甘肅銓水掌葉大黃的HPLC 譜效研究?

馬琴國(guó)，劉效栓，羅燕燕，張中華，王引權(quán)，劉東玲

1 甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2 甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地；3 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)；4 西北中藏藥協(xié)同創(chuàng)新中心

大黃為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.、唐古特大黃Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃Rheum officinaleBaill. 的干燥根及根莖。不同來(lái)源的大黃，化學(xué)成分組成比例及療效往往不盡相同［1-4］。不同產(chǎn)區(qū)大黃在各類功效組分含量方面存在差異，而建立譜效圖［5-6］，能更準(zhǔn)確地反映中藥材和中藥飲片的藥效特點(diǎn)。現(xiàn)代藥理研究［7-11］表明，大黃的瀉下成分主要為結(jié)合蒽醌類和雙蒽酮類化合物，故筆者以瀉下活性成分為指標(biāo)建立大黃的高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）圖譜，對(duì)大黃質(zhì)量特征進(jìn)行究［12］。筆者在研究大黃瀉下成分的基礎(chǔ)上，針對(duì)銓水大黃的指紋圖譜進(jìn)行研究，旨在為甘肅道地藥材銓水掌葉大黃的質(zhì)量控制及臨床合理用藥提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器高效液相色譜儀（Waters，1525 泵，717，2487 雙通道紫外檢測(cè)器Breeze），AR124CN 型電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司），SB-3200D型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥番瀉苷-A（成都普瑞法科技有限公司，批號(hào)：PRF7111501，純度≥98%）大黃酚8-o-葡萄糖苷（成都普瑞法科技有限公司，批號(hào)：BP0350，純度≥98%），番瀉苷-B（成都普瑞法科技有限公司，批號(hào)：BP1293，純度≥98%），大黃酸8-o-β-D 葡萄糖苷（成都普瑞法科技有限公司，批號(hào)：BP1527，純度≥98%），大黃素8-o-β-D 吡喃葡萄糖（成都普瑞法科技有限公司，批號(hào)：BP0534，純度≥98%），色譜純乙腈（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20160505），色譜純磷酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20160307），色譜純無(wú)水乙醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20160905）。大黃試樣：樣品12 批大黃藥材，分別從甘肅禮縣10 個(gè)鄉(xiāng)采集所得，樣品信息見(jiàn)表1。

表1 大黃藥品采樣表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：Symmetry C18柱，甲醇為流動(dòng)相A，0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相B，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm，流速1 mL/min，梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 梯度洗脫程序

2.2 混合對(duì)照品溶液制備精密稱取對(duì)照品番瀉苷A 1.42 mg、用0.1% 的NaHCO3溶液溶解，并定容至10 mL 容量瓶中，得到0.142 mg/mL 的番瀉苷A對(duì)照品。精密稱取對(duì)照品番瀉苷B 0.001 9 g，用70%的甲醇溶解，定容至25 mL容量瓶，得到0.076 mg/mL的番瀉苷B 對(duì)照品，精密稱取對(duì)照品大黃素-8-β-吡喃葡萄糖苷0.000 43 g，用甲醇溶解，定容至5 mL 容量瓶，得到0.086 mg/mL 的大黃素-8-β-吡喃葡萄糖苷對(duì)照品溶液。精密稱取對(duì)照品大黃酸-8-o-D-β-葡萄糖苷0.000 43 g，用甲醇溶解，定容至5 mL容量瓶，得到0.15 mg/mL的大黃酸-8-o-D-β-葡萄糖苷對(duì)照品溶液。精密稱取對(duì)照品大黃酚-8-o-葡萄糖苷0.000 38 g，用甲醇溶解，定容至5 mL 容量瓶，得到0.076 mg/mL 的大黃酚-8-o-葡萄糖苷對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述大黃素-8-β-吡喃葡萄糖苷、大黃酸-8-o-D-β-葡萄糖苷、大黃酚-8-o- 葡萄糖苷、溶液2.0 mL，得0.017 2、0.030 0、0.015 2 mg/mL 的混合對(duì)照品。另精密番瀉苷A 1.0 mL，番瀉苷B 1.0 mL，至10 mL容量瓶中，用70% 的乙醇定容，得質(zhì)量濃度分別為0.014 2、0.007 6 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液，4℃冰箱避光保存。

2.3 供試品溶液制備將新鮮大黃（1～10 號(hào)）樣品用熏干法干燥，粉碎，過(guò)65 目篩。取大黃粉末約200 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，靜置12 h，60℃超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得大黃粉末70% 乙醇溶液。將大黃乙醇溶液用乙醚脫脂后，定容至10 mL容量瓶，得醇提供試品。另取大黃粉末約200 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入0.1%NaHCO325 mL，密塞，稱定重量，靜置12 h，60℃超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得大黃粉末0.1%NaHCO3溶液。將大黃乙醇溶液用乙醚脫脂萃取后，定容至10 mL 容量瓶，得0.1%NaHCO3提取供試品。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)取混合對(duì)照品溶液，供試品溶液在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，結(jié)果分離度良好，見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品色譜圖

2.5 精密度試驗(yàn)精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次。番瀉苷A、番瀉苷B、大黃素-8-β-吡喃葡萄糖苷、大黃酸-8-o-D-β-葡萄糖苷、大黃酚-8-o-葡萄糖苷的進(jìn)樣量分別為：0.142、0.076、0.172、0.300、0.228 μg；以（1號(hào)峰）為參照，其他共有峰相對(duì)保留時(shí)間按公式：γi，計(jì)算，共有峰相似度達(dá)到1.000。相對(duì)保留時(shí)間RSD及峰面積RSD。見(jiàn)表3。

表3 精密度試驗(yàn)

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，分別在0、6、12、18、24 h 進(jìn)樣10 μL，檢測(cè)色譜圖，對(duì)其中的特征色譜峰進(jìn)行分析，所得特征峰的峰面積RSD 均＜3%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均＜2%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。見(jiàn)表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品（批號(hào)：20160905）6 份，約200 mg，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備6 份，分別進(jìn)樣10 μL，檢測(cè)色譜圖，結(jié)果大黃素-8-β-葡萄糖苷、番瀉苷A、大黃酚-8-o-葡萄糖苷、番瀉苷B、大黃素-8-β-吡喃葡萄糖苷的平均含量分別為：65.40、17.94、2.97、26.05、5.92 mg/g，峰面積RSD 均＜3%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均＜1%，相似度1.000，符合指紋圖譜要求。見(jiàn)表5。

表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 指紋圖譜的分析按照中藥指紋圖譜要求，檢測(cè)10 批樣品，其所有成分在90 min 內(nèi)全部出完，見(jiàn)圖2；采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（2012.130723 版本），將10 批樣品HPLC 圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件，進(jìn)行相似度分析，生成對(duì)照?qǐng)D譜（R），以大黃素苷（1 號(hào)峰）為參照，共有峰的保留時(shí)間、相對(duì)保留時(shí)間、峰面積百分比。見(jiàn)表6、圖3。

圖2 樣品色譜圖

圖3 10批甘肅禮縣銓水掌葉大黃HPLC指紋圖譜及對(duì)照指紋圖譜

表6 禮縣掌葉大黃指紋圖譜技術(shù)參數(shù)

續(xù)表6

2.9 相似度評(píng)價(jià)以S1 樣品的指紋圖譜作為參照?qǐng)D譜，以平均數(shù)法生成10批樣品的對(duì)照指紋圖譜；10 批樣品與對(duì)照指紋圖譜相似度分別為0.943，0.927，0.947，0.923，0.793，0.798，0.906，0.828，0.798，0.928，即：相似度在0.8～0.9 之間。非公有峰面積在20%。10 批掌葉大黃的選擇了共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD 為0.801%～1.727%，相對(duì)峰面積的RSD 為28.87%～123.04%。說(shuō)明10 個(gè)樣品組成成分較為一致，但各成分的含量差異較大。

3 討論

本試驗(yàn)首次以掌葉大黃中的瀉下活性成分大黃酸-8-o-D-β-葡萄糖苷、番瀉苷A、大黃酚-8-o-葡萄糖苷、番瀉苷B、大黃素-8-β-吡喃葡萄糖苷為參照，應(yīng)用HPLC，初步研究了甘肅道地藥材掌葉大黃藥效圖譜，這種藥效相關(guān)聯(lián)的中藥圖譜可為中藥大黃質(zhì)量控制以及大黃合理應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。從掌葉大黃指紋圖譜可以看出，番瀉苷A，番瀉苷B 的峰面積總和遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于大黃酸-8-o-Dβ-葡萄糖苷、大黃酚-8-o-葡萄糖苷、大黃素-8-β-吡喃葡萄總和，番瀉苷A 的峰面積分別與大黃酸-8-o-D-β-葡萄糖苷、大黃酚-8-o-葡萄糖苷、大黃素-8-β-吡喃葡萄的峰面積比值為0.12、0.21、0.37。番瀉苷B 的峰面積分別與大黃酸-8-o-Dβ-葡萄糖苷、大黃酚-8-o-葡萄糖苷、大黃素-8-β-吡喃葡萄的峰面積比值為0.10、0.18、0.32。在大黃瀉下作用中，二蒽醌苷類所做的貢獻(xiàn)有可能大于雙蒽酮苷類（番瀉苷類），這有待于量效關(guān)系的進(jìn)一步明確研究。禮縣銓水掌葉大黃的瀉下作用指紋圖譜與唐古特大黃、藥用大黃圖譜的差異，有待進(jìn)一步研究。

有研究表明［4］，種植掌葉大黃中番瀉苷的總量低于野生大黃的番瀉苷總量。禮縣銓水掌葉大黃中番瀉苷A，番瀉苷B 峰面積小，在瀉下功效成分中所占比率小，可能是因產(chǎn)地、生態(tài)環(huán)境不同。番瀉苷不耐熱，在產(chǎn)地加工和煎煮過(guò)程中，其含量都會(huì)受影響，因此干燥溫度、煎煮溫度控制會(huì)影響番瀉苷A、B 的含量。將來(lái)可以考察不同干燥溫度對(duì)大黃番瀉苷的影響。有研究報(bào)道，禮縣銓水掌葉大黃的番瀉苷含量低于唐古特大黃的番瀉苷含量。大黃酸-8-o-D-β-葡萄糖苷、大黃酚-8-o-葡萄糖苷、大黃素-8-β-吡喃葡萄的含量差別未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)主要以禮縣銓水掌葉大黃為研究對(duì)象，不同產(chǎn)地產(chǎn)地指紋圖譜的大黃指紋圖譜差異有待進(jìn)一步考察。筆者利用紫外分光光度法選擇最大吸收波長(zhǎng)，最大吸收波長(zhǎng)選擇237 nm。在本試驗(yàn)中，番瀉苷A 不容易溶于溫水或乙醇，所以用0.1%的NaHCO3配置對(duì)照品溶液。根據(jù)對(duì)照品的溶解實(shí)驗(yàn)，在對(duì)供試品的處理中，使用0.1% 的NaHCO3溶液，溫度控制在60攝氏度，盡可能對(duì)供試品中的番瀉苷A、番瀉苷B 提取完全，盡可能防止因溫度過(guò)高而分解。