消積抑癌外敷方對Lewis肺癌荷瘤小鼠抑瘤效果和腫瘤血管生成的影響

張春，丁甜甜，李慧，劉遠婷，鄭茜

(1.新疆醫科大學動物實驗中心；2.新疆醫科大學第七附屬醫院中醫科，新疆 烏魯木齊 830000)

肺癌發病率居全球惡性腫瘤前列，發病率高達45.39%[1]，由于肺癌診斷時多處于中晚期，治療效果不甚理想，5年生存率<20%[2]。手術、放化療及靶向藥物治療是主要治療方式，但手術治療對適應證的要求較高，僅限于Ⅰ～Ⅲa期肺癌[3]；放化療及靶向藥物治療伴隨的不良反應明顯，部分患者不耐受[4]。中醫藥防治腫瘤已有數千年歷史，積累了寶貴經驗，根據中醫辨證施治可恢復和增強機體自然免疫力，扶正固本，起到輔助抗腫瘤作用。腫瘤的生長與擴散具有血管依賴性[5]，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在腫瘤發生發展中起到關鍵作用[6-7]，抗腫瘤血管生成藥物成為肺癌不可或缺的治療手段之一，其可使現有腫瘤血管退化，并抑制腫瘤新生血管生成，從而阻斷腫瘤生長必須的營養供給[8]。本研究擬采用Lewis肺癌荷瘤小鼠模型觀察消積抑癌外敷方對腫瘤血管生成及VEGF表達的影響，探討消積抑癌外敷方的抗腫瘤效果和作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雌性C57BL/6小鼠20只，體質量(20±2)g，4～6周齡，購自新疆醫科大學動物實驗中心[許可證號：SCXK(新) 2018-0002)]。Lewis肺癌細胞株選自新疆醫科大學動物實驗中心。

1.2 主要實驗儀器和試劑

SSB-2超凈臺(上海凈化設備廠)、5%CO2恒溫培養箱(美國力高公司)、倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)、低溫高速離心機(上海醫用分析儀器廠)、HR-200型電子天平(日本LIMITED公司)、細胞培養瓶(德國Greiner公司)、Prism7000型熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)儀(美國ABI公司)、組織包埋機和石蠟切片機(德國Leica公司)。VEGF單克隆抗體試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)；熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)配套試劑盒和總核糖核酸(RNA)抽提試劑購自美國Thermo Scientific公司；VEGF信使核糖核酸(mRNA)引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

消積抑癌外敷方：當歸30 g、川芎30 g、乳香30 g、沒藥30 g、紅花30 g、赤芍30 g、五靈脂60 g、莪術120 g、苦參120 g、山慈菇120 g、透骨草60 g、全蝎40 g、蜈蚣40條、豬蹄甲30 g、土鱉蟲40 g、商陸120 g、元胡120 g、青黛60 g、拳參40 g、仙鶴草60 g、丹皮60 g、白鮮皮60 g、丹參30 g、浙貝母120 g、烏梅120 g、蜂房120 g、蛇莓60 g、冰片9 g，將冰片溶解于46°白酒500 mL中制備成冰片酒。上述中藥材研成粉末，用46°冰片酒調和成膏狀，消毒滅菌裝瓶，制成外敷膏劑。外敷膏劑由新疆醫科大學第七附屬醫院中藥房制備，鑒定及方劑質量控制由新疆醫科大學藥學院負責，采用薄層色譜法鑒別外敷膏劑的活性成分，其中當歸、川芎、乳香、沒藥、紅花等中藥成分的分離度較好、專屬性較強，陰性對照無明顯干擾。外敷膏劑成型性好，具有適宜的機械強度和黏附性，制備工藝穩定合理，質量控制方法準確、可靠、專屬性強，質量評價較優。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備及分組 實驗前C57BL/6小鼠適應性喂養7 d。采用動物移植腫瘤實驗法制備Lewis肺癌荷瘤小鼠模型[9]。將Lewis肺癌細胞株的凍存管從液氮中取出，迅速放入37 ℃的水浴鍋中至內容物完全融化，約3 min快速復蘇，置于完全培養基中，移入37 ℃恒溫、5%CO2細胞培養箱中培養并傳代。當細胞處于指數生長期時，取生長良好的細胞經胰酶消化后，用計數板計數，將濃度調整至1×107個/mL以供注射。將2×106個Lewis肺癌細胞接種于每只小鼠皮下，制備Lewis肺癌小鼠模型，每天檢查腫瘤生長情況，接種8 d后開始實驗。20只C57BL/6小鼠隨機分為荷瘤對照組和治療組，每組各10只。

1.3.2 治療方法 對照組小鼠瘤體表面外敷面糊(面粉+生理鹽水調成糊狀物)，面糊加熱至30 ℃使用，30 min/次，3次/d，連續30 d。治療組小鼠瘤體表面外敷消積抑癌膏，按照0.79 mL/20 g體重標準給藥，膏藥加熱至30 ℃使用，30 min/次，3次/d，連續30 d。

1.4 檢測指標

(1)療程結束后處死小鼠，剝離腫瘤組織稱重瘤質量；將腫瘤組織分為兩部分，一部分用多聚甲醛固定，另一部分冷凍于液氮中備用；(2)免疫組化法檢測CD34和VEGF蛋白表達量，多聚甲醛固定組織，經過脫水、固定、包埋等步驟制作石蠟切片，石蠟切片浸泡于500 mL的抗原修復工作液，加熱煮沸20 min后冷卻至室溫，取出組織切片用磷酸鹽緩沖液沖洗3 min、自來水沖洗3 min。組織切片晾干后滴加10%非免疫羊血清，孵育30 min。鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(SP)進行免疫組化染色：加入CD34和VEGF單克隆抗體試劑盒中的一抗工作液40 μL，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的CD34和VEGF二抗工作液，37 ℃孵育30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5 min。滴加二氨基聯苯胺顯色液50 μL，染色時間大約5～10 min，顯微鏡下觀察。CD34染色標記微血管進行微血管密度計數，計算腫瘤組織中CD34染色的微小血管。(3)Western blot檢測VEGF蛋白表達，100 mg液氮冷凍的腫瘤組織，加入蛋白裂解液1 mL，1 000～3 000 rpm高速勻漿3次，離心取上清液，調整所有蛋白樣本至等濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉移到硝酸纖維束薄膜上，封閉，加入VEGF一抗，4 ℃孵育過夜。取膜，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次5 min。再加入辣根過氧化物酶標記的VEGF二抗，封口，37 ℃孵育1 h。磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次10 min。采用辣根過氧化物酶化學發光法(HRP-ECL)曝光，將膜置于曝光板上，取出膠片浸入顯影液至完全曝光，清水沖凈晾干。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參照計算VEGF蛋白的相對表達量。(4)RT-qPCR法檢測VEGF mRNA相對表達量， 100 mg液氮冷凍的腫瘤組織用0.25%胰蛋白酶消化細胞，10 000 rpm離心棄上清，加入Trizol試劑抽提細胞總RNA，干燥RNA沉淀物，保存于-20 ℃待檢。VEGF上游引物：5′-TCA GGT CTG CTC AT TCT TA-3′，下游引物：5′-CAG CCA TTC AGT CTA CGT-3′，擴增片段474 bp，β-actin為內參基因，上游引物：5′-CTC CAT CCT GGC CTC GCT GT-3′，下游引物：5′- GCT GTC ACC TTC ACC GTT CC-3′，擴增片段268 bp。將相關試劑(逆轉錄酶10 U、核糖核酸抑制酶2 μmol/L、dNTP 2.5 μmol/L、Taq DNA聚合酶5 μmol/L，引物5 μmol/L等，反應體積100 μL)置于冰盒上，混勻。將離心管置于預熱的Prism7000型熒光定量PCR儀， RT-qPCR反應條件：96 ℃ 4 min， 94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環。按照RT-qPCR說明書，采用2-ΔΔCt法計算VEGF mRNA相對表達量。

1.5 VEGF蛋白評分標準

由病理中心兩名醫師獨立閱片，采用Bresalier半定量法分兩部分評分[10]：(1)染色深淺度評分：0分為不顯色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；(2)陽性細胞數評分：0分為陽性細胞數<5%，1分為陽性細胞數5～25%，2分為陽性細胞數26%～50%，3分為陽性細胞數51%～75%，4分為陽性細胞數≥76%。累計得分0～1分為(﹣)，2～3分為(+)，4～5分為(++)，6～7分為(+++)。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 兩組小鼠瘤質量比較

治療組的瘤質量(1.37±0.28)g低于荷瘤對照組(0.61±0.15)g，差異有統計學意義(t=7.566，P<0.001)。見圖1。

2.2 兩組微血管密度計數比較

治療組的微血管密度計數(43.59±8.33)小于荷瘤對照組(30.34±6.45)，差異有統計學意義(t=3.977，P=0.001)。見圖2。

2.3 兩組VEGF蛋白表達水平比較

對照組和治療組的VEGF表達均為陽性，且治療組VEGF表達的陽性等級低于對照組。治療組的VEGF蛋白表達量(1.07±0.26)低于荷瘤對照組(0.76±0.19)，差異有統計學意義(t=3.044，P=0.007)。見表1、圖3及圖4。

表1 免疫組化VEGF蛋白表達水平比較 [n(%)]

2.4 兩組VEGF mRNA表達量比較

治療組的VEGF mRNA相對表達量(1.93±0.47)低于對照組(1.35±0.34)，差異有統計學意義(t=3.162，P<0.005)。見圖5。

3 討論

本研究探討消積抑癌外敷方對Lewis肺癌荷瘤小鼠的腫瘤血管生成以及VEGF表達的影響，結果顯示，治療組的微血管密度計數小于荷瘤對照組，說明消積抑癌外敷方可以抑制腫瘤血管生成。荷瘤對照組、治療組的VEGF表達均為陽性，但治療組VEGF表達的陽性等級低于荷瘤對照組，并且治療組的VEGF蛋白表達量以及VEGF mRNA低于荷瘤對照組，上述可以證明消積抑癌外敷方可下調Lewis肺癌荷瘤小鼠VEGF表達，具有抗腫瘤潛力。

中醫藥理認為肺癌的發病以臟腑虧虛、氣血失調、正氣不足為內因，內邪伏留易致外邪侵襲，在各種致癌因素的作用下，外感病日久不愈，邪氣伏著不解，成為內伏之邪，內外合邪發病，引起人體氣滯血瘀，痰凝毒結，形成腫瘤[11]。瘀血、痰濁是肺癌的主要病機，因此肺癌的治療應從整體觀念出發，采用活血化瘀的治療方法[12]。本研究所采用的消積抑癌方多選用蟲類藥甚至有毒的藥物以通絡消積、以毒攻毒，如全蝎、蜈蚣、豬蹄甲、土鱉蟲；選用活血破瘀消積類藥物以清瘀毒，如當歸、川芎、乳香、沒藥、紅花、赤芍、五靈脂、莪術、丹參、透骨草；選用清熱解毒散結類藥物如苦參、山慈菇、商陸、元胡、青黛、拳參、仙鶴草、丹皮、白鮮皮；浙貝母、烏梅，蜂房、蛇莓；輔以冰片、白酒的辛散透皮，引藥到達病所。上述藥物組方嚴謹，君臣佐使，諸藥配伍共奏清熱解毒、活血消積、以毒攻毒之功效。從西醫病理機制的角度分析，腫瘤血管生成為腫瘤迅速生長、侵襲和轉移提供營養和能量。VEGF是腫瘤血管生成刺激因子，可促進血管內皮細胞增殖，誘導腫瘤新生血管形成，提高血管通透性，加速腫瘤細胞的轉移擴散[13-14]。本研究發現，治療組的微血管密度計數、瘤質量、VEGF蛋白和VEGF mRNA表達量均少于對照組，說明消積抑癌外敷方可抑制腫瘤血管生成和腫瘤生長，具有抗腫瘤潛力。孫國鈞等[15]指出由黃芪、白術、石見穿、蜂房等中藥組成的益氣消征方，可行氣活血、散瘀止痛、攻毒效果，降低Lewis荷瘤小鼠VEGF蛋白和VEGF mRNA的表達，減慢腫瘤的生長速度，降低腫瘤血管形成率；Zhang等[16]也表示大黃酚活性成分通過調節ROS/HIF-1a/VEGF信號通路，抑制CD31、CD34和血管生成素的表達，進而阻礙肺癌腫瘤血管生成，上述兩項報道均與本研究結論一致。這可能是因為：消積抑癌外敷方的中藥成分如當歸、苦參、川穹等能夠有效抑制VEGF，從而阻斷腫瘤血管生成，抑制腫瘤生長，作用機制可能與阻斷JAK2/STAT3信號通路、減輕機體免疫抑制、下調瘤組織基質金屬蛋白酶13和成纖維細胞生長因子2的表達有關[17]。

綜上所述，消積抑癌外敷方可下調Lewis肺癌荷瘤小鼠VEGF表達，抑制腫瘤血管生成，減輕瘤質量，為臨床治療提供新的思路法。