蛋白質強化對發(fā)酵乳品質和風味特性的影響

姚夢柯，張敏，羅天淇，韓驍默，向蕙，馮文穎，陳雅璐，楊貞耐

（北京工商大學食品與健康學院，北京 100048）

0 引 言

發(fā)酵乳是以牛乳為主要原料，經兩種或兩種以上的乳酸菌發(fā)酵后形成的一種具有獨特風味且營養(yǎng)豐富的發(fā)酵乳制品[1-2]。發(fā)酵乳的外觀和組織狀態(tài)是影響其質量和消費者接受度的重要因素，但是發(fā)酵乳在冷藏過程中易發(fā)生乳清析出、凝乳分散等質量問題，一定程度上影響其市場銷售[3]。目前，通常通過添加多糖類增稠劑如卡拉膠、黃原膠等，以及添加脫脂乳粉、乳蛋白等改善發(fā)酵乳的品質，但是有關不同種類乳蛋白對發(fā)酵乳品質及風味特性影響的研究相對較少。

據(jù)報道，發(fā)酵乳經蛋白質強化后具有更緊密的組織結構，并且乳清析出減少，發(fā)酵乳的彈性模量和黏性模量顯著提高，有利于形成強凝膠網絡[4-6]。同時，蛋白質對發(fā)酵乳風味的形成具有重要影響。發(fā)酵乳的風味取決于乳酸菌發(fā)酵過程中生成的乳酸及揮發(fā)性物質[7-9]。Bierzuńska等發(fā)現(xiàn)添加聚合乳清蛋白的酸乳保水性、內聚性和黏度指數(shù)均明顯提高，并且奶香味增加了2.5倍，飲用后還具有類似香草布丁的后味[10]。蛋白質在蛋白酶作用下可以形成小分子肽和游離氨基酸，從而賦予食品不同的滋味[11-12]。呈味肽可以賦予或影響食品酸味、甜味、苦味、咸味、鮮味以及濃厚感[13]。同時游離氨基酸可以進一步轉化為各種風味化合物如α-酮酸、α-羥基酸，醛、醇、酰基-CoA、羧酸、酯或硫酯、乙醛等[14]。此外，乳蛋白能夠與一些風味化合物結合，如α-乳白蛋白能與醛類、甲基酮結合，乳清分離蛋白與2-壬酮具有高親和力，酪蛋白的存在能顯著降低丙酮、乙醛的揮發(fā)程度。Kühn等[15]指出，牛血清白蛋白（BSA）是最易結合揮發(fā)性風味化合物的牛乳蛋白，其次是β-乳球蛋白；而且BSA對牛乳奶香味的重要來源物質即雙乙酰的親和力非常高，牛乳中BSA的含量過多還可能引起奶香味不足等風味缺陷。

本研究采用目前常用的3種乳蛋白即酪蛋白酸鈉、乳清蛋白和乳蛋白濃縮物，制備乳蛋白強化發(fā)酵乳，研究比較其發(fā)酵質構和微流變特性變化，并采用固相微萃取-氣相-質譜聯(lián)用技術，分析比較不同乳蛋白對發(fā)酵乳風味的影響，為進一步改善發(fā)酵乳的品質提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

全脂乳粉，新西蘭恒天然有限公司；酪蛋白酸鈉（SC），新西蘭恒天然有限公司；濃縮乳清蛋白（WPC-80），寧夏塞尚乳業(yè)；乳蛋白濃縮物（MPC-70），寧夏塞尚乳業(yè)；發(fā)酵劑YO-MIX 300 LYO，丹麥Danisco公司。

1.2 儀器與設備

Nova-Safety高壓蒸汽滅菌鍋，日本Sanyo公司；DHP-9032電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；iCinac乳品發(fā)酵監(jiān)控儀，法國AMS Alliance公司；CT 3質構儀，美國Brookfield公司；S-4800掃描電子顯微鏡，日本Hitachi公司；Rheolaser Master光學微流變儀，法國Formulaction公司；7890A-7000氣相色譜-質譜聯(lián)用，美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵乳的制備

使用全脂乳粉制備質量分數(shù)（后同）為12%的復原乳，作為對照組K，實驗組在12%全脂乳粉基礎上添加酪蛋白酸鈉、WPC-80、MPC-70，分別使蛋白含量增加0.5%、1%、1.5%，編號依次為L0.5、L1、L1.5、R0.5、R1、R1.5、M0.5、M1、M1.5。將上述復原乳在65℃條件下殺菌30 min，冷卻至室溫，加入商業(yè)發(fā)酵劑YO-MIX 300 LYO，42℃發(fā)酵至p H值為4.5后冷卻，置于4℃后熟24 h后進行相關指標測定。

1.3.2 發(fā)酵過程中的p H值測定

采用乳品發(fā)酵監(jiān)控儀監(jiān)測發(fā)酵過程中pH值變化，冷藏期的p H值使用p H計進行測定并記錄。

1.3.3 發(fā)酵乳流變和質構性質的測定

取20 mL發(fā)酵乳至微流變儀檢測槽中，測定發(fā)酵乳在1 Hz下的彈性模量（G'）和黏性模量（G''）。參考龐志花等[16]的方法，使用質構儀進行質地剖面分析（texture profile analysis，TPA）。使用TA10探頭，目標值10.0 mm，觸發(fā)點負數(shù)5.0 g，測試速率0.5 mm/s。測定參數(shù)：硬度、內聚性、膠著性。質構儀測定硬度、黏力、彈性、膠著性，微流變儀全頻率掃描測定發(fā)酵后發(fā)酵乳的G'、G''。

1.3.4 發(fā)酵乳掃描電鏡觀察

選擇發(fā)酵乳K、L1.5、R1.5、M1.5，切割成小塊，加入p H值為6.8的2.5%戊二醛溶液中固定并置于4℃過夜；液氮冷凍后，用刀片切斷橫截面；使用p H值為6.8的磷酸緩沖液3次沖洗；分別用30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇脫水，每次15 min其中100%乙醇使用3次，其它濃度各1次；用氯仿脫脂2 h；之后用100%乙醇10 min、100%乙醇∶叔丁醇=1∶1（體積比）、純叔丁醇各浸泡6 min。冷凍干燥后進行觀察。

1.3.5 發(fā)酵乳揮發(fā)性風味物質測定

采用固相微萃取法（solid phase micro extraction，SPME）吸附揮發(fā)性風味物質，氣相色譜-質譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）檢測風味物質。樣品處理：取10 g發(fā)酵乳樣品于30 mL萃取瓶中，并加入1μL內標物2-甲基-3-庚酮（0.816μg/μL）作為內標，40℃恒溫水浴平衡30 min，SPME纖維頂空吸附30 min，解吸附5 min。GC條件：采用DB-wax色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）不分流進樣，載氣為He，流速1.2 mL/min。升溫程序：40℃（保持3 min），5℃/min升溫至200℃，10℃/min升溫至230℃并保持3 min。MS條件：電子電離源，電子能量70 eV，傳輸線溫度280℃，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，質量掃描范圍40～250（m/z）。定性分析：化合物通過質譜數(shù)據(jù)庫鑒定和保留指數(shù)法（retention index，RI）來進行風味物質定性。定量分析：采用內標法進行風味物質的定量分析。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

每個樣品至少測定3次，采用EXCEL2019、CANOCO 4.5、SPSS 17.0和Origin Pro2017軟件進行分析和作圖，風味物質用NIST 14譜庫檢索。相似度分析方法參考王淑慧等[17]的改進Nei系數(shù)法。

2 結果與分析

2.1 不同乳蛋白強化發(fā)酵乳發(fā)酵過程中的p H值變化

不同乳蛋白強化發(fā)酵乳在發(fā)酵過程中的p H值的變化如圖1所示，從圖中可以看到各組發(fā)酵乳p H值的變化趨勢相同，但到達發(fā)酵終點p H=4.5的時間存在顯著差異，分布在280～360 min之間。整體上酪蛋白酸鈉、濃縮乳清蛋白、乳蛋白濃縮物的添加量越大，發(fā)酵所需時間越長，這可能與這些蛋白添加物增強了乳液的緩沖能力有關，使得p H值下降不明顯[18]，也有研究認為牛乳中乳糖、酪蛋白的含量及其比例是影響發(fā)酵乳發(fā)酵時間的重要因素[19]。此外，3種乳蛋白產品相比較，酪蛋白酸鈉對發(fā)酵速率的影響最小，乳蛋白濃縮物次之，濃縮乳清蛋白對發(fā)酵速率的影響最大。

圖1 添加不同乳蛋白的牛乳在發(fā)酵過程中的pH值變化

2.2 不同乳蛋白強化發(fā)酵乳的質構特性

表1是不同乳蛋白強化發(fā)酵乳發(fā)酵結束后的質構特性。由表1可知，除了濃縮乳清蛋白會引起發(fā)酵乳膠著性的降低外，整體上3種乳蛋白產品用于蛋白強化均能增加發(fā)酵乳的硬度、黏力、彈性和膠著性，并且隨著添加量的增加而增加。這可能是由于添加蛋白形成的膠束結合蛋白復合物和可溶性蛋白復合物[20]參與蛋白質網絡的蛋白質數(shù)量增加[21]增強了發(fā)酵乳體系的凝膠結構，從而增加了酸奶的硬度和黏度[22]。其中，添加酪蛋白酸鈉對發(fā)酵乳這些質構特性的影響最大，并且增加幅度顯著高于其他兩種乳蛋白產品（P<0.05）；而濃縮乳清蛋白對發(fā)酵乳質構特性的影響最小，且不同濃度濃縮乳清蛋白添加量對發(fā)酵乳的質構特性無顯著性影響（P>0.05）；乳蛋白濃縮物介于二者之間，且酪蛋白酸鈉與乳蛋白濃縮物的添加量為1.5%時，對發(fā)酵乳的質構特性影響最為顯著。Akalm等[23]使用脫脂乳粉、酪蛋白酸鈉、濃縮乳清蛋白以及酪蛋白酸鈉和濃縮乳清蛋白的混合物對益生菌發(fā)酵乳進行強化，發(fā)現(xiàn)酪蛋白酸鈉最有效地提高發(fā)酵乳的硬度和膠著性，其次是酪蛋白酸鈉和濃縮乳清蛋白的混合物，然后是濃縮乳清蛋白，與本實驗結果相同。

表1 強化不同乳蛋白的發(fā)酵乳的質構特性

2.3 不同乳蛋白強化發(fā)酵乳的微流變特性

酸奶是由酪蛋白聚集體和乳脂肪球組成的顆粒分散體系，這種分散體系中的顆粒相互作用是其流變性質的原因[24]。圖2、圖3是乳蛋白強化發(fā)酵乳發(fā)酵結束后的流變特性（G'：彈性模量，G''：黏性模量）。一般認為發(fā)酵乳的G'與凝膠網絡的剛度有關，反映了凝膠的類固體特性，而G''與發(fā)酵乳的黏性成分有關，反映了凝膠的類液體特性[25]。從圖中可以看到，發(fā)酵乳的G'、G''隨著掃描頻率的增加而增大，當掃描頻率小于10 Hz左右時，G'>G''，發(fā)酵乳中彈性成分占優(yōu)勢，表現(xiàn)出類固體的特征，而掃描頻率更大時G'

圖2 不同乳蛋白強化發(fā)酵乳的彈性模量

圖3 不同乳蛋白強化發(fā)酵乳的黏性模量

2.4 不同乳蛋白強化發(fā)酵乳的掃描電鏡觀察

由于不同蛋白在1.5%的添加量時對發(fā)酵乳各方面影響最為顯著，因此選用添加量為1.5%的發(fā)酵乳作為代表進行掃描電鏡觀察。圖4是K、L1.5、R 1.5、M 1.5 4組發(fā)酵乳在5 000和20 000放大倍數(shù)下的掃描電鏡圖。從圖中可以看到，對照組K呈現(xiàn)出典型的網狀結構，存在較大孔隙，說明凝膠穩(wěn)定性較弱；使用酪蛋白酸鈉強化的發(fā)酵乳L1.5的微觀結構相比對照組，酪蛋白組成的網狀結構更加粗大；使用濃縮乳清蛋白強化的發(fā)酵乳R 1.5的微觀結構變得更加致密，孔隙被蛋白聚集體填充而大量減少，網狀結構的骨架也變得纖細。這可能是由于變性的β-乳球蛋白與酪蛋白之間的相互作用所致，凝膠通過乳清蛋白聚集網絡連接，從而導致孔隙變小[28]；而使用乳蛋白濃縮物強化的發(fā)酵乳M 1.5的微觀結構變化與酪蛋白酸鈉相似。整體上濃縮乳清蛋白強化引起的微觀結構變化明顯，而酪蛋白酸鈉和乳蛋白濃縮物引起的差異較小。M arafon等[29]發(fā)現(xiàn)，未經強化的酸奶微觀結構顯示出大量均勻分布的大孔，而酪蛋白酸鈉和濃縮乳清蛋白強化的酸奶微觀結構顯示出更緊湊的蛋白質基質，孔隙變少，且使用濃縮乳清蛋白強化的樣品微觀結構致密性較差。Puvanenthiran等[30]在酸奶樣品中觀察到隨著乳清蛋白比例的增加，凝膠網絡變得更細，孔隙更小，交聯(lián)網絡變得更緊密。Zhihua Pang等[31]也發(fā)現(xiàn)，通過乳清蛋白分離物的強化，酸奶凝膠呈絲狀結構，而酪蛋白酸鈉強化組與未強化樣品相比，結構差異不顯著。

圖4 不同乳蛋白強化發(fā)酵乳的掃描電鏡圖

2.5 不同乳蛋白強化發(fā)酵乳的風味物質分析

2.5.1 SPME-GC-MS檢測結果

通過采用SPME-GC-MS對發(fā)酵乳中的揮發(fā)性物質進行測定，從10組樣品中一共檢測出35種揮發(fā)性風味物質，如表2所示，包括醛類6種，酮類9種，醇類4種，酸類9種，烴類2種，其他物質5種。在這些風味物質中，醛類物質和酮類物質一般閾值較低，是發(fā)酵乳風味的重要貢獻物質[32]，從表中可以看到，酪蛋白酸鈉強化能有效提高發(fā)酵乳中醛類物質的含量，乳蛋白濃縮物強化則會明顯降低醛類物質的含量，而濃縮乳清蛋白強化能夠大幅提高發(fā)酵乳中酮類物質的含量。在這些醛酮類物質中，壬醛能夠給發(fā)酵乳帶來類似柑橘和脂肪的香味[33]。辛醛具有強烈的水果香味，癸醛具有橙皮、牛油香氣。苯甲醛的氣味被描述為燒焦的糖，可能與美拉德反應有關，參與形成類似加熱過的氣味[34]。2，3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮是發(fā)酵乳典型奶油香味的來源。2-庚酮、2-壬酮、2-十一酮能夠帶給食物類似奶酪和脂肪的香氣[35-36]。醇類物質的察覺閾較高，對發(fā)酵乳的特征風味影響有限。3種乳蛋白對發(fā)酵乳中醇類物質的含量有一定的影響，但無明顯趨勢。酸類物質對風味的影響通常體現(xiàn)在滋味上，乙酸具有典型的酸味，丁酸具有奶油味，己酸具有油脂味，辛酸有清香和微弱的水果酸氣味、淡酸味，癸酸具有脂肪味[37]。酪蛋白酸鈉強化會引起發(fā)酵乳酸類物質的降低，而濃縮乳清蛋白和乳蛋白濃縮物對酸類物質的含量整體上有促進作用，但其含量隨著添加量的增加先增后減。

表2 不同乳蛋白強化發(fā)酵乳揮發(fā)性組分的定性定量分析

（續(xù)表2）

2.5.2 發(fā)酵乳風味的相似度分析和聚類分析

為了明確3種乳蛋白強化發(fā)酵乳和對照組風味的差異，對揮發(fā)性風味物質檢測結果進行相似度分析和聚類熱圖分析，結果如表3、圖5所示。從表3的相似度分析結果可以看到，3種乳蛋白產品的加入均引起了發(fā)酵乳風味的變化，并且隨著添加量的增加，相似度降低，其中酪蛋白酸鈉強化發(fā)酵乳和商業(yè)發(fā)酵乳的差異最小，濃縮乳清蛋白和商業(yè)發(fā)酵乳的差異最大。

表3 不同乳蛋白強化發(fā)酵乳風味的相似度分析

由圖5聚類分析結果可以看到10組發(fā)酵乳樣品可以歸為兩類或四類。劃分為四類時，不同乳蛋白強化發(fā)酵乳各自分為一類，對照組K單獨一類，說明這3種乳蛋白產品強化引起的風味物質變化有明顯差異。劃分為兩類時，酪蛋白酸鈉強化發(fā)酵乳L0.5、L1、L1.5和對照組K比較相似可以歸為一類，而濃縮乳清蛋白強化發(fā)酵乳和乳蛋白濃縮物強化發(fā)酵乳可以歸為另一類，說明使用酪蛋白酸鈉對發(fā)酵乳進行強化引起的揮發(fā)性風味物質變化更小。

圖5 發(fā)酵乳風味物質組成的聚類熱圖分析

2.5.3 發(fā)酵乳風味的冗余分析和相關性

為了明確3種乳蛋白強化對發(fā)酵乳風味的影響，對揮發(fā)性風味物質檢測結果進行冗余分析和相關性分析，結果如圖6和表4所示：從冗余分析結果可以看到，F(xiàn)1和F2的貢獻率分別為39.7%、22.3%，可以較好的解釋各組樣品之間的差異以及3種乳蛋白產品對發(fā)酵乳揮發(fā)性風味物質的影響。樣品差異上，酪蛋白酸鈉強化發(fā)酵乳L0.5、L1、L1.5和乳蛋白濃縮物M 0.5、M1、M1.5與對照組K的距離較近，差異較小。蛋白質和芳香族化合物之間的相互作用高度依賴于蛋白質的構象，而酪蛋白酸鈉在pH降低時結構穩(wěn)定不易變性[38]。濃縮乳清蛋白發(fā)酵乳R0.5、R1、R1.5與對照組K的距離較遠，差異較大，說明濃縮乳清蛋白強化引起的風味變化最大，在同風味物質的結合方面，乳清蛋白產品比酪蛋白酸鈉具有更高的保留能力[39]，這可能與濃縮乳清蛋白引起的微觀結構變化有關。濃縮乳清蛋白對較多風味物質的生成都有促進作用，如丁醛、2，3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮、2-十一酮、苯乙酮等，這些物質閾值較低且與酸奶風味相關，說明濃縮乳清蛋白的加入可能能夠加強酸奶的典型氣味。酪蛋白酸鈉能夠提高辛醛、壬醛、苯乙烯等物質的含量。乳蛋白濃縮物能夠提高乙酸、甲酸、己酸的含量，這可能與乳蛋白濃縮物中脂肪含量較高有關。蔡蕊等[40]也發(fā)現(xiàn)同一蛋白質水平下，濃縮乳清蛋白強化酸奶比脫脂乳粉強化有更大的感官品質差異。

表4 發(fā)酵乳風味的Pearson相關性分析

圖6 發(fā)酵乳風味物質組成的冗余分析

Pearson相關系數(shù)分析是建立在線性相關基礎上的一種統(tǒng)計學方法。一般認為相關系數(shù)在0.7以上說明關系非常緊密；0.4～0.7之間說明關系緊密；0.2～0.4說明關系一般。以0.7為標準，從表可以看到酪蛋白酸鈉、濃縮乳清蛋白、乳蛋白濃縮物分別與11、6、9種風味物質呈正相關，與8、9、12種風味物質呈負相關。其中，壬醛、辛酸、雙戊烯含量和酪蛋白酸鈉添加量顯著線性相關，苯甲醛、2-壬酮含量和乳蛋白濃縮物添加量顯著線性相關，而其余風味物質的含量雖然與乳蛋白產品添加量存在較大相關性，但不是線性相關，如辛醛在各組酪蛋白強化發(fā)酵乳中含量均高于商業(yè)發(fā)酵乳，但隨著添加量變化呈現(xiàn)出先增后減的趨勢。這說明乳蛋白強化對發(fā)酵乳風味物質的影響與添加量多少有較大關系，不同添加量下風味物質的變化趨勢可能相反。

3 結 論

通過使用酪蛋白酸鈉、濃縮乳清蛋白、乳蛋白濃縮物這3種不同的蛋白產品對發(fā)酵乳進行強化，研究了蛋白強化類型、含量對發(fā)酵乳質構、流變、和風味特征的影響及不同蛋白質強化下發(fā)酵乳微觀結構的變化。發(fā)酵pH值曲線顯示，乳蛋白強化會減低發(fā)酵速率，其中濃縮乳清蛋白影響最大。質構、流變方面，3種乳蛋白產品都能起到提高作用，但提升幅度存在差異，酪蛋白酸鈉最能大幅提高發(fā)酵乳的硬度、黏力、彈性和膠著性，濃縮乳清蛋白最能提高發(fā)酵乳的彈性模量、黏性模量，而乳蛋白濃縮物對發(fā)酵乳這些性質的影響均介于酪蛋白酸鈉和濃縮乳清蛋白之間。掃描電鏡結果顯示，酪蛋白酸鈉、乳蛋白濃縮物能夠增大發(fā)酵乳的網狀結構骨架，濃縮乳清蛋白填充網狀結構孔隙，使微觀結構變得更加致密。風味方面，濃縮乳清蛋白強化引起的風味變化最大，對丁醛、2，3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮、2-十一酮、苯乙酮等物質有促進作用；酪蛋白酸鈉能夠提高辛醛、壬醛、苯乙烯等物質的含量；乳蛋白濃縮物能夠提高乙酸、甲酸、己酸的含量。