

(1. 重慶師范大學重慶市動物生物學重點實驗室, 重慶 401331; 2. 重慶市珍稀特有魚類國家級自然保護區管理處, 重慶 402260)

環境DNA(Environmental DNA, eDNA)是指從生物體的皮膚、唾液和分泌物等釋放到環境中的混合DNA分子[1,2], 其廣泛存在于水體、土壤、沉積物和空氣等環境介質中。eDNA metabarcoding通常指直接提取環境樣本中的總DNA, 并使用特異或通用引物進行聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction, PCR), 通過測序、生物信息學分析來識別環境中目標物種序列的一種新興的生物多樣性檢測手段[3,4]。eDNA技術最早起源于環境微生物學領域[5], 在2000年之后得到廣泛認可和應用[6]。Ficetola等[7]在2008年首次利用eDNA技術監測出池塘中存在入侵物種美國牛蛙(Rana catesbeiana), 余玥[8]基于eDNA技術成功檢測出長江中下游干流中的15種魚類, Zhang等[9]利用eDNA技術研究了長江口及其鄰近水域魚類群落結構的季節變化特征。總之, eDNA技術的出現為水生生態系統生物多樣性的研究開辟了一條新道路, 整個過程無需采集目標生物個體, 彌補了傳統方法調查成本大、缺乏標準化流程和對生態系統干擾高等的不足, 在水生生物多樣性評估方面具有極大的應用潛能[10]。

長江上游珍稀特有魚類國家級自然保護區(下簡稱“保護區”)是長江上游最大的水生生物自然保護區, 涉及三省一市(云南、貴州、四川和重慶), 其流域復雜的地形地貌和發達的河網水系等孕育了豐富的魚類種類[11—14], 是我國重要的淡水魚類資源寶庫[15]。其中重慶段(28°55′—29°20′N, 105°53′—106°24′E)起于重慶市江津區石蟆鎮羊石街道, 止于珞璜鎮地維大橋, 全長118.8 km, 分為核心區、緩沖區和實驗區3個部分, 其主要的保護對象為達氏鱘(Acipenser dabryanus)和胭脂魚(Myxocyprinus asiaticus)等珍稀特有魚類[16]。重慶段是保護區最下游的江段, 是關系到上游保護區內珍稀特有魚類生存和三峽庫區漁業資源增殖的重要通道, 對維系我國淡水魚類種質資源、魚類生物多樣性及三峽庫區水域生態系統穩定性具有重要意義[17]。然而,近年來, 由于過度捕撈、水體污染、魚類繁殖場所的破壞和航道整治工程建設等的影響[18], 長江上游的魚類資源呈現出明顯下降的趨勢, 在一定程度上打破了原有的水生態系統平衡。

當前, 在長江大保護的背景下, 為了修復長江流域生態, 保護魚類自然資源, 迫切需要了解長江流域魚類資源的現狀及存在的問題, 為漁業管理以及生態保護政策的制定與實施提供科學依據。但傳統捕撈調查方法費時費力, 不僅對魚類具有傷害性, 還必須依賴魚類分類學家對采集樣本進行鑒定[19],且目前正是“十年禁漁”時期, 傳統調查方法工作的開展受到很大程度的限制。因此, 本文首次運用eDNA技術對保護區重慶段魚類多樣性進行初步評估, 探索適用于長江魚類資源監測和保護的新方法[20],并為后期長江“十年禁漁”效果評估提供一定的基礎資料。

1 材料與方法

1.1 采樣時間及采樣點的設置

本次調查于2021年3月28日進行, 為提高環境DNA檢測成功率, 本研究結合地理環境和有關魚類“三場”分布的歷史資料, 在該江段共布設了三拋河(SPH)、松溉(SJ)、高占灘(GZT)、丁家沱(DJT)、綦江口(QJK)和馬夫沱(MFT)6個采樣點, 各采樣點具體分布見圖 1。

圖 1 樣品采樣點分布圖Fig. 1 Information of sampling locations

1.2 水樣的采集與處理

當前正處于長江“十年禁漁”期, 本次調查經過相關漁業主管部門的批準后進行。到達指定采樣點后, 在每個取樣位置記錄水體溫度、深度和地理坐標, 待調查船關閉發動機15min后, 用采水器從表層水體采集2 L水樣放置于聚乙烯瓶中[21]。各采樣點采集3瓶平行水樣。采水器及采樣瓶在使用前均用10%漂白粉溶液進行消毒, 且在采集過程中, 采集人員每次取樣后需更換一次性手套[22]。收集到的水樣儲存于冷藏條件下, 運送回實驗室, 于24h內使用真空泵抽濾到孔徑為0.45 μm的混合纖維素濾膜(Whatman, UK)上。若水樣較渾濁, 則先將水樣用無菌的醫用紗布進行粗過濾后再進行抽濾[19]。每份樣品抽濾前后, 均對器材進行消毒以清除裝置中殘余的DNA, 避免樣品間的交叉污染。且在每次抽濾時, 還需設置1個陰性對照來評估是否存在外源DNA污染。最后將濾膜置于4.5 mL無酶凍存管(Thermo)中于-80℃冷凍保存, 直至DNA提取。

1.3 水樣總DNA提取

使用PowerWater DNA Isolation Kits(Qiagen公司)試劑盒提取濾膜中捕獲的水樣總DNA, 為了減少DNA降解, 用無菌TE溶液代替PW6(無菌洗脫液)進行最后一步洗脫。最后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取到的基因組DNA質量[23]。每份樣品獨立提取, 為評估提取過程是否存在污染, 需設置空白濾膜作為陰性對照。最后將DNA樣品置于-20℃下冰箱保存, 直至PCR擴增。

1.4 PCR擴增及高通量測序

本研究以魚類多樣性監測中使用最廣泛的分子標記—線粒體基因12S rRNA為靶點, 選取Valentini 等[24]開發的魚類特異引物“Teleo” (teleo-F: 5′-ACACCGCCCGTCACTCT-3′; teleo-R: 5′-CT TCCGGTACACTTACCATG-3′)進行擴增, 并添加樣本特異性的 Barcode 序列。PCR采用TransStart Fastpfu DNA Polymerase, 擴增為20 μL反應體系: 4 μL 5×FastPfu Buffer、2 μL dNTPs、0.4 μL FastPfu Polymerase、2—5 μL模板DNA(10 ng/μL)和上下游引物各0.8 μL(10 μmol/L), 最后用ddH2O將體系補至20 μL。PCR反應程序: 預變性95℃ 5min, 變性95℃ 30s, 退火55℃ 30s, 延伸72℃ 45s, 終延伸72℃10min, 于10℃保存(變性-延伸-退火為27個循環)。為評估P C R擴增中是否出現污染, 需要使用ddH2O為模板進行PCR陰性對照。進行PCR擴增時, 每個樣本進行3次重復, 并將PCR產物混合。經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。在本研究中,18個樣品均獲得了可檢測的PCR產物。PCR產物膠回收后送至上海凌恩生物科技有限公司通過Illumina NovaSeq 6000測序平臺進行高通量測序。

1.5 數據處理

數據質量控制 Illumina PE250測序序列首先根據barcode得到所有樣品的有效序列; 然后對reads的質量進行質控過濾; 再根據PE reads之間的overlap關系, 將成對的reads拼接(merge)成一條序列; 最后按照barcode和引物序列拆分得到每個樣本的優質序列, 并在過程中根據正反barcode和引物方向校正序列方向。

OTU聚類與注釋 按序列相似性≥97%進行OTU聚類分析后將OTU代表序列與MitoFish(http://mitofish.aori.u-tokyo.ac.jp/)和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫進行比對、分類注釋, 并得到相應的OTU豐度表。在各采樣點的平行樣品中未匹配到的物種序列被剔除, 匹配到物種的序列數按均值處理。

統計分析 本研究以OTU聚類分析結果為基礎,進行了物種組成分析、Alpha多樣性和Beta多樣性分析(包括未鑒定到種水平的3屬)。(1)物種組成分析。去除比對到非魚類(如細菌、鳥類、兩棲類和哺乳類等)的數據信息后, 篩選出比對至魚類且identity值≥97%,E-value≤10-5的OTU, 再將比對至同一物種的OTU進行合并。若有OTU無法比對至種水平, 則向上一級如屬、科等進行統計。在Excel中統計各個樣本中每種魚的有效序列數占比并參考Fishbase數據庫和《中國內陸魚類物種與分布》注釋、完善魚類分類學信息。最后通過R語言繪制各個采樣點魚類組成柱狀圖等。(2)Alpha多樣性分析。本文選取Chao1指數(Chao1 index)、香農指數(Shannon index)、辛普森指數(Gini-Simpsonindex)及覆蓋度(Coverage)指數, 分別反映群落豐富度(Community richness)、群落多樣性(Community diversity)及群落覆蓋度(Community coverage)。(3)Beta多樣性。本研究基于Bray-Curtis距離矩陣進行PCoA分析, 探索不同分組樣本間的群落組成差異性或相似性。

2 結果

2.1 魚類物種組成

從6個采樣點共獲得1565條OTU, 不同采樣點OTU數量差異見圖 2。由圖 2可看出, 6個采樣點有724個共有的OTU。其中QJK的OTU數量最多, 共1252條; DJT最少, 僅有1054條。對OTU進行注釋后, 本次調查共檢測出魚類74種(不包括未鑒定到種水平的3屬; 表 1), 隸屬6目16科52屬, 含有圓口銅魚(Coreiusguichenoti)和長鰭吻(Rhinogobioventralis)兩種國家級保護魚類; 長江上游特有魚類10種;重慶市重點保護魚類1種。鯉形目(Cypriniformes)的鯉科魚類最多, 總計38種, 占魚類物種總數的48.72%; 而鱘形目(Acipenseriformes)、鳉形目(Cyprinodotiformes)和鮭形目(Salmoniformes)的種類最少, 均僅含1種。根據序列比對結果, 本次調查中的鯽屬(Carassius)、羅非魚屬(Oreochromi)及鱘屬(Acipenser)未鑒定到種水平。

圖 2 各采樣點的韋恩圖展示Fig. 2 Venn diagram display of each sampling point

?

?

?

基于各采樣點的序列豐度, 在屬水平的物種組成情況見圖 3。由圖 3可知, 鯉屬(Cyprinus)、鯽屬(Carassius)、草魚屬(Ctenopharyngodon)和黃顙魚屬(Tachysurus)等在各采樣點均被監測到并顯示出相對較高的序列豐度。此外, 由表 1的物種序列數可知, 除了峨眉鱊(Acheilognathus omeiensis)、倒刺鲃(Spinibarbu denticulatus)、圓口銅魚(C. guichenoti)和寬體沙鰍(Sinibotia reevesae)等12種魚類僅在個別采樣點中檢測到, 其余魚類在6個采樣點中均被檢測到, 但在魚類序列數上呈現出了明顯的差異,例如大口黑鱸(Micropterus salmoides)、赤眼鱒(Squaliobarbus curriculus)和半?(Hemiculterella sauvagei)等在各采樣點的序列數相差較大。

圖 3 各采樣點的魚類物種組成Fig. 3 The composition of fish species at each sampling site

2.2 Alpha多樣性分析

本研究通過計算Chao1、Shannon和Simpson多樣性指數及覆蓋度Coverage來對該保護區魚類群落進行Alpha多樣性分析, 各樣本的Alpha多樣性指數見表 2。由表 2可知, 各采樣點Alpha多樣性的各項指數較為均勻。各個樣本的Coverage值范圍為0.9996—0.9998, 表明測序基本覆蓋到了全部的OTU數據, 能反映樣本的真實情況。

表 2 各樣本的Alpha多樣性指數統計Tab. 2 Alpha diversity index of each sample

2.3 Beta多樣性分析

本研究基于各采樣點的序列豐度, 采用Bray-Curtis距離矩陣進行PCoA分析( 圖 4), 對比樣本間魚類種類組成的相似性或差異性。由圖 4可知, 采樣點MFT與SPH及QJK與SJ具有相似的魚類多樣性, 而DJT和GZT具有不同于其他采樣點的魚類組成。

圖 4 基于Bray-Curtis距離矩陣的魚類的主坐標分析(PCoA)Fig. 4 Analysis of fish principal coordinates based on Bray-Curtis distance matrix

3 討論

3.1 基于環境DNA的長江魚類組成

本研究首次運用eDNA技術分析了長江上游珍稀特有魚類國家級自然保護區重慶段魚類多樣性,共檢測出魚類74種(不包括未鑒定到種水平的3屬),其中鯽屬(Carassius)、羅非魚屬(Oreochromi)及鱘屬(Acipenser)未鑒定到種水平。羅非魚屬(Oreochromi)未鑒定到種是因為數據庫中沒有相應的參考序列; 而鯽屬(Carassius)及鱘屬(Acipenser)只能鑒定到屬, 其原因是比對到不同的物種但有相同的比對質量。這可能與擴增片段較短及數據庫所含物種信息不完整有一定的關系。

根據相關資料記載, 近年來通過刺網和撒網等傳統方法監測到有103種漁獲物(表 3), 其中吻鮈屬(Rhinogobio)、銅魚屬(Coreius)、黃顙魚屬(Pelteobagrus)及蛇鮈屬(Saurogobio)等為主要優勢種群[25—30]。在本次調查中, 鯉屬(Cyprinus)、鯽屬(Carassius)和草魚屬(Ctenopharyngodon)魚類的豐度和占到50%以上, 這可能與采樣時間和地點有較大關系。為提高環境DNA檢測成功率, 本研究布設的6個采樣點均為歷史資料記載的產卵場。其次, 本次調查于2021年3月28日進行, 這正處于鯉魚等魚類的繁殖季節。因此造成鯉屬(Cyprinus)、鯽屬(Carassius)和草魚屬(Ctenopharyngodon)魚類的豐度較高。除上述3個屬以外的魚類與傳統方法監測的結果相比,魚類結構組成較為一致, 蛇鮈屬(Saurogobio)、黃顙魚屬(Pelteobagrus) 、?屬(Hemiculter)及吻鮈屬(Rhinogobio)等魚類為當前優勢種。這也凸顯了eDNA技術作為一種新興的生物多樣性調查方法,在水生生物監測和保護的應用中具有檢測靈敏度高等特點[31,32]。

表 3 基于傳統方法在保護區監測到的漁獲物種類Tab. 3 Types of catches monitored in protected areas based on traditional methods

續表 3

續表 3

此外, 本研究還檢測出短吻間銀魚(H. brachyrostralis)、羅非魚(O.sp.)、大口黑鱸(M. dolomieu)和團頭魴(M. amblycephala)等7個外來物種, 這可能是該保護區流域周邊的漁業養殖場缺乏必要的物種隔離設施及防逃手段, 造成上述外來物種的逃逸而進入長江[33]。嚴太明等[34]的相關研究表明, 外來物種的引入可能會給土著魚類和生態系統帶來巨大的災難。因此, 對于保護區上游周邊的養殖場應當建造物種隔離及防逃設施, 防止外來物種的入侵對保護區土著魚類資源造成一定的生態脅迫。

3.2 基于環境DNA的長江魚類多樣性分析

表 3反映了魚類群落豐度的Alpha多樣性指數[35]。本研究中的Chao1指數范圍為1204—1360, 其中QJK采樣點值最大, 表明該采樣點的群落豐富度最高; 而SPH采樣點指數最小, 表明群落豐富度最低。這可能與各采樣點的地理位置和環境有密切關系。QJK位于支流(綦江)與干流(長江)的交匯口,其水域的復雜性可能使該處的群落豐富度最高; 而SPH采樣點位于趙家中壩內浩附近, 內浩進、出口水流紊亂, 激流回漩, 可能在一定程度上導致了魚類分布量相對較少, 從而使群落豐富度較低。其他樣點的Chao1指數較為均勻, 表明該保護區魚類生態結構較為穩定[36]。Shannon和Simpson指數均揭示了魚類的多樣性水平[37]。在本研究中, Shannon和Simpson指數表明GZT魚類多樣性最高, 這可能與小口黑鱸(M. dolomieu)、西昌華吸鰍(S. sichangensis)和赤眼鱒(S. curriculus)等物種的序列豐度較高有關。而DJT魚類多樣性最低, 這可能與該樣點的DNA提取濃度偏低有關。不同指數評估魚類多樣性的側重點具有一定差異, 群落豐富度指數并不能完全衡量群落多樣性高低[38]。如SJ位點的Simpson多樣性指數較低但群落豐富度較高, 推測可能與樣品中少數魚類物種序列豐度過高有關。

基于Bray-Curtis距離矩陣的Beta多樣性分析顯示DJT和GZT兩個采樣點與其他樣點的魚類組成相似度較低, 共有物種較少(圖 4)。這可能是受到了自然因素和人為因素的共同影響。DJT和GZT分別位于保護區的高占灘和丁家沱附近, 其周圍人為活動頻繁。如耕種養殖及浣洗衣物等活動會改變河流中氮磷含量, 從而影響到魚類營養物質的獲取及魚類多樣性[39,40]。從自然因素來看, 劉軍等[41]探究了長江上游主要河流的魚類分布與流域面積、含沙量和平均徑流量等自然地理、水文變量有著密切關系。其中以含沙量為代表的懸浮物濃度會對魚類的生存和生長產生影響, 從而改變魚類多樣性[42,43]。DJT和GZT兩個采樣點較其他采樣點水樣更為渾濁, 所以與其他樣點的魚類組成相比, 在一定程度上表現出了差異性。而其他各樣點共有物種較為集中, 這可能與采樣點之間距離較近, 魚類可以進行頻繁的交流有關。

3.3 影響eDNA檢測的因素

由于長江流域環境的復雜性, eDNA的產生及降解速率易受水溫、pH、流速、紫外線和水域底質等諸多環境因素的影響[44,45]。本次調查共設置6個采樣點, 18個樣品。其中僅DJT采樣點的PCR擴增結果不理想, 在3個平行樣品中, 一個樣品PCR產物濃度偏低, 其余2個樣品PCR產物目的條帶太弱或未檢測到。而其余5個采樣點PCR擴增結果達到A, 即產物目的條帶大小正確, 濃度合適, 符合測序要求。本研究認為造成這種差異性可能與該采樣點的環境有密切關系。eDNA得率除了水樣本身所包含的生物物質多少之外, 還受到單張濾膜抽濾體積、水樣泥沙含量和抽提操作等多種因素影響[46]。DJT采樣點位于保護區重慶段丁家沱附近, 該處水樣渾濁, 泥沙含量較高, 在進行eDNA抽提時, 這些泥沙導致抽濾速度慢、耗時長。這就有可能使部分DNA片段在抽濾時發生了降解, 從而影響了DNA的提取結果和濃度。此外, 泥沙可能會吸附一些脫落游離的DNA, 這也可能會對DNA抽提效率產生一定的影響[23]。因此, 在進行采樣時應盡量選擇泥沙較少的區域, 或者在過濾時用一次性的醫用紗布進行粗過濾后再對水樣進行過濾[19]。此外, 還可以選用孔徑較大的濾膜進行預過濾后再將濾液重新過濾到孔徑較小的濾膜上。

3.4 長江流域魚類資源保護建議

在本次調查中, 6個采樣點共監測到的魚類種類為74種(不包括未鑒定到種水平的3屬), 其中包含小眼薄鰍(L. microphthalma)、圓口銅魚(C. guichenoti)、汪氏近紅鲌(A. wangi)和短體副鰍(P.potanini)等長江上游特有魚類。然而, 環境DNA未檢測到有歷史資料記載的達氏鱘(A. dabryanus)和巖原鯉(P. rabaudi)等珍稀特有魚類, 可能是因為上述長江特有魚類在該江段的資源量較為稀少, 從而在環境中缺少對應的物種DNA。如不采取有效措施, 可能會導致這些長江魚類的資源量進一步下降。而魚類作為水生態系統的重要組成部分, 其物種多樣性及組成結構的變化會影響水生態系統的健康狀態[47]。因而, 保護魚類多樣性對于水生態系統的穩定具有重大的意義。為此, 針對長江流域魚類資源的保護提出了以下兩點建議: (1)嚴格監督、合理解決保護區段流域生態安全問題。比如合理搭建人工魚巢和人工魚礁; 及時關注流域內生物入侵情況, 筑好生態安全屏障; 增殖放流應合法合理,征求相關科研人員專業建議; 密切關注沿江城鎮和企業排污問題, 從源頭控制污染負荷; 嚴格監管兩岸消落帶及中壩上作物種植和畜禽養殖, 避免面源污染對魚類生境產生影響[11,48]。(2)加強科學研究,建立適應性管理機制。盡管長江流域魚類資源豐富, 但缺乏絕大部分魚類的基本生物學信息, 使得我們無法對其種群狀態進行準確評估, 同時也不利于人工繁殖等相關保護工作的開展[49]。因此, 建議全面調查長江流域魚類的物種數量、種群狀況和受威脅程度等, 系統開展魚類基礎生物學和生態學研究, 重點研究珍稀特有魚類的人工繁殖技術; 同時加強水生態系統的健康監測[50], 建立適應性管理機制。

4 結論

傳統的魚類資源調查耗時費力, 而eDNA技術在靈敏度、標準化和種類鑒別等方面均優于傳統方法, 且操作簡單, 在魚類多樣性的監測與保護工作中具有巨大的應用前景。本研究首次運用eDNA技術調查長江上游珍稀特有魚類國家級自然保護區重慶段魚類多樣性, 共檢測出魚類74種(不包括未鑒定到種水平的3屬), 成功驗證了eDNA技術檢測長江魚類物種組成的有效性和可行性。各樣點的魚類Alpha和Beta多樣性分析結果差異較小, 表明該保護區魚類的生態結構較為穩定。在現階段的長江魚類資源監測中, 雖然eDNA技術無法完全取代傳統的魚類監測方法, 但可根據監測任務的需要, 與傳統監測方法結合使用, 用于快速調查長江魚類的多樣性組成及分布等, 為后期長江“十年禁漁”效果評估提供一定的基礎資料。

致謝:

感謝陶曄、查富蓉和劉靜(上海凌恩生物公司)在生物信息學分析工作中提供的幫助; 感謝重慶市珍稀特有魚類國家級自然保護區管理處工作人員在本次采樣中所提供的幫助。