基于網絡藥理學探討桂枝茯苓湯治療子宮肌瘤的活性成及分子機制

李桂春，王立新，張廣麗

（1.錦州市婦嬰醫院中醫婦科，錦州，121000；2.錦州市中心醫院康復科，錦州，121000）

子宮肌瘤是臨床婦科常見的一種疾病，多是由于女性在妊娠期間應用激素以及遺傳、肥胖、人工流產等因素引起，嚴重者可導致不孕不育，極大地影響患者生活質量。目前針對子宮肌瘤的治療包括西藥藥物和手術治療，在臨床中應考慮患者的年齡、病情及個人需求等因素，上述治療仍有較多局限。有研究表明，中醫藥治療子宮肌瘤在療效、降低性激素水平上有一定優勢，為臨床應用帶來了新的觀點及良好的發展。

桂枝茯苓湯由赤芍、茯苓、桂枝、麥芽、牡丹皮、牛膝、生地黃、桃仁、天花粉、土鱉蟲等10 味中藥組成。赤芍其味苦，性微寒[1]，具有清熱涼血、散瘀止痛、活血之功效[2-3]。桂枝具有溫通經脈、散寒解表、促陽化氣之效，臨床醫師常用桂枝治療寒濕痹痛、百瘕結塊等癥[4-5]。茯苓為非褶菌目多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核[6]，具有利水滲濕、健脾的功效[7]。麥芽，又稱大麥芽[8]，功能主治行氣消食、健脾開胃、回乳消脹[9]。牡丹皮則具有活血化瘀，清熱涼血之功效[10]。牛膝性苦、酸、平，有通血脈，強筋骨，補肝腎及鎮痛等作用[11]。地黃具有清熱涼血、養陰和生津的功效[12]。桃仁性味苦、甘、平；歸心、肝、大腸經，具有活血祛瘀、止咳平喘等功效[13]。天花粉具有清熱瀉火、生津止渴、消腫排膿之功效[14]。土鱉蟲具有小毒，具有破血逐瘀、續筋接骨之功效[15]。本研究基于網絡藥理學知識預測藥物—疾病靶點網絡，分析藥物、靶點和疾病的相關性，探索桂枝茯苓湯治療子宮肌瘤的潛在作用機制，為后期桂枝茯苓湯的臨床應用及有效治療子宮肌瘤提供理論基礎和方法。

1 資料與方法

1.1 桂枝茯苓湯中藥復方活性成分及藥物靶點篩選

在TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)數據庫（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php，2021-05-03）中檢索復方中藥物，TCMSP 中未收錄的用TCMID（http://119.3.41.228:8000/tcmid/，2021-05-03）數據庫檢索成分作為潛在活性成分。使用Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫獲得上述成分的SDF 結構，導入Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/，2021-05-03）數據庫，取預測得分大于0 的靶標作為藥物靶點。將活性成分進行拓撲分析，根據介度（betweenness centrality，BC）、緊密度（closenesscentrality，CC）以及中心度（Degree）篩選關鍵活性成分。

1.2 疾病靶點的獲取

使用OMIM（https://omim.org/）、Disgenet（https://www.disgenet.org/）、Genecards（https://www.genecards.org/）數據庫（https://www.uniprot.org，2021-05-04）數據庫以“hysteromyoma”為關鍵詞進行檢索，獲得疾病作用靶點。

1.3 桂枝茯苓湯—疾病共同靶點的獲取

在Venny2.1 在線軟件作圖工具平臺上輸入藥物靶點、疾病靶點，繪制韋恩圖，交集后獲得共同靶點。

1.4 構建“藥物—成分—靶點—疾病”網絡

使用Cytoscape 3.7.2軟件，構建“藥物—成分—疾病—靶點”網絡圖。

1.5 構建蛋白質相互作用（PPI）網絡

將所選靶點輸入到STRING(https://string-db.org/，2021-05-03)數據庫中進行檢索，設置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為0.4，獲取靶點相互作用的網絡關系數據，將其導入Cytoscape軟件，繪制蛋白相互作用網絡圖。

1.6 富集分析

基于R軟件使用Bioconductor生物信息軟件包以P＜0.05，count 值進行關鍵靶基因GO 與KEGG功能富集分析，并將結果以氣泡圖形式輸出。

1.7 動物分組及處理

雌性SPF級大鼠40 只，周齡6～8 周，平均體重（230±10.5）g。動物購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號[SCXK（京）2018-00054]。SPF 級大鼠購置后適應性喂養5～7 d，期間定期觀察大鼠外形、體形、行動、有無異常損傷等。飼養條件：每籠5 只飼養，室溫恒定26 ℃，濕度60%～70%，光照為12 h 明暗交替，實驗期間大鼠自由飲用蒸餾水。將40只SD大鼠按隨機數字表法分為空白組、模型組、米非司酮組和桂枝茯苓湯組，每組10 只。大鼠模型制備方法如下：采用雌激素負荷法構建子宮肌瘤大鼠模型，對模型組、米非司酮組以及桂枝茯苓組大鼠每周進行3次腹腔注射苯甲酸雌二醇（0.5 mg/kg），隔天注射1次，連續注射16 周；從第12 周起每只大鼠增加注射黃體酮（0.9 mg/kg）3 次/周，連續注射4 周?？瞻捉M大鼠接收等劑量生理鹽水腹腔注射。第16 周每組各取2 只行病理檢查，大鼠子宮病理學顯示腺體增生及肌肉纖維增生提示造模成功。

給藥方法：桂枝茯苓湯的中藥組分由本院中藥房監制，用蒸餾水煎煮濃縮配置成1 g生藥/mL的藥液，冰箱保存。米非司酮片25 mg/片（國藥準字H10950202，公司：上海新華聯制藥有限公司），使用時研磨成粉狀，并用蒸餾水至所需濃度的混懸液。桂枝茯苓湯組按劑量8 g·kg-1·d-1桂枝茯苓湯劑量灌胃，米非司酮組按2.4 mg·kg-1·d-1米非司酮灌胃，空白組、模型組每日等劑量生理鹽水灌胃。喂養8周。末次給藥24 h后，采用頸椎脫臼法處死大鼠用于后續實驗。

1.8 實時熒光定量PCR定各mRNA表達水平

8 周后取各組大鼠60 mg 子宮肌瘤組織均勻研磨加入1 mL Trizol 提取總RNA，將RNA 逆轉錄為cDNA，進行PCR 擴增，反應體系：cDNA模板1.0 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，SYBR Green Master 5 μL，加ddH2O 至10 μL。反應條件：95 ℃，5 min，95 ℃、10 s，62 ℃、33 s，共40個循環。引物序列（5’～3’）如下：AKT1，上游：GAGGCGAGCTCTTCTTCCACC，下游：GGACACAATCTCCGCACCGTAG；TP53，上游：TAGCAGGAGAGGAGGAGCAG，下游：ATGGTCCTGGCTGGTAGGTA；VEGFA，上游：AATCAGTTCGAGGAAAGGGAAAGG，下游：AGGCTCACAGTGAACGCTCCAG；MAPK3，上游：CCAAACAAGCGCATCACAGT，下游：CCACTGGTTCATCTGTCGGA；EGFR，上游：GGCATCATGGGGGAGAACAA，下游：TCTTTGGCCCATAGGTACAGT。以Ct 值表示循環miRNA 表達水平，采用2-ΔΔCt法計算AKT1、TP53、VEGFA、MAPK3、EGFR等核心基因靶點的mRNA表達水平。

2 結果

2.1 桂枝茯苓湯活性成分、潛在靶點預測及關鍵藥效分子的分析

在TCMSP 數據庫中設定OB≥30%、DL≥0.18，對赤芍、茯苓、桂枝、麥芽、牡丹皮、牛膝、桃仁、天花粉的有效成分進行篩選，在TCMID 數據庫中檢索生地黃、土鱉蟲，共得到潛在活性成分135 個（包括鞣花酸、芍藥苷元、芍藥新苷、芍藥苷、黃芩素、黃芩苷、β-谷甾醇、谷甾醇、菠甾醇、豆甾醇、芍藥內酯苷、吳萸素B、氫化松苓酸、茯苓酸、紫杉葉素、花翠素、雙沒食子酸酯、木犀草素、維生素E、槲皮素、二齒皂苷、β-脫皮甾酮、漢黃芩素等），使用Swiss Target Prediction 數據庫篩選出860 個藥物靶點,見表1。135 個活性成分拓撲分析后根據介度、緊密度以及中心度（Degree）排名篩選出7 個關鍵活性成分，見表2。

表1 藥物組中藥—成分—靶標基本信息統計表

表2 關鍵活性成分拓撲分析表

2.2 子宮肌瘤疾病靶點篩選

以“hysteromyoma”為關鍵詞分別在OMIM、Disgenet、Genecards 數據庫進行檢索，去重后共獲得疾病靶點1 217個。

2.3 桂枝茯苓湯—子宮肌瘤靶點篩選

在Venny2.1在線軟件作圖工具平臺上輸入860個藥物靶點、1 217個疾病靶點，繪制韋恩圖，兩者取交集后獲得藥物—疾病共同靶點147個，見圖1。

圖1 中藥復方—疾病靶點韋恩圖

2.4 構建藥物—成分—靶點—疾病網絡

將中藥復方中135 個潛在活性成分與147 個藥物—疾病共同靶點輸入Cytoscape軟件中，刪除與靶點無交集的孤立成分，繪制出“藥物—成分—靶點—疾病”相互作用的網絡圖，見圖2。圖中紫色代表藥物，綠色代表中藥復方中的114種活性成分，藍色代表147個共同靶點，紅色代表疾病。

圖2 藥物—成分—靶點—疾病作用網絡圖

2.5 蛋白質互作網絡分析

將上述147個共同靶點輸入到STRING數據庫中進行檢索，設置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為0.4，獲取靶點相互作用的網絡關系數據，將其導入Cytoscape 軟件，得到蛋白相互作用網絡圖（圖3），蛋白之間相互作用密切，其中，節點的大小、顏色及其深淺變化代表作用的個數，如節點大、紅色、深紅代表該靶點作用邊數越多，越重要。

圖3 靶點相互作用PPI網絡

2.6 GO分析及KEGG通路富集分析結果

2.6.1 GO 分析 將147 個共同靶點經R 語言運行后GO分析選取生物學過程（BP）、細胞組分（CC）及分子功能（MF）3 個部分。GO 結果顯示，交集基因集合共富集至2 401條生物學過程、72條細胞組分、159 個與分子功能相關的過程中。P值越小富集越顯著，3個部分根據P值最小各取count值排名前20的氣泡圖（見圖4，文字說明：Padjust 越小代表富集的顯著性，P值由小到大，顏色由紅到藍，count代表富集到GO分析中基因個數）。BP排名前20主要富集到氧化應激反應（response to oxidative stress）、腺體發育（gland development）、生殖結構發育（reproductive structure development）、上皮細胞增殖（epithelial cell proliferation）、老化（aging）等過程中。CC 排名前20 主要富集到膜筏（membrane raft）、膜微疇（membrane microdomain）、膜區（membrane region）、局灶性粘連（focal adhesion）、細胞—基底粘附體連接（cell-substrate adherens junction）等細胞組分中。MF 排名前20 主要富集到蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）、磷酸酶結合（phosphatase binding）、蛋白質酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity）、核受體活性（nuclear receptor activity）、跨膜受體蛋白激酶活性（transmembrane receptor protein kinase activity）等分子功能中。

圖4 GO分析結果

2.6.2 KEGG通路富集分析 將147個共同靶點經R語言運行后共得到156條KEGG通路，取P值小于0.05，count 值進行排名取前20 條通路結果形成KEGG 富集的氣泡圖（見圖5，文字說明：Padjust 越小代表富集的顯著性，P值由小到大，顏色由紅到藍，count代表富集通路的差異基因個數）。主要富集到癌癥中的蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）、PI3K-Akt 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌癥中的MicroRNA（MicroRNAs in cancer）、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、磷脂酶D 信號通路（phospholipase D signaling pathway）、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）等通路。活性成分拓撲分析后挖掘出7 個關鍵活性成分，共有727 個藥物靶點，刪除重復值剩228個藥物靶點。228個藥物靶點和1 217個疾病靶點取交集得到60 個關鍵活性成分作用疾病靶點，將這60 個靶點進行KEGG 通路富集分析，發現主要涉及到HIF-1 信號通路、PI3K-Akt 信號通路等信號通路。

圖5 KEGG富集通路圖

2.7 實時熒光定量PCR 法測定各mRNA 表達水平的結果

實時熒光定量PCR 結果顯示模型組VEGFA、EGFR、MAPK3 等mRNA 表達水平高于空白組（均P＜0.05），AKT1、TP53的mRNA表達水平低于空白組（均P＜0.05）；與模型組相比，桂枝茯苓湯組和米非司酮組VEGFA、EGFR 和MAPK3 mRNA 表達水平降低（P＜0.05 或P＜0.01）；米非司酮組AKT1、TP53 mRNA 表達水平高于模型組（均P＜0.01），但模型組AKT1、TP53 mRNA與桂枝茯苓湯組比較差異無統計學意義（均P＞0.05），見圖6。

圖6 AKT1、TP53、VEGFA、EGFR和MAPK3 mRNA表達水平

3 討論

本研究基于網絡藥理學復雜技術，預測中藥復方中活性成分及疾病作用靶點，從微觀角度探索桂枝茯苓湯治療子宮肌瘤的潛在作用機制。研究桂枝茯苓湯中的10 味中藥主要具有有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗腫瘤等作用，還有促性激素分泌、調節泌乳素和免疫調節等作用[16]。

基于活性成分拓撲分析，得到7 個關鍵活性成分。其中黃芩素是一種三羥基黃酮，其具有抗氧化、拮抗激素機前列腺素合成、抑制EC 1.13.11.31（花生四烯酸12-脂氧合酶）生成、清除自由基、EC 3.4.21.26（脯氨酰寡肽酶）抑制劑、抗炎和植物代謝物等作用；漢黃芩素是一種二羥基和單甲氧基黃酮，其作為環加氧酶2 抑制劑、抗腫瘤劑、血管生成抑制劑和植物代謝產物發揮作用；槲皮素是一種多酚類黃酮，具有潛在的化學預防活性?？赏ㄟ^調節EGFR或雌激素受體介導的信號轉導途徑產生抗增殖作用，槲皮素還通過抑制脂氧合酶和環氧化酶途徑產生抗炎和抗過敏作用，從而防止促炎介質的產生；木犀草素是一種天然存在的黃酮類化合物，具有潛在的抗氧化、抗炎、誘導細胞凋亡和化學預防活性，木犀草素可以清除自由基，保護細胞免受活性氧誘導的損傷，并誘導腫瘤細胞的直接細胞周期停滯和凋亡，抑制腫瘤細胞增殖并抑制轉移；5，7-二羥基-3’，4’，5’-三甲氧基黃酮是一種三甲基黃酮，屬于黃酮類，具有抗炎、抗氧化的作用；山奈素是一種四羥基黃酮，是黃酮醇、7-羥基黃酮醇和四羥基黃酮的成員，具有抗氧化應激、抗腫瘤作用；β-脫皮甾酮作為“植物類雌激素”，具有刺激蛋白質合成、保護內皮細胞免于凋亡并誘導其增殖的作用[17]。子宮肌瘤的發病因素涉及遺傳因素、生長因子及其受體過度表達、細胞凋亡與增殖改變、類固醇激素及其受體表達異常增高等方面，細胞凋亡過度抑制在子宮肌瘤的發生、發展中起到了重要作用[18]。

基于PPI 網絡分析，得到5 個關鍵靶點。AKT1是3種密切相關的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1、AKT2 和AKT3）之一，可調節許多過程，包括代謝、增殖、細胞存活、生長和血管生成。TP53 充當腫瘤抑制因子,根據生理環境和細胞類型誘導生長停滯或凋亡作為反式激活劑,參與細胞周期調節，通過控制細胞分裂過程所需的一組基因來負調節細胞分裂。VEGFA在血管生成、血管生成和內皮細胞生長中具有活性的生長因子。誘導內皮細胞增殖，促進細胞遷移，抑制凋亡和誘導血管通透性。MAPK3是磷酸腺苷激酶信號轉導途徑的重要組成部分，參與由激活的KIT和KITLG/SCF啟動的信號級聯，根據細胞環境，MAPK/ERK 級聯通過調節轉錄、翻譯和細胞骨架重排介導多種生物功能，如細胞生長、黏附、存活和分化。EGFR 是表皮生長因子家族的受體酪氨酸激酶結合配體，并激活幾種信號級聯，磷酸化的受體招募銜接蛋白相互作用積極調節細胞遷移。以上關鍵靶點與子宮肌瘤的重要發病機制-細胞凋亡過度抑制密切相關。動物實驗結果顯示，桂枝茯苓湯組EGFR、VEGFA和AKT1等mRNA表達水平比模型組明顯降低，提示桂枝茯苓湯治療子宮肌瘤的機制可能是通過作用于抗炎、抗氧化、改善細胞內皮功能等相關的靶點及通路?；贕O分析，得到藥物活性成分—作用靶點主要富集于氧化應激反應、腺體發育、生殖結構發育、上皮細胞增殖、老化等生物學過程中，和關鍵成分及靶點的功能部分相吻合?；贙EGG 分析結合文獻得到子宮肌瘤治療的核心通路為HIF-1、PI3K-Akt 等信號通路。HIF-1 信號通路通過調節關鍵環節TuberinmTOR 信號通路失調引起子宮肌瘤，mTOR 信號通路是調節細胞生長、增殖、分化的重要信號通路，提高mTOR 信號通路活性，可以調控子宮平滑肌細胞的分化，抑制細胞的增殖[19]。PI3K/Akt 信號通路是目前干預子宮肌瘤備受關注的通路之一，PI3K 活化后將下游的磷脂酰肌醇催化成二磷酸磷酯酰肌醇、三磷酸磷酯酰肌醇，下游的AKT被活化，AKT的功能涉及細胞周期調控、凋亡的啟動、細胞侵襲性等多個方面[20]。說明桂枝茯苓湯中的活性成分可能通過作用于細胞代謝、增殖、凋亡的相關通路治療子宮肌瘤。

本研究基于網絡藥理學的方法，預測和分析了桂枝茯苓湯治療子宮肌瘤的活性成分、潛在靶點及富集通路，而桂枝茯苓湯可通過槲皮素、5，7-二羥基-3’，4’，5’-三甲氧基黃酮、木犀草素等活性化合物作用于AKT1、TP53、VEGFA、MAPK3、EGFR 等多個潛在靶點，調控HIF-1 信號通路、PI3K-AKT 信號通路等達到治療子宮肌瘤的結果，體現中藥復方多成分、多靶點、多通路的特點，關鍵核心靶點VEGFA、MAPK3 均可富集到PI3K-Akt 信號通路、VEGF信號通路中。為桂枝茯苓湯的后續研究和臨床使用提供了理論基礎。但本研究也存在一定的局限性，缺乏“多中心、大樣本”的論證，有待進一步實驗驗證。