金沙江中下游圓口銅魚遺傳多樣性與種群歷史動態分析

何勇鳳 朱永久 龔進玲 朱挺兵 吳興兵 李學梅 孟子豪 楊德國

(中國水產科學研究院長江水產研究所, 農業農村部淡水生物多樣性保護重點實驗室, 武漢 430223)

金沙江是長江上游干流的一段, 起自青海省玉樹巴塘河口, 至四川省宜賓岷江口止, 全長約2290 km,約占長江上游干流河長的2/3, 總落差3333 m, 平均比降1.45‰, 水量豐沛, 集水面積36.2×104km2, 約占長江上游流域面積的36%[1]。自青海省玉樹巴塘河口至云南省麗江石鼓為金沙江上段, 河長約984 km,平均比降為1.75‰, 從石鼓至四川省攀枝花市為金沙江中段, 河長約546 km, 平均比降為1.48‰, 從攀枝花市至四川宜賓岷江口為金沙江下段, 河長約783 km, 平均比降為0.93‰[2]。金沙江由青藏高原邊緣地區向四川盆地邊緣地區進行過渡, 跨越中國地勢的第一大階梯和第二大階梯, 河流情勢多變,比降大, 生境異質性高, 孕育了豐富的魚類資源, 據調查統計金沙江流域共分布有魚類200種[2]。金沙江水能資源非常豐富, 理論蘊藏量占長江總量的45.25%, 是國家規劃的13個重要能源基地之一, 在我國能源資源建設中具有重要的戰略地位。金沙江上游江段規劃有7個梯級水電站, 從上而下依次是崗托、波羅、葉巴灘、拉哇、巴塘、蘇洼龍和昌波水電站, 其中蘇洼龍水電站已建成蓄水, 葉巴灘水電站正在修建中, 其余電站均尚未開工建設;金沙江中游江段規劃有10個梯級水電站, 從上而下依次是龍盤、兩家人、梨園、阿海、金安橋、龍開口、魯地拉、觀音巖、金沙和銀江水電站, 其中梨園、阿海、金安橋、龍開口、魯地拉和觀音巖等6個水電站已建成蓄水發電, 金沙水電站已實現三期截流, 銀江水電站正在修建中, 龍盤和兩家人2個水電站尚未開工建設; 金沙江下游江段規劃有4個梯級水電站, 從上而下依次是烏東德、白鶴灘、溪洛渡和向家壩水電站, 其中烏東德、溪洛渡和向家壩水電站已建成蓄水發電, 白鶴灘水電站正在修建中。金沙江大規模的水電建設顯著影響了水生生態環境, 大壩阻隔使原本急流險灘的河流環境變成了靜水緩流的河道型水庫環境, 水文條件發生巨大改變, 這無疑都使原有的魚類區系及分布格局發生明顯改變, 尤其對適合急流生活、產漂流性卵的魚類如圓口銅魚[Coreius guichenoti(SauvageetDabry)]等產生巨大影響。

圓口銅魚隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、鮈亞科(Gobioninae)、銅魚屬(Coreius), 主要分布于長江上游干流及雅礱江、烏江等大型支流中, 是典型的河道洄游性魚類和產漂流性卵魚類, 也是長江上游特有魚類和重要的經濟魚類[3—5],其產卵場僅發現于金沙江中下游以及雅礱江干流下游[6—8]。但近些年來, 由于長期的過度捕撈、無節制的資源掠奪和長江上游梯級水電開發的逐步實施, 圓口銅魚完成生活史的通道因筑壩截流而被阻, 其產卵場環境遭受毀滅性破壞, 其種群資源已呈現明顯的下降趨勢[9—11], 其物種生存與延續面臨巨大的威脅,2007年已被列入農業部《國家重點保護經濟水生動植物資源名錄(第一批)》中, 2015年更是被環境保護部和中國科學院聯合發布的《中國生物多樣性紅色名錄——脊椎動物卷》評估為極度瀕危物種。目前關于圓口銅魚的研究主要涉及生物學、資源量、棲息地、馴養繁殖與性腺發育、營養與疾病防治、應激、能量代謝、親子鑒定和遺傳多樣性等方面[7,12—26],其中關于圓口銅魚遺傳多樣性的研究, 內容包括微衛星標記篩選、部分江段(如雅礱江金河江段、金沙江觀音巖江段、攀枝花江段、巧家江段、永善江段、屏山江段、宜賓江段、長江上游重慶江段、三峽庫區江段和長江中游宜昌江段)群體的遺傳多樣性評估等[20—26]。然而, 針對金沙江中游江段的圓口銅魚群體尚未有任何研究報道。

因此, 在金沙江中下游已修建十二級水電工程的背景下, 本研究以圓口銅魚野生樣本為實驗材料,重點針對金沙江中下游江段尚有分布的4個群體進行線粒體Cytb基因和COⅠ基因測序, 分析圓口銅魚金沙江中下游不同地理群體的遺傳多樣性、群體分化以及種群歷史動態等, 以期為金沙江圓口銅魚的種群遺傳管理和資源保護提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

于2017—2019年對金沙江中下游干流江段圓口銅魚的分布進行野外調查, 共采集到393尾樣本,其中金安橋群體153尾、龍開口群體124尾、巧家群體101尾和屏山群體15尾。樣本經現場測量全長、體長和體重等基礎生物學信息后(表 1), 剪取鰭條, 采用無水乙醇進行固定保存。樣本分布圖見圖 1。

表 1 金沙江中下游圓口銅魚樣本采集信息Tab. 1 Sampling information of Coreius guichenoti in the middle and lower reaches of the Jinsha River

圖 1 金沙江中下游圓口銅魚樣本采集地點Fig. 1 Map of sample locations for Coreius guichenoti in the middle and lower reaches of the Jinsha River

1.2 基因組DNA提取、PCR擴增及測序

采用Omega Bio-Tek公司的Tissue DNA Kit(D3396)試劑盒提取圓口銅魚樣本基因組DNA, 采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和完整性, 于-20℃保存。Cytb基因擴增和測序引物為L14724(5′-gACTTgAAAAACCACCgTTg-3′)和H15915(5′-CTCCgATCTCCggATTACAAgAC-3′)[27],COⅠ基因擴增和測序引物為COⅠ-F(5′-TCAACCAACCA CAAAgACATTggCAC-3′)和COⅠ-R(5′-TAgAC TTCTgggTggCCAAAgAATCA-3′)[28]。PCR反應總體積為30 μL, 反應體系包括: 2×PowerTaqPCRMasterMix 15 μL, 基因組DNA 1 μL, 引物各1 μL (10 mmol/L), 滅菌ddH2O 12 μL。PCR反應條件為: 95℃預變性5min; 95℃變性30s, 58℃退火30s, 72℃延伸1min,共35個循環; 最后72℃延伸5min。PCR產物采用1%瓊脂糖凝膠拍照檢測目的片段, 成功后將PCR產物送武漢天一輝遠有限公司完成純化、測序與拼接。

1.3 數據分析

測序所得序列使用DNASTAR軟件包中的Seq-Man編輯首尾兩端噪音序列至同樣長度。同時, 為了獲得更多的變異信息, 合并了兩個線粒體基因Cytb和COⅠ的串聯序列用于后續分析。采用MEGA 6.0[29]進行序列比對和校正, 統計堿基組成, 并采用Kimura雙參數模型進行譜系分支內部與分支之間遺傳距離的計算。采用DnaSP v6軟件計算群體變異位點(Variable sites)、單一突變位點(Singleton variable sites)、簡約信息位點(Parsimony-informative sites)、單倍型多樣性(Haplotype diversity)和核苷酸多樣性(Nucleotide diversity)等[30]。

利用PopART軟件(http://popart/otago.ac.nz)以中接法(Median-joining)構建單倍型網絡關系圖[31],分析單倍型之間的進化關系。采用PhyloSuite軟件[32]中最大似然法(Maximum likelihood, ML)和貝葉斯法(Bayesian inferences, BI)構建圓口銅魚分子系統發育樹, 其中ML法建樹時運行10000次bootstrap,BI法建樹時運行200萬代。

使用Arlequin 3.5軟件[33]中的分子方差分析(Analysis of Molecular Variance, AMOVA)估算群體遺傳距離和遺傳變異的分布, 計算群體遺傳分化指數Fst。同時, 采用貝葉斯聚類分析(Bayesian Analysis of Population Structure)BAPS 6.0軟件[34]中“Clustering with linked loci”對圓口銅魚393個個體的線粒體串聯基因序列進行聚類分析, 設置潛在種群K值為2—10的整數值, 并且分別重復計算10次,迭代次數1000次, 確定聚類關系。

使用Arlequin3.5軟件計算錯配分布(mismatch distribution)[35]、Tajima’sD[36]和Fu’sFs值[37]來檢驗群體歷史上是否經歷擴張, 通過偏差平方和(Sum of Squared deviation, SSD)和粗糙指數(Harpending’s Raggedness index,Hri)來檢測核苷酸不配對分布與種群擴張模型下期望分布之間的擬合優度。采用BEAST v1.10.4軟件[38]對串聯基因序列進行種群歷史動態的Bayesian skyline plot(BSP)分析, 利用Tracer v1.7.1軟件進行構圖[39], 最佳堿基替換模型為HKY+I+G模型, 分子鐘模型采用strict clock, 魚類線粒體DNA基因序列的突變率采用1%/百萬年[40,41],估算圓口銅魚不同譜系分支的分化時間。

2 結果

2.1 基因序列變異分析

本研究共獲得393尾圓口銅魚的線粒體Cytb基因(GenBank登錄號: MW045220—MW045310)和COⅠ基因序列(GenBank登錄號: MW094040—MW094130)。在序列兩端截齊后, 共獲得: (1)1140 bp的Cytb序列, 變異位點56個, 其中單一突變位點19個, 簡約信息位點37個, 平均堿基組成: A=29.3%、T=29.7%、C=27.0%、G=14.0%, A+T的含量(59.0%)高于G+C的含量(41.0%), 平均轉換/顛換值為9.44, 界定了60個單倍型; (2)680 bp的COⅠ序列,變異位點20個, 其中單一突變位點5個, 簡約信息位點15個, 平均堿基組成: A=26.1%、T=29.9%、C=25.8%、G=18.1%, A+T的含量(56.0%)高于G+C的含量(43.9%), 平均轉換/顛換值為4.81, 界定了27個單倍型; (3)兩個基因序列中堿基G的含量均最低, 尤其在密碼子第三位的含量最低, 堿基組成表現出了明顯的AT偏好和反G偏倚, 符合脊椎動物線粒體DNA基因的共同特性; (4)串聯后的線粒體基因序列, 界定了91個單倍型。

2.2 單倍型多樣性和核苷酸多樣性

基于2個基因的串聯序列(表 2), 估算金沙江中下游野生圓口銅魚的單倍型數目介于6—55, 單倍型多態性介于0.838 (±0.061)—0.960 (±0.005), 核苷酸多態性介于0.00426 (±0.00023)—0.00519 (±0.00009)。從不同地理群體來看, 金安橋群體的單倍型數目、單倍型多樣性和核苷酸多樣性均是最高的, 屏山群體的單倍型多樣性和巧家群體的核苷酸多樣性均是最低的。

從單倍型分布來看, 全部群體的共享單倍型為4個, 如單倍型Hap4、Hap5、Hap12和Hap40, 而其中2—3個群體的共享單倍型數目為21個。從獨有單倍型來看, 4個野生群體均分布有獨有單倍型, 如金安橋群體和龍開口群體分布的獨有單倍型數目分別為32個和17個, 巧家群體分布有16個獨有單倍型, 屏山群體僅分布有1個獨有單倍型(表 2)。

2.3 系統發育關系

以銅魚(Coreius heterodon, GenBank登錄號:NC_020042.1)為外類群, 應用最大似然法(ML)和貝葉斯法(BI)構建圓口銅魚91個線粒體Cytb和COⅠ串聯基因序列單倍型之間的系統發育樹。結果顯示, 2種方法分析得到的系統發育樹拓撲結構基本一致, 所有單倍型聚為一個單系, 但在系統樹上并不按照地理分布聚類, 存在多岐分支(圖 2)。串聯基因序列單倍型進化網絡關系圖顯示, 圓口銅魚線粒體DNA單倍型的網絡進化關系呈星狀分布,Hap12屬于較原始單倍型和進化中心, 不存在顯著的地理分布格局, 但呈現出3個較明顯的單倍型譜系分支(Clade 1、Clade 2和Clade 3; 圖 3), 每個譜系分支均涉及4個不同地理群體, 系統發育樹上也得到相應的支持。Clade 1包括36個單倍型172個個體(占所有樣本的43.7%), 其中金安橋JAQ群體、龍開口LKK群體、巧家QJ群體和屏山PS群體分別占該分支所有個體的比例為29.1%、40.1%、27.3%和3.5%; Clade 2包括27個單倍型106個個體(占所有樣本的27.0%), 其中金安橋JAQ群體、龍開口LKK群體、巧家QJ群體和屏山PS群體分別占該分支所有個體的比例為41.5%、23.6%、32.1%和2.8%; Clade 3包括28個單倍型115個個體(占所有樣本的29.3%),其中金安橋JAQ群體、龍開口LKK群體、巧家QJ群體和屏山PS群體分別占該分支所有個體的比例為51.3%、26.1%、17.4%和5.2%。其中分支Clade 1、Clade 2和Clade 3的內部遺傳距離均為0.002, 分支Clade 1與Clade 2、Clade 3之間的遺傳距離分別為0.006和0.009, Clade 2 和Clade 3之間的遺傳距離為0.008。經估算, 出現Clade 1譜系分支的時間大約在3.66 Ma, 出現Clade 2和Clade 3譜系分支的時間大約在2.93 Ma。

2.4 群體遺傳結構

基于串聯基因序列, BAPS分析結果顯示圓口銅魚所有個體聚為3支更為合適(圖 4), 此時log(marginal likelihood, ML)值為-2213.8949。

AMOVA分析結果顯示, 在不分組的情況下圓口銅魚線粒體DNA的遺傳變異主要來自地理群體內的遺傳變異(占96.62%), 地理群體間的遺傳變異較小, 僅占3.38%; 在分成3個單倍型譜系分支的組別情況下, 圓口銅魚線粒體DNA的遺傳變異主要來自譜系分支之間(占81.29%), 譜系分支內部的遺傳變異僅為18.71%(表 3)。圓口銅魚不同地理群體兩兩之間的遺傳分化指數(Fst)范圍為-0.008—0.045(表 4), 所有群體間Fst值均小于0.05, 而且除屏山群體與其他群體間Fst值未達到顯著水平外, 其余兩兩群體間Fst值均達到顯著水平(P＜0.05)。針對3個不同譜系分支, 兩兩之間的Fst值均大于0.25, 其中譜系Clade 1與Clade 2、Clade 1與Clade 3、Clade 2與Clade 3之間的Fst值分別為0.759、0.847和0.805, 均達到顯著水平(P＜0.001)。

2.5 種群歷史動態分析

核苷酸錯配分析發現, 所有地理群體均呈現多峰分布(表 5)。除圓口銅魚屏山群體外,SSD和Hri檢驗結果顯示其他地理群體均未顯著偏離群體擴張模型(P＞0.05)。中性檢驗結果顯示, 所有地理群體的Tajima’sD值均未達到顯著水平(P＞0.05);Fu’sFs檢驗結果顯示, 圓口銅魚混合群體和金安橋群體均呈現顯著負值(P＜0.02), 龍開口群體和巧家群體均呈現不顯著負值(P＞0.02)。

BSP分析了有效種群大小隨溯祖時間的動態變化曲線, 結果顯示除屏山群體未檢測到明顯的種群擴張現象外, 其他群體均在0.0004—0.0007 Ma期間存在擴張現象(圖 5)。

圖 2 基于串聯基因序列的圓口銅魚單倍型間的ML系統發育樹Fig. 2 Maximum likelihood (ML) phylogenetic tree of Coreius guichenoti based on concatenated haplotype sequences of gene Cyt b and COⅠ

3 討論

3.1 金沙江中下游圓口銅魚的遺傳多樣性和種群分化

單倍型多樣性和核苷酸多樣性是衡量一個物種群體DNA變異程度的重要指標, 也是評價種群遺傳多樣性的重要指標。在本研究中, 金沙江中下游江段圓口銅魚的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.936和0.00489, 不同地理群體之間差異不明顯, 這2個多樣性指標分別處于≥0.5、＜0.5%的水平[42], 即高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性水平,表明金沙江中下游江段圓口銅魚歷史上可能受瓶頸效應影響后種群數量發生了迅速擴張。與袁希平等[22]針對長江干流川江段圓口銅魚開展了線粒體控制區序列研究結果相比, 在本研究中金沙江中下游江段圓口銅魚單倍型多樣性處于與長江干流川江段相似水平, 而核苷酸多樣性則比宜賓江段(0.0083)要低, 與其他江段相比則處于相似水平; 與Cheng等[25]金沙江屏山江段圓口銅魚COⅠ基因序列研究結果相比, 本研究中圓口銅魚屏山群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性都要高。與同屬的銅魚(Coreius heterodon)[22]相比, 本研究中金沙江中下游江段圓口銅魚核苷酸多樣性和單倍型多樣性稍高; 與同亞科的魚類相比, 圓口銅魚的單倍型多樣性與蛇鮈(Saurogobio dabryi)類似, 比銀鮈(Squalidus argentatus)、花?(Hemibarbus maculatus)和棒花魚(Abbottina rivularis)要高, 圓口銅魚的核苷酸多樣性與銀鮈類似, 比蛇鮈和花?要低, 比棒花魚要高得多[43]; 而與同為鯉科非同一個亞科的魚類相比, 圓口銅魚與赤水河半?(Hemiculterella sauvagei)[44]的核苷酸多樣性和單倍型多樣性水平相似, 比嘉陵裸裂尻魚(Schizopygopsis kialingensis)[45]的核苷酸多樣性稍低, 單倍型多樣性則稍高。總體而言, 金沙江中下游的圓口銅魚處于高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的模式。

表 2 金沙江中下游圓口銅魚不同群體的遺傳多樣性信息Tab. 2 Genetic diversity of Coreius guichenoti at different locations of the middle and lower reaches of the Jinsha River based on the concatenated sequences of gene Cyt b and CO I

Balloux和Lugon-Moulin認為當Fst值在 0—0.05時, 表示低等水平的遺傳分化; 當在 0.05—0.15時, 表示中等水平的遺傳分化; 當在 0.15—0.25時,表示高度的遺傳分化; 當大于0.25時, 表示極大的遺傳分化[46]。本研究中金沙江中下游圓口銅魚不同地理群體間的遺傳分化指數均小于0.05, 處于低等分化水平。這表明, 金沙江中下游水域的圓口銅魚尚未出現明顯的地理分布格局, 這可能與圓口銅魚產漂流性卵等生活史特征有關, 盡管目前金沙江中下游已被梯級水電站的大壩阻隔形成多個小生境, 但由于阻隔年限尚短, 尚不足以引起圓口銅魚不同地理群體的遺傳分化。金沙江中下游水域的圓口銅魚雖未出現明顯的地理分布格局, 但不同地理群體內部均分布有自己獨有的單倍型, 如基于串聯基因序列分析時, 金安橋群體、龍開口群體、巧家群體和屏山群體的獨有單倍型數占各自群體內總單倍型數的比例分別為58.2%、43.6%、47.1%和16.7%。因此, 需要注意的是, 目前圓口銅魚金沙江中下游不同地理群體間的遺傳分化低并不意味著分化程度可以被忽視, 由于大壩阻隔帶來的長期效應在進化史上將會對金沙江中下游圓口銅魚造成巨大的影響, 必須時刻關注。

表 3 金沙江中下游圓口銅魚的分子方差分析Tab. 3 Analysis of molecular variance analysis among locations of Coreius guichenoti from the middle and lower reaches of the Jinsha River based on the concatenated sequences of gene Cyt b and CO Ⅰ

表 4 基于串聯序列金沙江中下游圓口銅魚不同地理群體的遺傳分化系數（Fst）Tab. 4 Pairwise Fst values among different locations of Coreius guichenoti from the middle and lower reaches of the Jinsha River based on the concatenated sequences of gene Cyt b and COⅠgenes

表 5 金沙江中下游圓口銅魚不同地理群體的中性檢驗和錯配分析Tab. 5 Neutrality tests and mismatch distribution values for all locations of Coreius guichenoti from the middle and lower reaches of the Jinsha River based on the concatenated sequences of gene Cyt b and COⅠgenes

另一方面, 從BAPS分析、分子系統發育樹和單倍型網絡關系圖等均可以看出, 金沙江中下游江段圓口銅魚呈現出3個明顯的線粒體DNA單倍型譜系分支, 這也得到了AMOVA和Fst分析結果的支持。而且不管樣本量的多少, 各個不同地理群體內部均同時存在3個譜系分支, 只是各分支在不同群體內所占比例稍有差異。其中, 金安橋群體中3個譜系分支所占比例相差不多, Clade 1、Clade 2和Clade 3分別占32.7%、28.7%和38.6%; 龍開口群體和屏山群體中均是譜系分支Clade 1和Clade 3占大多數, 分別占79.8%和80%; 而巧家群體則是譜系分支Clade 1和Clade 2占大多數, 為80.2%。總的來說,在圓口銅魚進化過程中, Clade 1為較原始譜系, 由Clade 1逐漸衍射出兩個譜系分支Clade 2和Clade 3,且3個譜系分支之間已呈現極大的遺傳分化水平。

圖 3 基于串聯基因序列的圓口銅魚單倍型進化網絡關系圖Fig. 3 The haplotype network of Coreius guichenoti based on the concatenated haplotype sequences of gene Cyt b and COⅠ

圖 4 基于聯合基因Cyt b和COⅠ序列的圓口銅魚BAPS聚類分析結果圖Fig. 4 Bayesian analysis of population structure of Coreius guichenoti based on clustering with linked loci for both Cyt b and COⅠ gene.Each color represents a separate genetic cluster, and each bar represents an individual

事實上, 關于圓口銅魚野生群體的遺傳多樣性和遺傳分化水平已開展諸多研究, 但大部分研究均基于微衛星標記開展[20,21,23,24,26], 僅有袁希平等[22]針對長江干流川江段圓口銅魚開展了線粒體控制區序列和微衛星標記雙重分析, 以及Cheng等[25]針對金沙江屏山江段圓口銅魚開展了COⅠ基因序列分析。這些研究涉及的樣本來源江段主要包括金沙江觀音巖江段、攀枝花江段、巧家江段、永善江段和屏山江段、長江干流川江段、長江中游宜昌江段、雅礱江金河江段等, 均不涉及本研究中的金安橋群體和龍開口群體。這些研究結果顯示出不同江段圓口銅魚野生群體的遺傳多樣性水平均較高, 但均未出現明顯的地理種群分化, 這也和本研究的結果是基本一致的。

3.2 金沙江中下游圓口銅魚的種群歷史動態

在種群歷史動態分析中涉及諸多方法, 如Tajima’sD值和Fu’sFs值等中性檢驗方法、核苷酸錯配分布情況、SSD和Hri檢驗、BSP圖等。在一般情況下, 核苷酸錯配分布呈現光滑單峰, 且SSD和Hri檢驗未顯著偏離種群擴張模型, Tajima’sD值和Fu’sFs值呈顯著負值時, 被認為種群在歷史上有擴張跡象[35—37,47,48]。盡管從不同地理群體來看, 在本研究中種群歷史動態分析各方法的結果稍有差異。但總體來說, 除屏山群體外, 圓口銅魚金沙江中下游金安橋群體、龍開口群體、巧家群體和混合群體在近期均可能發生過擴張跡象。因此, 圓口銅魚金沙江中下游群體在近期是可能發生過種群擴張的。

圖 5 金沙江中下游圓口銅魚不同群體的種群動態隨時間變化的BSP圖Fig. 5 Bayesian skyline plots (BSP) for population dynamics with time of Coreius guichenoti in the middle and lower reaches of the Jinsha River實線表示平均值, 虛線表示95%置信區間上限, 雙點劃線表示95%置信區間下限Solid lines indicate median values, dotted lines indicate 95% upper confidence interval, and long dash double dotted lines indicate 95%lower confidence interval

研究表明, 冰川演化在金沙江河谷形成中發揮了重要作用, 其中經歷了最重要的4次冰期分別為中更新世早期的玉龍冰期(0.7—0.6 Ma)、中更新世中期的干海子冰期(0.53—0.45 Ma)、中更新世晚期的麗江冰期(0.31—0.13 Ma)和晚更新世中晚期的大理冰期(0.12—0.01 Ma)[49], 還經歷了全新世的現代小冰川時期(0.01—0 Ma)[50]。通過估算獲得圓口銅魚不同群體發生擴張的時間約在0.0004—0.0007 Ma左右, 即14—17世紀左右, 處于全新世的現代小冰川時期, 是距今最近一次冰川頻繁波動的時期[50]。圓口銅魚3個不同線粒體DNA譜系分支的分化時間大約在3.66—2.93 Ma, 處于青藏高原隆起, 鶴慶等盆地下陷時期。晚更新世以來, 受氣候冷暖變化和冰川作用等影響, 金沙江河谷發育經歷了“下切-滑坡-堰塞-堆積-下切”等復雜過程, 冰川退縮, 河流逐漸發育成不同階地[51], 從而對河流中的生物種群的進化產生影響。因此, 結合本研究圓口銅魚金沙江中下游群體發生擴張的估算時間等信息, 說明全新世小冰川時期冰川的演化和青藏高原隆升在金沙江圓口銅魚種群歷史動態方面發揮了重要影響作用。

3.3 金沙江圓口銅魚的保護

魚類種群遺傳結構和譜系系統地理格局的研究可為物種保護和管理措施的制定提供科學依據。本研究結果表明, 金沙江中下游圓口銅魚的單倍型多樣性水平總體較為豐富, 但核苷酸多樣性水平較低。近些年來, 由于受人類活動的影響, 圓口銅魚的野生資源量衰退嚴重, 而且隨著金沙江中下游梯級水利工程的修建完成, 其棲息地被片段化,棲息環境被破壞, 洄游通道被阻斷, 其受威脅程度將會持續加劇。目前, 已有多個水電工程將圓口銅魚列為增殖放流對象, 多家科研單位對圓口銅魚人工馴養與繁殖技術開展攻關研究, 并取得了突破性進展。增殖放流工作一旦開展, 勢必會對自然種群的遺傳管理產生影響。因此, 為了更好地保護圓口銅魚資源, 應給予金沙江中下游圓口銅魚3個線粒體DNA譜系分支特別關注, 后續可在增加該物種的生物學特征和核基因多樣性等數據的基礎上, 綜合分析后確立金沙江中下游圓口銅魚的進化顯著單元(Evolutionarily Significant Units, ESUs)和管理單元(Management Units, MUs)等保護單元。目前, 在進行增殖放流時, 應提前做好親魚和放流仔魚個體的遺傳背景檔案的建立, 有助于更好的管理圓口銅魚自然種群的遺傳多樣性。同時, 還應加強對養殖圓口銅魚線粒體DNA序列的檢測, 建立親魚和子代線粒體DNA基因庫, 便于采用來自不同譜系分支的親魚進行繁殖以確保養殖圓口銅魚遺傳多樣性不降低, 充分保存不同譜系分支的圓口銅魚資源。