微塑料與鉛復合污染對水稻幼苗根系生長和氧化應激的影響

劉玲，洪婷婷，胡倩男，謝瑞麗，周穎，王玲，汪承潤*

（1.淮南師范學院生物工程學院，安徽 淮南 232038；2.資源與環境生物技術安徽普通高校重點實驗室，安徽 淮南 232038）

20 世紀50 年代以來，全球工業等領域實現了大規模生產，塑料產量迅速增加[1]。然而，塑料再利用率低，多數被丟棄至環境中，因物理化學作用，較大塑料被降解成粒徑小于5 mm的顆粒、碎片，形成微塑料（MPs）[2]。近年來，MPs 被認為是一種新型污染物[3]，其在海洋、河流、土壤等生態系統中皆已被發現[4?6]，MPs的大小[7]、特性[8]和豐度[9]等已得到研究。據統計，大量的設施農業生產導致了土壤中MPs含量劇增，土壤生態系統中MPs 已遠超海洋[10?11]，MPs 對土壤性質和土壤生物生長的影響引起了廣泛關注。前人研究顯示，MPs 改變了農田的結構及性質，阻礙土壤中養分運輸，進而對生物多樣性產生一定負面影響[12?14]。另外，由于MPs 粒徑小，易被濾食性動物[15]、環節動物[16?17]及鳥類[18]誤食，進一步通過食物鏈傳遞、富集到更高級生物體，引起機體器官堵塞或機械損傷及免疫系統功能受損甚至死亡[19]，影響動物的生長、繁殖等[20]，此外，MPs 對植物也有一定損傷作用。LAGARDE 等[21]指出，MPs 可與微藻、胞外多糖組成異質聚集體，推測這種異質聚集體是MPs垂直運輸的重要途徑，進而誘導微藻、衣藻毒性。SJOLLEMA 等[22]的研究表明，MPs 可降低藻類的光合作用。MPs 不僅對低等植物產生影響，當其對土壤功能產生擾動時，高等植物的生長生理特性可能也會隨之受到影響。連加攀等[23]的研究指出，MPs 減少了小麥對營養元素的吸收量，影響能量代謝的調節，降低了小麥的芽根生物量比。此外，李連禎等[24]指出，MPs既可被植物根部吸收進入維管組織進而到達地上器官，又可通過土壤?植物系統對植物生長表現出毒性效應。JIANG等[25]的研究顯示，MPs 在蠶豆根系中的大量積累很可能會阻止胞間連絲運輸營養物質而對其造成氧化損傷。因此，MPs對農田生態系統中的生產者構成了潛在威脅。

農田土壤中的污染物除MPs 外，還存在重金屬等。Pb 是當前土壤環境中污染情況較為嚴重的一類重金屬，在以土壤為生存環境的部分農作物（蕹菜、茄子、小白菜）中含量超標[26]。未處理的工業廢水和污水處理廠的沉積物用于土壤灌溉、肥料可導致作物的生長環境中MPs大量存在[27?28]，所以Pb與MPs的共存不可避免。MPs具有高疏水性和較高的比表面積，易吸附有機及重金屬污染物，已有大量研究證明MPs對Pb 有吸附作用[29?30]，且不同濃度的MPs 與Pb 會產生協同或拮抗作用[31]。目前，關于單一MPs 在植物體內的遷移及其對植物生長、氧化應激的影響有一定的研究[32?33]，但是，不同濃度的MPs 與重金屬復合脅迫下作物生長及氧化應激能力變化的研究較少。因此，本研究利用主要糧食作物水稻作為供試材料，揭示其幼苗暴露于MPs 單一或與Pb 復合脅迫環境下生長生理特性的變化規律，并深入探究MPs 與Pb 產生效應的機理，旨在為MPs生態風險評估提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試水稻為徽兩優9810，購于安徽荃銀高科種業股份有限公司。聚苯乙烯熒光微球（Fluorescent poly?styrene microspheres，PS?MPs）購自天津大鵝科技有限公司。用透射電子顯微鏡（TEM，Jeol 2100F，日本Jeol公司）表征微塑料的形貌（圖1），粒徑為（100±4.47）nm。

1.2 儲備液制備

Pb2+母液：稱量0.66 g Pb（NO3）2，用去離子水溶解，定容至100 mL，制成20μmol·mL?1的Pb離子溶液。

PS?MPs 母液：量取10 mg·mL?1PS?MPs 30 mL，用適量的去離子水溶解，使用超聲破碎儀（SCIENTZ JY92?Ⅱ，寧波新芝生物科技股份有限公司）振蕩3 min，最后定容至60 mL，制成5 mg·mL?1PS?MPs 母液備用。

1.3 試驗設計

選擇大小均勻、無損傷、飽滿的水稻種子，清水浸泡24 h 后轉移至恒溫水浴鍋（35 ℃），待種子萌發后移至鋪有潮濕紗布的托盤中，置于人工氣候培養箱內（QHX?250 BS?Ⅲ，上海新苗醫療器械制造有限公司）培養，日溫/夜溫為30 ℃/25 ℃，光照/黑暗為14 h/10 h，相對濕度為80%。待幼苗長出3 片真葉后，挑選長勢良好且株高相近的植株定植于裝有1/4 Hoagland營養液[34]的培養盒（34.7 cm×24.8 cm×9.4 cm），在人工氣候室內進行處理和培養，日溫/夜溫為28 ℃/25 ℃，光照/黑暗為15 h/9 h，每盒48 株。試驗設置的8 個處理：不添加PS?MPs 和Pb（CK）、10 mg·L?1PS?MPs（T1）、20 mg·L?1PS?MPs（T2）、40 mg·L?1PS?MPs（T3）、20 μmol·L?1Pb（T4）、10 mg·L?1PS?MPs+20μmol·L?1Pb（T5）、20 mg·L?1PS?MPs+20μmol·L?1Pb（T6）、40 mg·L?1PS?MPs+20 μmol·L?1Pb（T7），每個處理重復3 次。每周更換一次水稻處理液（優化Hoagland營養液+各處理試劑），每2 d用加氧泵通氣，21 d 后測量各項生長生理指標。PS?MPs、Pb 濃度設定分別參照李連禎等[24]、WANG等[34]的研究。

1.4 樣品采集與處理

于每培養盒隨機取出10 株幼苗（每盒取樣位置相同），用清水沖洗、擦干后剪去莖葉部分。

1.5 測定項目與方法

1.5.1 生長指標測定

用直尺（精確到0.1 cm）測根長；運用分析天平（AX224ZH/E，常州奧豪斯儀器有限公司，精確度為0.001 g）測根鮮質量；將水稻根置于105 ℃烘箱（上海?，攲嶒炘O備有限公司）中殺青0.5 h 后在80 ℃下烘干至恒質量，測干質量。

1.5.2 抗氧化酶活性測定

過氧化物酶（POD）活性采用愈創木酚比色法[35]測定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑（NBT）光化還原法[35]測定；抗壞血酸過氧化物酶（APX）和過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法[36]測定。

1.5.3 抗氧化同工酶電泳圖譜

利用聚丙烯酰胺凝膠技術進行電泳[37]，設置電泳儀（DYY?6D，北京六一生物科技有限公司）的穩定電壓為135 V，于冰浴中電泳3～4 h 后，當指示染料下行至距膠板末端1～2 cm 時停止電泳。采用氮藍四唑法[38]、乙酸?聯苯胺法[38]、淀粉法[38]分別對SOD、POD、CAT泳帶染色，APX同工酶染色采用邵巍等[39]的方法。

1.5.4 氧化損傷指標測定

丙二醛含量采用硫代巴比妥酸顯色法[40]測定；超氧自由基（）產生速率采用羥胺法[41]測定；根細胞死亡檢測采用伊文斯藍染色法[42]，后用光學顯微鏡（OLYM?PUSCX23，奧林巴斯工業有限公司）觀察并拍照。

1.5.5 樣品消解和Pb含量測定

采用硝酸?高氯酸（4∶1）消解水稻幼苗根系[43]。利用石墨爐法檢測（原子吸收光譜儀：novAA 400P，德國Analytik Jen 公司），標準樣為GBW（E）080119，灰化、原子化溫度分別為300、1 400 ℃。

1.6 數據處理

運用Excel 2016、SPSS 17.0 軟件進行數據統計和單因素方差分析，數據為平均值±標準偏差，經Dun?can 法對各處理間的差異性進行多重比較，利用Pho?toshop 軟件對同工酶圖譜進行灰度分析。使用Origin 2018軟件對統計結果做圖。

2 結果與分析

2.1 PS?MPs和Pb脅迫對水稻幼苗根系生長的影響

由表1 可知，水稻幼苗經10、20、40 mg·L?1PS?MPs 單一處理后，每株幼苗根系鮮質量、干質量顯著低于對照，20 mg·L?1PS?MPs 處理幼苗的根長與對照差異較?。≒＞0.05），40 mg·L?1PS?MPs 處理的3 個生長指標皆是最低，表明10～40 mg·L?1PS?MPs 對水稻幼苗的生長有一定的抑制作用，20 mg·L?1PS?MPs 抑制作用較低，而40 mg·L?1PS?MPs抑制作用最強。Pb單一處理下，水稻幼苗鮮質量、干質量、根長較對照分別顯著降低26.6%、44.8%、36.7%；10、20 mg·L?1PS?MPs 復合Pb 處理下，水稻幼苗根長與生物量（干質量與鮮質量）皆高于Pb 單一處理，當PS?MPs 質量濃度達40 mg·L?1時，鮮質量與根長低于Pb單一處理，可見低質量濃度（10、20 mg·L?1）PS?MPs 減輕了Pb 對水稻根系生長的抑制，高質量濃度PS?MPs 則起到了加劇作用，產生低促高抑的現象。此外，PS?MPs 復合Pb處理生長指標均低于PS?MPs 單一處理，表明Pb 與PS?MPs的復合污染對水稻根系生長的抑制具有協同效應。

2.2 PS?MPs 和Pb 脅迫對水稻幼苗根系SOD、POD、APX、CAT活性的影響

如圖2（A）所示，PS?MPs 單一處理水稻幼苗根系SOD 活性均高于對照，并隨著PS?MPs 質量濃度的增加呈先上升后下降的趨勢。10 mg·L?1PS?MPs 脅迫下，SOD 活性與對照處理接近，在20 mg·L?1PS?MPs處理水稻幼苗時，根系SOD 活性顯著增加，高達7.3 U·mg?1（以單位蛋白計，下同），是對照的1.3 倍，而當PS?MPs 質量濃度增加至40 mg·L?1時，酶活性又逐漸恢復至對照水平，說明20 mg·L?1PS?MPs較大程度提高了SOD 活性；Pb 單一處理水稻幼苗根系SOD 活性達到最大，為8.3 U·mg?1，是對照的1.4 倍；PS?MPs 復合Pb 各處理水稻根系SOD 活性較Pb 單一處理分別顯著降低了21.6%、9.1%、12.3%，可見二者復合污染中和了Pb 單一污染所引起的SOD 活性的增高，其中以低質量濃度（10 mg·L?1）PS?MPs 最為顯著。10、20 mg·L?1PS?MPs 復合處理與相應的PS?MPs 單一處理相比無顯著性差異，40 mg·L?1PS?MPs 復合處理SOD活性較該質量濃度PS?MPs單一處理則顯著提高。

由圖2（B）可知，與對照相比，PS?MPs 單一處理POD 活性整體下降，變化趨勢與SOD 活性相似，且各處理之間無顯著差異；Pb 單一處理水稻幼苗根系POD 活性降至最低，為7.4 U·mg?1，較對照顯著降低32.0%；10 mg·L?1PS?MPs 復合Pb 處理使POD 活性升至最高，為11.4 U·mg?1，是對照的1.1 倍，與10 mg·L?1PS?MPs復合處理相比，20、40 mg·L?1PS?MPs復合Pb處理抑制了水稻根系POD 活性的升高，恢復至Pb 單一處理水平。

圖2（C）表明，PS?MPs 單一處理APX 活性呈先下降后上升的趨勢，各質量濃度處理較對照相比均顯著增高了APX 活性，分別上升了42.2%、23.1%、57.0%，且在20 mg·L?1時達到最低，為9.3 U·mg?1，是對照的1.2 倍，40 mg·L?1時達到最高，為11.9 U·mg?1，是對照的1.6 倍；Pb 單一處理較對照顯著提高了42.2%；10、40 mg·L?1PS?MPs 復合處理APX 活性較Pb 單一處理分別顯著上升17.9%、28.4%，說明10、40 mg·L?1PS?MPs的存在升高了APX 活性，而20 mg·L?1PS?MPs 復合處理接近Pb單一處理水平。復合處理APX活性均高于對應的PS?MPs單一處理。

圖2（D）顯示，10、20 mg·L?1PS?MPs 單一處理的CAT 活性分別較對照顯著增高，20 mg·L?1時達到最高，為25.0 U·mg?1，是對照的2.2 倍；Pb 單一處理較對照顯著增高84.8%；復合處理隨PS?MPs 質量濃度升高呈緩慢下降趨勢，40 mg·L?1PS?MPs復合處理與Pb單一處理有顯著差異，顯示出高質量濃度PS?MPs 抑制了Pb 單一脅迫所引起的水稻根系CAT 活性的升高，即高質量濃度PS?MPs和Pb的復合污染對CAT活性的影響也存在中和效應。

2.3 PS?MPs和Pb脅迫下水稻幼苗根系同工酶圖譜及灰度分析

圖3 顯示，4 種抗氧化酶同工酶圖譜在各處理下變化不盡相同。SOD 同工酶圖譜均顯示3 條酶帶；POD 同工酶圖譜在單一Pb處理及復合處理中表達了3條酶帶，其他處理只有2條酶帶；APX 同工酶圖譜與CAT 同工酶圖譜均只出現了1 條酶帶。PS?MPs 單一處理較對照相比誘導了POD 同工酶圖譜帶型光密度的減少、總灰度值的降低（圖4）；Pb 單一及復合處理較對照處理均誘導了POD 同工酶圖譜帶型數量的增多和帶型光密度的變化。Pb 單一處理的總灰度值降至最低；10 mg·L?1PS?MPs復合處理與Pb單一處理相比帶型數量和帶型光密度明顯增加，且總灰度值升高，20、40 mg·L?1PS?MPs 復合處理較對照誘導了帶型光密度顯著減少，總灰度值降低。各處理的同工酶帶型光密度（圖3）、同工酶圖譜灰度分析（圖4）與酶活性（圖2）變化趨勢基本一致。

2.4 PS?MPs和Pb脅迫對水稻幼苗根系氧化損傷的影響

如圖5所示，3個PS?MPs單一處理水稻根系丙二醛含量與超氧自由基產生速率呈上升趨勢，各處理MDA 含量分別較對照顯著增高26.0%、35.0%、41.2%，但處理間未達到顯著水平，各處理超氧自由基產生速率分別較對照顯著增高34.5%、41.9%、60.2%，表明水稻在PS?MPs 單一脅迫下均受到嚴重損傷；Pb 單一處理MDA 含量與產生速率均升至最高，為12.7 nmol·g?1（以鮮質量計，下同）和5.7 nmol·min?1·mg?1，分別是對照的1.7、2.0 倍；PS?MPs 復合處理與Pb單一處理相比，MDA含量與產生速率有先降低再升高的趨勢，復合處理中隨著PS?MPs 質量濃度增加，MDA含量與產生速率逐漸升高，至40 mg·L?1時變化顯著，分別達到13.2 nmol·g?1、5.9 nmol·min?1·mg?1，是對照的1.8 倍與2.1 倍，超過Pb、PS?MPs單一處理水平，說明高質量濃度（40 mg·L?1）PS?MPs復合Pb處理加重了水稻幼苗生活環境的脅迫程度，PS?MPs與Pb對幼苗根系損傷表現為協同性。

2.5 根細胞死亡檢測

如圖6 所示，水稻幼苗根尖細胞染色在CK 組最淺，細胞死亡較少，能夠正常地進行細胞代謝活動。PS?MPs 單一處理與10、20 mg·L?1PS?MPs 復合Pb 處理下幼苗根尖染色較深。Pb 單一處理與40 mg·L?1PS?MPs 復合處理下染色最深，即細胞死亡情況最為嚴重。而與Pb 單一處理相比，PS?MPs 與Pb 聯合處理水稻根尖染色由淺變深，可見，低質量濃度PS?MPs減輕了Pb 對水稻根系的損傷，高質量濃度的PS?MPs則加重了Pb對水稻根系的損傷。

2.6 PS?MPs和Pb脅迫對水稻幼苗根系Pb含量的影響

表2 顯示，PS?MPs 復合Pb 脅迫下，當PS?MPs 質量濃度為10、20 mg·L?1時，根中Pb 含量均顯著低于Pb 處理，分別較Pb 單一處理降低了23.2%、24.7%；在40 mg·L?1PS?MPs處理下，水稻根系的Pb含量增加到最大，為93.1μg·g?1，是Pb 單一處理的1.1 倍?？梢?，10、20 mg·L?1PS?MPs 的存在降低了水稻根系中的Pb含量，而更高質量濃度（40 mg·L?1）PS?MPs 顯著增加了Pb在水稻根系中的積累量。

表2 PS?MPs復合Pb脅迫對水稻幼苗根系鉛含量的影響Table 2 Effects of PS?MPs combined with Pb on lead content in rice seedlings root

3 討論

3.1 PS?MPs和Pb脅迫對水稻根系生長的影響

已有研究表明MPs 會對動物產生不可逆的生理毒害，PAUL?PONT 等[44]指出其可直接誘導海洋貽貝組織、細胞和分子的毒性，影響動物體的生長繁殖。此外，MPs 對植物的生長也有抑制作用。吳佳妮等[45]研究了100 nm PS?NPs 在0、50、100、200、500、1 000 mg·L?1質量濃度梯度下對大豆幼苗生長的影響，發現在200 mg·L?1時，其對幼苗產生的抑制作用最強，根系干質量較對照降低17.1%，根長降低20.0%。本研究使用的PS?MPs 質量濃度（10、20、40 mg·L?1）雖較低，但單一處理水稻幼苗后，也不同程度地抑制了水稻根系生長，表現為隨著PS?MPs 質量濃度的增高，根系干質量較對照分別降低了16.3%、10.1%、22.8%，根長分別降低了20.3%、6.7%、14.6%，且在中等濃度下（20 mg·L?1）抑制作用最弱。推測MPs 對植物生長的抑制效應除了與質量濃度有關[46]，還與其粒徑、植物抗性等因素有關，尤其MPs粒徑可能會影響生物體對MPs的吸收和吸附，小粒徑（20、50 nm）的微塑料對植物生長影響更大，體現在微塑料對植物的附著力變大和胞外聚合物的重排[47]。水稻幼苗除了吸附MPs，也吸收重金屬。水稻根部與Pb 最先接觸，積累了較多Pb 且不易轉移，成為對Pb 污染最敏感部位[48]。AKHTAR 等[49]的研究顯示，高質量濃度Pb（500 mg·L?1）脅迫對水稻根系生長具有明顯的抑制作用，其中根長、干質量及鮮質量較對照分別降低了18.5%、21.1%、30.9%。

本研究發現在20 μmol·L?1（4.1 mg·L?1）Pb 處理下，水稻（徽兩優9810）根系根長、干質量及鮮質量較對照均顯著降低，分別降低26.6%、44.8%、36.7%，表明20μmol·L?1Pb較大程度地抑制了該水稻根系的生長，推測是根部細胞被嚴重損傷[50]。DONG 等[51]的研究指出重金屬與不同質量濃度的PS?MPs 復合會對水稻產生不同的效應，較低質量濃度（40 mg·L?1）PS?MPs能有效減弱重金屬對水稻生長的抑制，從而較單一重金屬處理促進了植物生長，高質量濃度（200 mg·L?1）PS?MPs 則加重了重金屬對水稻生長的毒害。本試驗研究結果與前人結論基本一致，10、20 mg·L?1PS?MPs 復合處理下水稻幼苗生長量高于單一Pb 處理，40 mg·L?1下根長及鮮質量低于單一Pb處理，表明低質量濃度（10 mg·L?1）PS?MPs 復合處理緩解了Pb對水稻幼苗根系生長的毒害，高質量濃度（40 mg·L?1）PS?MPs 與Pb 復合則加劇了毒害，對水稻根系生長有明顯的抑制作用，主要可能是引起了細胞的氧化應激反應，導致細胞內的ROS 含量增加，防御系統平衡被打破[51]。

3.2 PS?MPs和Pb脅迫對水稻根系氧化損傷的影響

3.3 PS?MPs和Pb脅迫對水稻根系抗氧化酶活性的影響

植物可通過體內的幾種抗氧化酶活性來應對外界脅迫，多種抗氧化酶通過協同作用使植物體內的自由基含量保持動態平衡的狀態，防止自由基過多對植物生長生理造成損傷，從而緩解外界環境對植物的毒害效應，但是當脅迫下ROS 過量積累時會通過破壞抗氧化酶的表達系統和結構，造成酶活性降低[59?60]。ZHAO 等[61]測定了水稻、大豆等作物在應對脅迫時的各項生理指標，發現抗氧化酶活性等參數比其他生理指標（如色素和總蛋白含量）更敏感，能作為有效檢測植物對脅迫響應的指標。本試驗中單一PS?MPs 處理除POD 活性低于對照以外，其他酶活性均整體高于對照，說明水稻對脅迫有一定的耐受性，各PS?MPs處理下酶活性的短暫升高是機體為免受外界脅迫而產生的調節反應，酶活性降低則表示ROS 大量消耗了抗氧化酶，且ROS 積累超出酶調節能力的閾值[62]。在低質量濃度（10 mg·L?1）PS?MPs 脅迫條件下，水稻通過SOD、APX、CAT 活性增加來中和產生的ROS，使機體免受MPs的毒害。張晨等[63]探究PS?MPs對黑藻酶活性的影響時也發現，在低質量濃度（5 mg·L?1）PS?MPs 脅迫條件下，黑藻會通過增高酶活性來使其生理生化作用免受PS?MPs的影響。而廖苑辰等[62]研究了PS?MPs（0～100 mg·kg?1）處理小麥后抗氧化酶活性的變化，其中SOD 活性始終低于對照，CAT 活性呈先降低后升高的趨勢，這與本研究結果不太一致，可能是植物種類與PS?MPs 處理濃度不同所導致的[64]。本試驗測定的SOD、CAT、APX 活性在單一Pb 脅迫時較對照均顯著增高，而POD 活性較對照低。ASHRAF等[56]在研究Pb 脅迫對水稻生理影響時也發現水稻通過改變SOD、CAT、APX、POD活性來抵抗Pb脅迫。苑文珂[31]研究重金屬在大型溞體內的積累量的結果顯示低質量濃度（0.01～10 mg·L?1）PS?MPs 能夠減少重金屬在大型溞體內的積累量，而高質量濃度（10～1 000 mg·L?1）PS?MPs 導致重金屬在大型溞體內較大程度的積累，隨著MPs 質量濃度的增加，重金屬和MPs的復合效應從拮抗作用轉變為加成作用，顯示低促高抑的效應。WANG 等[65]也表明一定質量濃度（1 mg·L?1）的MPs 與Pb 的結合對微囊藻會顯示協同作用。本研究中，低質量濃度（10 mg·L?1）PS?MPs 復合Pb 處理下4 種酶表現不盡相同，其SOD、CAT 活性較Pb 處理降低，可能是由于低質量濃度PS?MPs 減緩了水稻根系對Pb 的吸收而減輕毒害，使SOD、CAT 活性降低，而POD、APX 活性升高可能是在過量消耗后因損傷減輕而逐漸恢復其活性。高質量濃度（40 mg·L?1）PS?MPs 復合處理較低質量濃度復合處理相比有更大的危害，表現在酶活性顯著上升或抗氧化酶遭到損傷而導致活性大幅下降。推測可能是由于高質量濃度PS?MPs吸附、運載大量Pb到水稻體內而造成重金屬在水稻體內的大量積累[31]。

4 結論

（1）PS?MPs 或Pb 單一污染對水稻根系生長、氧化應激均顯示一定的危害性，且PS?MPs 的質量濃度與水稻根系的損傷有相關性。

（2）20μmol·L?1Pb對水稻根系生長、丙二醛和超氧自由基的產生及對POD、SOD活性的抑制作用均強于單一PS?MPs脅迫。

（3）低質量濃度PS?MPs（10 mg·L?1）的存在占據Pb在根部的吸附位點進而減輕了Pb對水稻根系的毒性效應，表現為拮抗作用；高質量濃度PS?MPs（40 mg·L?1）將更多的重金屬運輸到水稻體內組織并積累而產生協同作用。