四君子湯治療胃黏膜損傷的機制探究

孫玉婷，劉明暉，方 爽，王長宏*

（1.吉林大學中日聯誼醫院，長春 130033；2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九六五醫院，吉林 吉林 132011）

胃潰瘍（gastric ulcer, GU）是消化系統常見疾病，其發病與病原體感染、非甾體類藥物和心理因素等相關[1-2]。近來研究發現氧化應激參與了GU的形成，GU發生的高危因素中，如HP感染[3]、NSAIDs損傷[4]、乙醇破壞[5]，有ROS的產生參與。當體內的活性氧簇（ROS）的過度產生破壞細胞內源性氧化平衡后，就會發生氧化應激應答[6-7]。Keap1/Nrf2/ARE 是目前研究較熱門的抗氧化信號通路之一，Nrf2是維持細胞內氧化平衡的重要轉錄因子，當機體受到大量ROS刺激時，Nrf2會與Keap1分離，游離狀態下的Nrf2會進入到細胞核內，與抗氧化元件ARE結合，啟動很多下游的抗氧化基因和解毒基因的激活轉錄，如血紅素氧合酶-1（HO-1）、醌氧化還原酶-1（NQO1）等，從而發揮清除氧自由基、抑制細胞凋亡等作用，避免機體免到受氧化損傷[8-9]。因此我們可以通過調節氧化機制來改善治療GU。

四君子湯出自宋代《太平惠民和劑局方》，由人參、茯苓、白術、炙甘草組成。在臨床上治療消化道潰瘍（PU）、慢性胃炎、消化不良等疾病，在治療安全性、降低西藥副作用以及減少復發率方面[10-11]，都被證實有良好的效果。但四君子湯治療GU是否可以通過激活Nrf2信號通路，調節氧化應激來達到治療GU的效果尚不明確。本研究主要通過體外實驗，利用乙醇誘導胃黏膜上皮細胞GES-1細胞氧化損傷，檢測氧化調節因子Nrf2及其下游調控的HO1、NQO1的表達量，從而來探究SJZD保護胃黏膜的抗氧化作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

1）四君子湯：藥物均經專家鑒定符合藥典要求，按照人參12 g，茯苓12 g，白術12 g，炙甘草8 g，藥物來源及藥液制作方法參考如下[12]，制備母液濃度為1 g·mL-1，濃縮后配制含生藥2 000 mg·mL-1、1 000 mg·mL-1、500 mg·mL-1、100 mg·mL-1、50 mg·mL-1藥液備用。2）試劑：RPMI-1640培養基、胎牛血清購自賽默飛世爾科技有限公司；青霉素鏈霉素雙抗、顯影液、0.22 μm PVDF膜、RIPA細胞裂解液、蛋白酶抑制劑購自碧云天生物技術有限公司；SYBR?Premix Ex Taq? II購自寶日醫生物技術有限公司。3）試劑盒：CCK-8細胞活力檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、RNA抽提試劑盒（柱式）、cDNA合成試劑盒、BCA蛋白濃度試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。4）細胞系：人胃黏膜上皮細胞系GES-1購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 細胞培養

GES-1細胞用RPMI-1640培養基（含10%血清和1%雙抗），培養在37 ℃，5%二氧化碳 的細胞培養箱中，定期用支原體檢測試劑盒檢測，確保無污染。

1.3 細胞活力檢測

將GES-1細胞接種到96孔板（4×104/孔），分6個濃度梯度組及1個空白對照組，每組6個復孔。待細胞貼壁后，更換為100 μL濃度分別為2 000 mg·mL-1、1 000 mg·mL-1、500 mg·mL-1、100 mg·mL-1、50 mg·mL-1、0 mg·mL-1的 SJZD藥物培養24 h，棄藥物培養液，加入完全培養基100 μL，4 h后，每孔加入10 μL CCK工作液，再培養2 h后，檢測各孔OD值，選擇后續實驗最適SJZD濃度。

細胞接種及分組同上，分別在0 mg·mL-1、500 mg·mL-1的 含SJZD藥物培養基中24 h，加入100 μL 含 0%、1.0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%無水乙醇的培養基繼續培養4 h。按照上述CCK-8試劑步驟檢測，選擇最佳無水乙醇濃度。

細胞生長抑制率：生長抑制率（%） = （對照組OD值－實驗組OD值）÷（對照組OD值－空白孔OD值）×100%。

1.4 凋亡檢測

將GES-1細胞接種到6孔板（1×105/孔），貼壁后，更換為含藥物的培養基，24 min后，加入2 mL含0%或5%無水乙醇的培養基繼續培養，繼續培養4 h，收集細胞（含上清），按細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行凋亡染色并送流式分析。凋亡細胞定義為Annexin V陽性的細胞。

1.5 ROS流式檢測

將1×105個GES-1細胞接種到6孔板，貼壁后，換含藥物或PBS的培養基，24 h后，實驗組加入含5%無水乙醇的培養基，繼續培養4 h，收集細胞試劑盒按說明書進行ROS染色并送流式分析。

1.6 實時熒光定量PCR

細胞用藥物處理24 h，用5%無水乙醇的培養基處理細胞，4 h后，按實際說明書操作，用RNA提取試劑盒提取RNA，并進行cDNA合成，隨后將cDNA產物與指定引物和SYBR?Premix Ex Taq? II進行實時熒光定量PCR反應。利用ΔCT值相對定量法分析實時熒光定量PCR結果。公式為：ΔCT對照=CT對照目標基因-CT對照內參基因；ΔCT樣本= CT樣本目標基因-CT樣本內參基因；ΔΔCT=ΔCT樣本-ΔCT對照；基因相對表達量= 2^-ΔΔCT。

1.7 Western Blot

細胞用藥物處理24 h，用5%無水乙醇的培養基處理細胞，4 h后，收集細胞，加入5倍體積的RIPA細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），在冰上裂解30 min。用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度后，用SDS上樣緩沖液與樣本混合并在100℃加熱10 min，隨后進行SDS凝膠電泳，將蛋白轉移至PVDF膜后進行封閉、一抗和二抗孵育后，用ECL顯影液在顯影儀下顯影并拍照記錄。

1.8 統計學方法

采用 SPSS 19.0 統計軟件進行結果分析，計量數據以均數±標準差（±s）表示，并用t檢驗分析組間差異；計數數據以百分比（%）表示，并用χ2檢驗分析組間差異。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SJZD降低乙醇誘導GES-1細胞的凋亡和ROS含量

為進一步研究四君子湯保護急性胃黏膜損傷的機制，首先研究了不同濃度四君子湯和不同濃度的無水乙醇對GES-1細胞生長活力的影響（見表1、表2）。根據細胞的生長抑制情況，后續實驗選擇了最適濃度500 mg·L-1SJZD以及5%的無水乙醇。圖1可以看出SJZD治療組的凋亡水平明顯低于模型組，但并達到至正常組水平。表3、表4可以看出，SJZD治療組對比模型組顯著降低了GES-1細胞的凋亡率（P＜0.05）以及細胞內ROS含量（P＜0.05），SJZD可抑制乙醇誘導下產生的GES-1細胞的凋亡水平和ROS強度。

表1 不同濃度SJZD對GES-1細胞活力的影響（n= 6）

表2 不同濃度無水乙醇下SJZD對GES-1細胞活力的影響（n= 6）

表3 SJZD對5%乙醇誘導GES-1細胞的細胞凋亡率的影響（n= 6）

表4 SJZD對5%乙醇誘導GES-1細胞的ROS的影響（n= 6）

圖1 SJZD對5%乙醇誘導GES-1細胞的細胞凋亡率的影響

2.2 SJZD對GES-1細胞中Nrf2、HO-1、NQO1表達量的影響

Nrf2是重要的細胞應激反應基因，是目前已知的抗氧化系統中最重要的基因，其激活可提高細胞抵抗氧化損傷的能力[13]。圖2所示，SJZD治療組的Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白表達量對比模型組顯著上升（P＜0.05），提示四君子湯可激活Nrf2信號通路。如表5所示，SJZD 治療組細胞中Nrf2及其下游基因HO-1和NQO1的mRNA表達量均較模型組有顯著上調（P＜0.05），有趣的是我們發現SJZD組中的3組基因的表達亦有所上調。Western Blot與RT-qPCR的結果一致，都表明在SJZD治療組（5%無水乙醇與500 mg·L-1SZJD的藥物培養），激活了Nrf2信號通路，增強了GES-1細胞的抗氧化反應能力，改善了細胞內的抗氧化環境，促進GES-1細胞生存。

表5 SJZD對Nrf2信號通路相關基因mRNA影響（n= 6）

圖2 SJZD對Nrf2信號通路相關蛋白影響

2.3 ML385聯合實驗抑制了SJZD的保護作用

為了驗證SJZD對GES-1細胞的保護作用是否依賴于Nrf2，我們用Nrf2選擇性抑制劑ML385[14]與SJZD聯合處理。結果如下：在5%的無水乙醇作用下，對比SJZD組，SJZD+ML385組的細胞生長活力（表6）明顯受到了抑制（P＜0.05），細胞凋亡水平（表7、圖3）明顯上升（P＜0.05）和ROS水平（表8）顯著增強（P＜0.05）。ML385可能通過抑制細胞內氧化應激通路Nrf2及其下游基因表達，從而消除了SJZD對GES-1細胞的保護作用。

圖3 ML385抑制SJZD的抗凋亡作用

表6 ML385影響SJZD對無水乙醇損傷GES-1細胞活力的保護作用（n= 6）

表7 ML385抑制SJZD的抗凋亡作用（n= 6）

表8 ML385抑制SJZD的抗ROS作用（n= 6）

3 討論

GU屬于中醫“痞滿、胃脘痛”范疇，2017年中醫消化道潰瘍指南專家共識中指出[15]，根據其胃黏膜病理特點增加了“胃瘍”一名。中醫認為GU的發病與飲食、情志、久病、體虛等相關，致使脾胃運化失司，脾胃乃后天之本，脾胃虛弱會影響營養物質吸收，削弱其保護防御作用。SJZD作為補脾胃的第一方，現代研究證實可以發揮促進黏膜恢復[16]、抗炎[17]、抗氧化應激[18]等作用。有研究報道，SJZD可以改變胃黏膜黏蛋白含量、胃黏膜免疫細胞亞群等，從而恢復黏膜屏障功能[19]。王東旭等也報道SJZD可以通過影響多胺防治胃黏膜損傷[20]。

乙醇是誘發GU中較為常見的因素。通過乙醇誘發的潰瘍與人胃黏膜損傷非常相似且重復性好[21]，已成為研究GU廣泛使用的經典模型[22]。其機制是主要通過減弱胃黏膜上皮細胞氧化應激，增加ROS產生，破壞細胞內氧化平衡，誘導細胞凋亡[23]，而細胞的持續凋亡也會破壞胃黏膜的完整性，導致其功能的障礙。本研究結果顯示，SJZD可以抑制乙醇誘導的GES-1細胞的凋亡和ROS產生，提高了抗氧化標記物Nrf2、HO-1、NQO1的表達，對GES-1細胞起到了保護作用。

在GU的發生研究中，胃黏膜上皮細胞的凋亡對胃潰瘍發生和愈合具有重要作用[24-25]。本研究首次報道SJZD可以有效減少乙醇對GES-1細胞的生長抑制，降低乙醇誘導的GES-1細胞內的ROS水平和細胞凋亡率。Nrf2是細胞內主要的應激應答基因，其激活可以促進抗氧化相關基因的轉錄，增強細胞抗氧化反應能力，從而保護細胞免受損傷。本研究結果顯示，乙醇處理后，細胞內Nrf2及其下游靶基因HO-1和NQO1均有較低程度的激活，這可能是細胞對乙醇損傷的適應性反應。SJZD可以在mRNA水平和蛋白水平有效激活Nrf2及其下游靶基因HO-1和NQO1表達，這可能是SJZD保護GES-1細胞免受乙醇損傷的機制。因此，我們又用Nrf2的選擇性抑制劑ML385進行研究，結果顯示ML385消除了SJZD湯對GES-1細胞的保護效應，表明SJZD對胃黏膜上皮細胞的保護作用依賴于Nrf2的激活。我們的研究結果也支持了之前的假設。

本研究通過四君子湯在動物和細胞實驗體外效應機制研究，驗證了四君子湯通過激活Nrf2相關的抗氧化通路應答，減輕乙醇誘導的小鼠胃黏膜損傷。