AQDS和腐植酸對微生物介導(dǎo)鐵還原過程的影響

牛丹妮，弓曉峰，李遠航，孫玉恒，舒瑤，曾慧卿

（南昌大學資源環(huán)境與化工學院，鄱陽湖環(huán)境與資源利用教育部重點實驗室，南昌 330031）

直至20 世紀80 年代腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）及GS?15金屬還原菌（Geobacter metal?lareducens）[1]的成功分離，人們才真正認識到異化鐵還原過程是厭氧環(huán)境中鐵形態(tài)轉(zhuǎn)化最為重要的一部分[2]。異化鐵還原過程是土壤和沉積物中Fe（Ⅲ）還原的主要形式[3]，已成為生物修復(fù)的重要手段[4]，具有重要的地球化學意義[5]。研究表明，F(xiàn)e（Ⅲ）還原生成的Fe（Ⅱ）可催化還原U（Ⅵ）[6]、Cr（Ⅵ）[7]、Hg（Ⅱ）[8]、As（Ⅴ）[9?10]等高毒性離子[11]；利用異化鐵還原過程可進行有機氯污染修復(fù)[12]以及地下水中芳香烴化合物的降解[13]；還有研究發(fā)現(xiàn)添加Fe（Ⅲ）氧化物可抑制甲烷產(chǎn)生，其主要原因是異化鐵還原菌競爭使用了產(chǎn)甲烷所需的氫氣和乙酸鹽[14?16]。另外，異化鐵還原菌還可以以電極為電子受體，將電子傳遞給電極從而產(chǎn)生電流，這在發(fā)展生物電池、生產(chǎn)清潔能源方面發(fā)揮了重要作用[17]。

天然腐植酸[18]和腐殖質(zhì)同類物蒽醌?2，6?二磺酸鹽（anthraquione?2，6?disulfonate，AQDS）[19]是異化鐵還原過程中常見的電子傳遞物質(zhì)。研究表明，添加腐植酸或AQDS 可以促進Se（Ⅳ）、Te（Ⅳ）[20]、Cr（Ⅵ）、U（Ⅵ）[21]的還原；LOVLEY 等[22]提出，AQDS 對異化鐵還原過程的促進作用不僅體現(xiàn)在其可加速Fe（Ⅲ）的還原，還體現(xiàn)在其擴大了異化鐵還原菌對Fe（Ⅲ）的利用范圍，提高了對Fe（Ⅲ）的利用能力。雖然國內(nèi)外對添加電子傳遞物質(zhì)促進重金屬轉(zhuǎn)化和有機污染物降解已開展了大量研究，但由于腐植酸結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有大量活性官能團，因此針對不同來源天然腐植酸在異化鐵還原過程中的作用差異還鮮有報道。

為強化異化鐵還原過程，并為生物修復(fù)領(lǐng)域提供理論基礎(chǔ)，本文以腐敗希瓦氏菌為電子驅(qū)動力，以人工合成的Fe（OH）3為電子受體，通過加入不同濃度、不同來源的天然腐植酸及腐殖質(zhì)同類物AQDS，考察了電子傳遞物質(zhì)對異化鐵還原過程的影響。同時對不同來源的腐植酸進行理化性質(zhì)分析，以解釋其對異化鐵還原過程的作用差異。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

腐敗希瓦氏菌購自廣東省微生物研究所；艾略特土壤腐植酸（Elliott soil humic acid，ESHA）、泥炭濕地腐植酸（Pahokee peat humic acid，PPHA）均購自國際腐殖質(zhì)協(xié)會。

Fe（OH）3的人工合成[23]：稱取38.07 g FeCl3·6H2O于2 L 大燒杯中，加入1 L 去離子水，磁力攪拌使其溶解，滴加1 mol·L?1NaOH 溶液使pH=7.0～7.6，得到紅褐色懸液。靜置懸液，待懸液分層后傾出上層清液，加入去離子水攪拌，于4 000 r·min?1離心10 min，如此重復(fù)3次，以去除Na+的影響。最后加入1 L去離子水，攪拌得到人工合成的Fe（OH）3，其含鐵量為8.09 g·L?1。

菌懸液的制備[24]：將培養(yǎng)至對數(shù)增長期的菌懸液于4 000 r·min?1下離心，傾去上清液，用25 mmol·L?1除氧、無菌的磷酸緩沖液洗滌、離心，如此重復(fù)3 次后，用等體積的磷酸緩沖液懸浮菌體，制成菌懸液。控制菌懸液OD600=0.8，保存于4 ℃冰箱中。

腐植酸儲備液的制備：分別稱取20 mg ESHA、PPHA 溶于10 mL PIPES 緩沖溶液中，用0.1 mol·L?1NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH=7.0。磁力攪拌4 h后將腐植酸溶液過0.22μm濾膜，得到兩種腐植酸的儲備液，并保存于4 ℃冰箱中。利用總有機碳分析儀測定ESHA、PPHA儲備液的總有機碳質(zhì)量濃度分別為1 950、1 740 mg·L?1，以溶解性有機碳（Dissolved organic carbon，DOC）計。

AQDS 儲備液的制備：稱取0.412 3 g AQDS 溶于超純水中，并定容至100 mL，將定容后的溶液過0.22μm 濾膜，得到10 mmol·L?1AQDS 儲備液，并保存于4 ℃冰箱中。

1.2 實驗方法

采用厭氧培養(yǎng)的方法，在若干個10 mL 帶蓋樣品瓶中，分別加入人工合成的Fe（OH）31 mL 和5 g·L?1NH4Cl溶液1 mL，加蓋后于121 ℃滅菌20 min，冷卻后開蓋，加入過0.22μm 濾膜的25 mmol·L?1磷酸緩沖液（控制體系的pH=7.0）、電子傳遞物質(zhì)、50 g·L?1葡萄糖（以C6H12O6計）各1 mL，菌懸液1 mL。以不加菌和電子傳遞物質(zhì)（添加2 mL 無菌水處理）作為對照組，同時以只加菌而不加電子傳遞物質(zhì)（添加1 mL 無菌水處理）作為實驗組，最終溶液體積控制在6 mL。充氮除氧后壓蓋密封，于30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，并定期測定Fe（Ⅱ）質(zhì)量濃度[25]。對照組和實驗組均設(shè)置3組平行。

1.3 測定方法

1.3.1 微生物Logistics方程

異化鐵還原是微生物介導(dǎo)的生物學過程，受微生物生長過程的影響，因此用表征微生物生長的Logis?tics 方程對其進行擬合，以描述還原過程中Fe（Ⅱ）質(zhì)量濃度的變化。其表達式為：ρFe(Ⅱ)初為空白對照組測得的初始Fe（Ⅱ）質(zhì)量濃度，mg·L?1；ρFe(Ⅲ)總為人工合成Fe（OH）3的含鐵量，mg·L?1。

1.3.3 紫外?可見吸收光譜分析

選取10 mg·L?1（DOC）腐植酸在TU?1901 型雙光束紫外?可見分光光度計上進行掃描，掃描范圍為200～600 nm[27]，掃描間距為1 nm。測定波長在254、436 nm 下的吸光度E254、E436，并計算該波長下的吸光度與腐植酸所含DOC 質(zhì)量濃度的比值（E×100/ρDOC），并計作SUVA254、SUVA436；測定波長在465、665 nm下的吸光度E465、E665，計算E465/E665，簡寫為E4/E6。

1.3.4 傅里葉紅外吸收光譜分析

采用KBr 混合壓片法，通過傅里葉紅外光譜（Fourier transform infra?red spectroscopy，F(xiàn)T?IR）測定腐植酸樣品，掃描范圍為4 000～400 cm?1。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2019 進行數(shù)據(jù)初步處理，采用Origin 8.0進行數(shù)據(jù)分析并做圖，圖表中數(shù)據(jù)均為平均值±標準差。

2 結(jié)果與討論

式中：t為反應(yīng)時間，d；ρ t為反應(yīng)時間t時體系中Fe（Ⅱ）的質(zhì)量濃度，mg·L?1；a為Fe（Ⅱ）的最大積累量，mg·L?1；b為模型參數(shù)；c為速率常數(shù)。

最大還原速率Vmax=0.25ac；最大還原速率所對應(yīng)的時間。

1.3.2 Fe（Ⅱ）測定

采樣時，各處理取出一瓶，搖勻開蓋，吸取1 mL懸液加入4 mL 0.5 mol·L?1鹽酸中，于180 r·min?1的振蕩培養(yǎng)箱中浸提1.5 h。隨后將浸提液過0.22 μm 濾膜，在510 nm 下用鄰菲羅啉分光光度法測定Fe（Ⅱ）質(zhì)量濃度[26]。Fe（Ⅲ）還原率為：

式中：ρFe(Ⅱ)終為最終測得的Fe（Ⅱ）質(zhì)量濃度，mg·L?1；

2.1 不同來源腐植酸的性質(zhì)

2.1.1 元素組成

對兩種腐植酸進行元素組成分析，并通過計算C/H、C/N 的比值分析腐植酸來源和結(jié)構(gòu)的差異性。結(jié)果如表1所示。

由表1可知，兩種腐植酸的C、H、N、S含量差異不顯著（P＞0.05），說明兩者在組成上無顯著差異。C/H值可表示腐植酸的芳香性程度和脂肪性程度[28]，C/H值越大，芳香性程度越大，脂肪性程度越小。由此可知ESHA 的芳香性程度高于PPHA，其含有更多的芳香性基團；而PPHA 脂肪性程度更大，其含有更多的脂肪鏈結(jié)構(gòu)。C/N 值則表示腐植酸的腐殖化程度[29]，C/N 值越小，腐殖化程度越大，因此可知ESHA 的腐殖化程度更大，性質(zhì)更穩(wěn)定。

表1 腐植酸的元素組成Table 1 The elemental composition of humic acid

2.1.2 紫外?可見吸收光譜分析

不同來源腐植酸的紫外?可見吸收光譜曲線如圖1所示。

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腐植酸是含有苯環(huán)、羧基、酮基、羰基等各種官能團的大分子混合物，這些官能團的吸收峰靠得較近，因此在200～280 nm 出現(xiàn)了吸收峰相互重疊的現(xiàn)象[30]。由圖1（a）可知，ESHA 和PPHA 在295 nm 處均有一個吸收峰，其被認為與腐植酸中含有的木質(zhì)素磺酸及其衍生物有關(guān)[31]。在此吸收峰下，相同質(zhì)量濃度的腐植酸吸光度越大，腐殖化程度越高，由此可看出ESHA 的腐殖化程度相比于PPHA 更高，這與之前元素分析得到的結(jié)論一致。同時提供模型物AQDS 的紫外吸收光譜圖作為參考，如圖1（b）所示，在328 nm處出現(xiàn)了蒽醌特征峰。

研究表明，相同DOC 的有機物在254 nm 下吸光度的增加由含有碳?碳不飽和鍵的化合物（如芳香族化合物）引起，SUVA254為該波長下的吸光度與腐植酸所含DOC 質(zhì)量濃度的比值，該值越大，腐植酸芳香性、相對分子質(zhì)量和腐殖化程度越大[32]。由表2 可見，ESHA 的SUVA254值大于PPHA，說 明ESHA 較PPHA 含有更多不飽和共軛組分，芳香性和腐殖化程度更強。

SUVA436為腐植酸在436 nm 下吸光度乘以100 再與DOC 質(zhì)量濃度的比值，其與有機物中的醌基含量呈正相關(guān)[33]。由表2 可知，來自土壤的ESHA 醌基多于來自泥炭濕地的PPHA。

腐植酸溶液在465 nm和665 nm下的吸光度比值E4/E6是表示腐植酸結(jié)構(gòu)芳香縮合程度、相對分子質(zhì)量的特征參數(shù)，該比值越低，芳香縮合程度越高，相對分子質(zhì)量越大[34]。由表2 可知，ESHA 的芳香縮合程度和相對分子質(zhì)量大于PPHA。兩種腐植酸E4/E6值均小于5，說明兩者芳香縮合程度均較高，分子結(jié)構(gòu)較復(fù)雜[34]。在465 nm 下的吸光度E4值與醌基含量呈正相關(guān)[35]，說明ESHA 的醌基含量多于PPHA，這與SUVA436所表示的結(jié)果一致。

表2 腐植酸的紫外?可見吸收光譜特征參數(shù)值Table 2 UV?Visible absorption spectrum eigenvalues parameters of humic acid

對ESHA和PPHA各個紫外特征參數(shù)值進行方差分析，結(jié)果見表3。SUVA254、SUVA436和E4的P值均小于0.05，說明兩種腐植酸在腐殖化程度以及醌基含量上具有顯著差異，而E4/E6的P＞0.05，說明兩種腐植酸在相對分子質(zhì)量上無顯著差異，均為大分子有機物。

表3 腐植酸紫外特征參數(shù)值的方差分析Table 3 The variance analysis of UV?Visible eigenvalues parameters of humic acid

2.1.3 傅里葉紅外吸收光譜分析

由圖2 可知，兩種腐植酸出現(xiàn)了相似的吸收峰，說明兩者具有相似的結(jié)構(gòu)特征，但在吸收強度上略有區(qū)別。參考文獻[36?38]的解釋：3 300 cm?1處吸收峰由以氫鍵締合的—OH 伸縮振動形成；2 920 cm?1是脂肪族烷烴結(jié)構(gòu)中C—H 不對稱及對稱共振吸收峰，說明腐植酸含有脂肪碳鏈結(jié)構(gòu)；1 710 cm?1和1 610 cm?1處為苯環(huán)C=C 和形成氫鍵的羧基、醛基或羰基中的C=O以及N—H的伸縮振動吸收峰，說明腐植酸含有較多不飽和芳香族化合物；在1 230 cm?1處出現(xiàn)的吸收峰由羧基C—O和多糖類C—O—C伸縮振動所致。

2.2 電子傳遞物質(zhì)對微生物介導(dǎo)的鐵還原過程的影響

2.2.1 電子傳遞物質(zhì)對鐵還原過程的影響

設(shè)置AQDS 濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、4.0、8.0 mmol·L?1，以探討AQDS濃度對鐵還原過程的影響，結(jié)果如圖4 所示。由圖4 可見，在體系中添加AQDS 顯著增強了Fe（Ⅲ）的還原效果，且還原效果整體與體系中的AQDS 濃度呈正相關(guān)（P＜0.05）。體系中含有0.1～1.0 mmol·L?1AQDS 時，最終Fe（Ⅲ）還原率較只加菌的實驗組僅提高了1.40～1.94 倍。添加4.0 mmol·L?1AQDS 的實驗組在25 d 后Fe（Ⅱ）迅速累積，達到只加菌實驗組的2.77 倍。而當體系中含有8.0 mmol·L?1AQDS 時，從第8 d 開始，F(xiàn)e（Ⅲ）迅速還原，并在第16 d 趨于穩(wěn)定，最終Fe（Ⅲ）還原率達到87.98%。

2.2.2 電子傳遞物質(zhì)促進Fe（Ⅲ）還原過程的Logistics方程

用Logistics 方程擬合電子傳遞物質(zhì)促進微生物介導(dǎo)的Fe（Ⅲ）還原過程中Fe（Ⅱ）的積累過程，結(jié)果如表4和表5所示。

由表4 可知，添加了ESHA 的體系中Fe（Ⅲ）還原的最大反應(yīng)速率較只加菌的實驗組有所增加，但高質(zhì)量濃度（200、500 mg·L?1）ESHA 反而小于低質(zhì)量濃度（10～100 mg·L?1）ESHA處理。同時，相比于只加菌的實驗組，添加低質(zhì)量濃度ESHA 時，F(xiàn)e（Ⅲ）還原的最大還原速率所對應(yīng)的時間提前了4.46～7.26 d，而添加高質(zhì)量濃度ESHA 時反而延后了約7 d。由此可知，低質(zhì)量濃度ESHA 主要在反應(yīng)初期起加快Fe（Ⅲ）還原速率的作用，高質(zhì)量濃度ESHA 主要在反應(yīng)后期起增加Fe（Ⅱ）產(chǎn)生量的作用。對PPHA 而言，隨著其質(zhì)量濃度的增大，F(xiàn)e（Ⅲ）還原率變化較小，最大還原速率減小，而最大還原速率所對應(yīng)的時間相比于只加菌的實驗組提前了5.01～8.26 d。由此可知，PPHA 主要起加快Fe（Ⅲ）還原速率的作用，而對增加Fe（Ⅱ）產(chǎn)生量的作用不顯著（P＞0.05）。對比兩種腐植酸的動力學參數(shù)，在10～100 mg·L?1質(zhì)量濃度下，兩者差異并不顯著（P＞0.05）；在200、500 mg·L?1下，ESHA 達到Fe（Ⅲ）最大還原速率所對應(yīng)的時間明顯長于PPHA，但Fe（Ⅲ）還原率較PPHA 增大了近1 倍。

表4 腐植酸對鐵還原過程影響的動力學參數(shù)Table 4 Kinetics parameters of the effects of humic acid on iron reduction process

由表5 可知，隨著體系中AQDS 濃度的增大，F(xiàn)e（Ⅲ）的最大反應(yīng)速率呈現(xiàn)先減小后增大的現(xiàn)象。除4.0 mmol·L?1AQDS外，F(xiàn)e（Ⅲ）最大還原速率所對應(yīng)的時間相比于只加菌實驗組均有提前。另外，添加了AQDS 的體系中Fe（Ⅲ）最終還原率提高了0.40～2.22倍。由此可知，AQDS 既能縮短Fe（Ⅲ）還原達到平衡的時間，還能大幅提高Fe（Ⅱ）的產(chǎn)生量。

表5 AQDS對鐵還原過程影響的動力學參數(shù)Table 5 Kinetics parameters of the effects of AQDS on iron reduction process

2.3 腐植酸的作用機理

腐植酸是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子溶解性有機物（DOM），無法進入微生物細胞內(nèi)部，從而難以被降解利用。但由于腐植酸具有的醌基等氧化還原活性基團，使其可以在Fe（Ⅲ）氧化物和微生物之間轉(zhuǎn)移電子，發(fā)揮電子傳遞作用，從而克服了Fe（Ⅲ）和微生物必須直接接觸的限制，促進了異化鐵還原過程[39]。腐植酸作為一種電子傳遞物質(zhì)，其轉(zhuǎn)移電子的能力與其自身醌基基團的含量有關(guān)[40]。醌基是腐植酸在異化鐵還原過程中發(fā)揮電子轉(zhuǎn)移能力的主要基團[39]，其含量越多，越有利于Fe（Ⅲ）還原[41]。兩種腐植酸的紫外特征參數(shù)（表2）普遍得出ESHA所含醌基多于PPHA，這可能是ESHA促進Fe（Ⅲ）還原的能力要強于PPHA的原因。

研究發(fā)現(xiàn)，在加入DOM 而未加入碳源時，F(xiàn)e（Ⅲ）能少量被還原，其解釋為小分子DOM（如氨基酸、有機酸等）可作為碳源被微生物利用代謝，而當同時加入DOM 和碳源時，F(xiàn)e（Ⅲ）還原作用明顯，并且高出不加DOM 而加入碳源實驗組的51.2%。同時結(jié)合其對DOM 電子供給量（EDC）的測定，發(fā)現(xiàn)DOM 確實在Fe（Ⅲ）還原過程中存在電子轉(zhuǎn)移[42]。在垃圾填埋過程中對DOM 電子轉(zhuǎn)移能力進行測定，發(fā)現(xiàn)加入DOM后的電子轉(zhuǎn)移量顯著大于微生物和Fe（Ⅲ）直接接觸的電子轉(zhuǎn)移量[43]。JIANG 等[44]的定量實驗顯示，GS?15 向腐植酸和Fe（Ⅲ）傳遞電子的速率分別為617、23 μmol·min?1·g?1，而被微生物還原后的腐植酸向Fe（Ⅲ）傳遞電子的速率為微生物直接向Fe（Ⅲ）傳遞電子速率的7 倍以上，證實了腐植酸在異化鐵還原過程中的電子傳遞作用。在添加腐植酸而未添加碳源的異化鐵還原體系中，F(xiàn)e（Ⅲ）未發(fā)生還原，說明腐植酸不能作為碳源給微生物提供能量，只有在添加碳源后，腐植酸才能作為電子傳遞物質(zhì)發(fā)揮作用[45?46]。可見，大分子腐植酸在異化鐵還原過程中是作為電子傳遞物質(zhì)發(fā)揮促進作用。

如圖5 所示，在異化鐵還原過程中，微生物通過厭氧呼吸氧化電子供體，腐植酸接受來自有機物氧化得到的電子而轉(zhuǎn)為還原態(tài)，還原態(tài)腐植酸又將得到的電子傳遞給最終電子受體Fe（Ⅲ），而自身回到氧化態(tài)，如此循環(huán)往復(fù)[47]。電子傳遞物質(zhì)與微生物和Fe（Ⅲ）氧化物分別接觸的幾率高于微生物和Fe（Ⅲ）直接接觸的幾率，當兩者無法直接接觸時，電子傳遞物質(zhì)可起到橋梁作用[48]，將微生物呼吸鏈上的電子傳遞到Fe（Ⅲ）氧化物表面。不同來源腐植酸具有不同的電子傳遞能力，如土壤腐植酸的電子傳遞能力強于水體腐植酸，而電子供給能力弱于水體腐植酸[49]。RATASUK 等[50]和SHARPLESS 等[51]對不同來源腐植酸進行了電子傳遞能力測定，發(fā)現(xiàn)其與芳香化程度呈正比，這與本實驗得到的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

（1）泥炭濕地腐植酸（PPHA）和土壤腐植酸（ESHA）在元素組成和結(jié)構(gòu)上均具有一定的相似性，但ESHA相比于PPHA擁有更高的腐殖化程度及更多的醌基基團。

（2）ESHA 對Fe（Ⅲ）還原的促進作用體現(xiàn)在低質(zhì)量濃度ESHA 在反應(yīng)初期增大Fe（Ⅲ）還原速率，高質(zhì)量濃度ESHA 在反應(yīng)后期增加Fe（Ⅱ）產(chǎn)生量；PPHA在Fe（Ⅲ）還原過程中主要起增大Fe（Ⅲ）還原速率的作用；腐殖質(zhì)模型物蒽醌?2，6?二磺酸鹽（AQDS）不僅能加快Fe（Ⅲ）的還原速率，還能大幅提高Fe（Ⅱ）的產(chǎn)生量。三者對異化鐵還原過程的促進效果均呈現(xiàn)隨著添加濃度增大而增強的趨勢。

（3）腐植酸作為電子傳遞物質(zhì)在異化鐵還原過程中發(fā)揮作用，含有更多醌基基團的ESHA 是更有效的電子傳遞物質(zhì)。