歐李LecRLKs基因表達(dá)分析及品種間差異比較

韓紅艷,付鴻博,鄧素芳,冀愛青,趙宇,杜俊杰*

歐李基因表達(dá)分析及品種間差異比較

韓紅艷1,付鴻博2,鄧素芳1,冀愛青1,趙宇1,杜俊杰2*

1. 晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系, 山西 晉中 030019 2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院, 山西 太谷 030801

探究凝集素類受體蛋白激酶基因()與歐李抗性之間的關(guān)系，篩選抗性較高的歐李品種。本研究依據(jù)歐李轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出4個(gè)基因，利用qRT-PCR進(jìn)行其在26個(gè)歐李品種果實(shí)中的表達(dá)分析，測(cè)定部分品種的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）的含量，并與基因表達(dá)情況進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明：與在各品種中的表達(dá)量相對(duì)較高，Nongda 5、10-03和JO-1中的表達(dá)量高，與其它品種比較有顯著差異；表達(dá)量高的品種（10-03、JO-1和Nongda 5）的保護(hù)性酶含量顯著高于表達(dá)量低的品種（Y04-26、08-24和03-25）；的表達(dá)豐度與果肉色澤存在一定關(guān)系，黃色或黃紅色果肉品種10-03、09-19、15-02、X17-01和08-16的相對(duì)基因表達(dá)量較高，可作為為歐李抗逆性選育的優(yōu)勢(shì)品種。

歐李; 基因表達(dá); 種間差異

LecRLKs首次在擬南芥中被描述，其家族可分為G、L和C三種類型[1,2]。凝集素類受體蛋白激酶（Lectin receptor-like protein kinases，LecRLKs）被認(rèn)為在細(xì)胞對(duì)外部刺激的反應(yīng)中扮演重要的角色，包括病原體的侵襲和環(huán)境脅迫[3]。植物在其生長(zhǎng)發(fā)育過程中會(huì)遇到各種生長(zhǎng)逆境，LecRLKs是定位于細(xì)胞膜最先感知逆境因子信號(hào)的受體，LecRLKs及其相互作用的信號(hào)成分構(gòu)成了植物細(xì)胞表面的識(shí)別和保護(hù)系統(tǒng)，使植物細(xì)胞之間交流并與環(huán)境相互作用[4,5]。LecRLKs參與了植物的脅迫耐受性，如參與鹽脅迫下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、參與ATP的識(shí)別、參與細(xì)胞死亡的調(diào)控、參與機(jī)械損傷的信號(hào)調(diào)控等[6-9]。植物受到逆境脅迫提高LecRLKs表達(dá)量的同時(shí)啟動(dòng)自身的防御系統(tǒng)抵抗外界不良環(huán)境，抗氧化防御系統(tǒng)被啟動(dòng)，SOD、POD、CAT等含量增加更好的清除細(xì)胞內(nèi)多余的活性氧自由基，抗氧化系統(tǒng)的啟動(dòng)直接關(guān)系到植物抗逆性的強(qiáng)弱[10]。

歐李（）櫻桃屬植物，兼具經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值，抗逆性強(qiáng)。近年來，課題組從多角度研究抗性相關(guān)指標(biāo)，對(duì)歐李種質(zhì)資源進(jìn)行抗性鑒定和評(píng)價(jià)是其育種和引種的前提和基礎(chǔ)，如：DREB轉(zhuǎn)錄因子家族在提高植物抗性方面的研究[11]。歐李凝集素類受體蛋白激酶家族成員中G、C、L-型個(gè)數(shù)分別為125、43和2個(gè)，與其抗逆性密切相關(guān)。本文通過qRT-PCR檢測(cè)26個(gè)歐李品種果實(shí)中的表達(dá)差異，結(jié)合果實(shí)自身抗氧化防御系統(tǒng)各保護(hù)性酶的特征進(jìn)行分析，為篩選抗逆性品種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料取自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)歐李種質(zhì)資源圃(37°23′N, 112°29′E)，選擇26個(gè)歐李品種于2019年采集樣品，其中農(nóng)大4號(hào)歐李果實(shí)采集幼果期和成熟期果實(shí)，其余25個(gè)品種于果實(shí)成熟期采樣。采樣時(shí)分別從每個(gè)植株上、中、下部采取大小均勻一致，無(wú)病蟲害的果實(shí)10個(gè)，重復(fù)3次，采集的樣品液氮處理后，超低溫冰箱（- 80℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)試劑與儀器

TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction kit 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit）（艾德來）、離心機(jī)（Eppendorf 5424）、analytikjena-qTOWER2.2型熒光定量PCR儀（德國(guó)）、紫外分光光度計(jì)（UV-1700）、SCILOGEX D3024R離心機(jī)（美國(guó)）、analytikjena-Easycycler（德國(guó)），引物合成由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA的提取和第一鏈cDNA的合成按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction kit 試劑盒的說明書提取。反轉(zhuǎn)錄按照TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit說明書合成cDNA。

1.3.2 熒光定量分析以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，以為內(nèi)參基因，利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)qRT-PCR引物（表1），分析基因的表達(dá)水平（2-△△ct）。

表1 ChLecRLK基因qRT-PCR引物設(shè)計(jì)

1.3.3 SOD、POD、CAT活性測(cè)定選取ChLecRLK表達(dá)量高的品種（10-03、JO-1和Nongda 5）和ChLecRLK表達(dá)量低的品種（Y04-26、08-24和03-25）測(cè)定其保護(hù)性酶活性。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑光還原法[12]測(cè)定；過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法[12]測(cè)定；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法[12]測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用boxplot軟件分析，Excel、Sigmaplot繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐李果實(shí)中ChLecRLK差異基因篩選

基于農(nóng)大4號(hào)歐李果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共篩選出4個(gè)差異基因（、、和），這4個(gè)基因在成熟期的表達(dá)量明顯高于幼果期（圖1A）。通過qRT-PCR驗(yàn)證后也發(fā)現(xiàn)，這4個(gè)基因在成熟期的表達(dá)量明顯高于幼果期，這與轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果一致。COG功能注釋顯示：4個(gè)所選基因表達(dá)產(chǎn)物參與了細(xì)胞受到外界信號(hào)刺激時(shí)所開啟的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。因此，將這4個(gè)基因作為候選基因進(jìn)行分析。

圖1 ChLecRLK基因在轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)情況(A)，qRT-PCR分析ChLecRLK基因的表達(dá)情況(B)

2.2 ChLecRLK基因在不同品種歐李果實(shí)中的表達(dá)分析

通過qRT-PCR分析、、和基因的表達(dá)情況可以看出，4個(gè)基因在26個(gè)歐李品種果實(shí)中均表達(dá)，且存在品種間差異。在10-03和Nongda 5中的表達(dá)量最高與其他24個(gè)品種均呈顯著性差異（<0.05），在08-24、03-38和Y04-26三個(gè)品種中的表達(dá)量最低，在03-25歐李果實(shí)中不表達(dá)。在10-03、JO-1和Nongda 5三個(gè)品種的表達(dá)量最高且與其他品種呈顯著性差異（<0.05），在08-24、03-25和Y04-26等多個(gè)品種中的表達(dá)量均較低。在09-19和15-02中表達(dá)量較高，在其他品種中表達(dá)量均較低且均無(wú)顯著性差異。在10-03和08-16中表達(dá)量較高與其他品種呈顯著性差異（<0.05），在03-38和03-25中表達(dá)量較低。

圖2 4個(gè)ChLecRLK基因在不同品種歐李果實(shí)中的表達(dá)分析

注：不同字母表示不同品種中的表達(dá)量差異顯著（<0.05）。

Note: Different letters in the figure indicates that the expression levels of different varieties were significantly different（<0.05）.

2.3 歐李ChLecRLK基因表達(dá)量與果皮、果肉色澤相關(guān)性分析

據(jù)圖3、圖4結(jié)合表2分析基因的相對(duì)表達(dá)量與果實(shí)色澤的相關(guān)性，結(jié)果顯示：黃色果皮品種中，差異基因、和的表達(dá)量偏高，值均落在箱體中，中位線偏下，上相鄰值到箱子的距離比下相鄰值到箱子的距離長(zhǎng)，無(wú)異常值，基因表達(dá)有一個(gè)異常值，品種為09-19。4個(gè)基因的表達(dá)量值在紅色果皮品種之間較為集中，而在黃色果皮品種間差異大，但在紅色果皮品種中存在高表達(dá)異常值，在品種10-03和15-02表達(dá)異常，在品種10-03和JO-1表達(dá)異常，在品種15-02表達(dá)異常，在品種10-03、15-02和JO-1表達(dá)異常。黃色或黃紅色果肉品種4個(gè)差異基因表達(dá)量較高，中位線偏下且值異常品種為10-03、Nongda5號(hào)、09-19、15-02、X17-01、08-16和JO-1。表明：的表達(dá)量與果實(shí)色澤存在一定關(guān)系。

表2 歐李果實(shí)色澤

圖3 歐李果實(shí)ChLecRLK差異基因表達(dá)水平與果皮色澤的關(guān)系

圖4 歐李果實(shí)ChLecRLK差異基因表達(dá)水平與果肉色澤的關(guān)系

2.4 不同品種歐李果實(shí)中SOD、POD、CAT活性分析

從圖 5可知，所選6個(gè)品種的果實(shí)在成熟期均保持有SOD、POD和CAT活性，Nongda 5和JO-1兩個(gè)品種的SOD活性較高與其他四個(gè)品種呈顯著性差異（<0.05），Nongda 5的CAT和POD活性在6個(gè)品種中均最高與其他5個(gè)品種呈顯著性差異（<0.05）?？傮w來說，基因高表達(dá)量的品種（10-03、JO-1和Nongda 5）各保護(hù)性酶活性顯著高于基因低表達(dá)量的品種（Y04-26、08-24和03-25）。

圖5 不同品種歐李果實(shí)中SOD、POD、CAT活性

注：圖中不同小寫字母表示差異達(dá)0.05顯著水平。

Note：Different letters indicate significant difference among differentfruit（< 0.05）.

3 討論與結(jié)論

凝集素類受體蛋白激酶（）是表達(dá)識(shí)別和傳遞逆境信號(hào)的蛋白分子，它在植物中表達(dá)豐度的高低可以作為選育抗逆品種的指標(biāo)之一[13]。本研究通過對(duì)歐李26個(gè)品種成熟期果實(shí)中4個(gè)上調(diào)表達(dá)量分析，結(jié)果顯示：、和在品種10-03、15-02、JO-1、09-19、X17-01、08-16和Nongda 5七個(gè)品種中的表達(dá)量均顯著高于其他品種，結(jié)合表達(dá)量與果皮、果肉色澤相關(guān)性的分析，這7個(gè)品種中紅色果肉占14.2%，黃色果肉占85.8%，表明：的表達(dá)豐度與果肉色澤存在一定關(guān)系，黃肉品種10-03、09-19、X17-01、08-16和15-02可作為歐李抗逆性選育的優(yōu)勢(shì)品種。Nongda 5果實(shí)中基因的表達(dá)量及保護(hù)性酶的活性均與其他品種有顯著性差異，今后將其作為親本對(duì)開展歐李抗逆性品種選育具有重要意義。

在植物細(xì)胞中SOD、POD和CAT可清除自由基對(duì)生物膜的侵害，抑制膜脂發(fā)生過氧化，進(jìn)一步維護(hù)生物膜的結(jié)構(gòu)和功能；SOD可通過歧化反應(yīng)清除自由基生成活性較弱的H2O2，CAT與POD將其還原為H2O[14]，CAT活性增強(qiáng)可以提高植物的抗逆境能力[15]。研究表明，同一植物不同品種[16，17]、不同發(fā)育期[18]、不同亞細(xì)胞定位[19]及同一器官的不同形狀[20]體內(nèi)抗氧化酶存在明顯差異，表現(xiàn)出在抵抗脅迫和適應(yīng)環(huán)境方面的遺傳多樣性其抗氧化酶活性不同。本研究以3個(gè)高表達(dá)量品種（10-03、JO-1和Nongda 5）和3個(gè)低表達(dá)量品種（Y04-26、08-24和03-25）進(jìn)行SOD、POD和CAT活性測(cè)定，結(jié)果表明：表達(dá)量高其相應(yīng)的抗氧化防御能力高，二者在植物抗生物/非生物脅迫中存在一定的相關(guān)性，將作為今后研究的方向。

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Analysis ofGene Expression inand Comparison of Interspecific Differences

HAN Hong-yan1, FU Hong-bo2, DENG Su-fang1, JI Ai-qing1, ZHAO Yu1, DU Jun-jie2*

1.030619,2.030801,

The relationship between expression of lectin receptor protein kinase gene () and resistance ofselect the varieties with high resistance. In this study, fourup-regulated genes were screened according to the transcriptome data. Their expression abundances were detected in the fruits of 26 varieties ofby qRT-PCR methodAt the same time, the contents of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and peroxidase (POD) of some varieties were measured to correlate with gene expression.The results showed thatandhad relatively high expression levels in 26 varieties. Compared with other varieties, Nongda 5, 10-03 and JO-1 have high expression levels and the difference was significant. The contents of protective enzymes in varieties with highexpression levels including 10-03, JO-1 and Nongda5 were significantly higher than those in varieties with low expression including Y04-26, 08-24 and 03-25. The expression abundance ofhad relationship with the color of the pulp.differential gene expression levels of yellow or yellow-red flesh varieties including 10-03, Nongda 5, 09-19, 15-02, X17-01 and 08-16 were high. Therefore, they can be used as the dominant varieties for resistance breeding of.

; gene expression; interspecific difference

Q946

A

1000-2324(2021)06-0916-06

2021-08-05

2021-09-04

晉中學(xué)院“1331工程”創(chuàng)客團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(Jzxycktd2017009);山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(201801D121251)

韓紅艷(1976-),女,碩士,副教授,研究方向:果樹種質(zhì)資源研究與創(chuàng)新. E-mail:hhy0822@126.com

通訊作者:Author for correspondence. E-mail:djj738@163.com