提取櫻桃中植物病毒RNA方法的建立與優化

劉杰,于成明,陳芳龍,郭靜靜,IDA BAGUS ANDIKA,曹欣然*

提取櫻桃中植物病毒RNA方法的建立與優化

劉杰1,于成明2,陳芳龍1,郭靜靜1,IDA BAGUS ANDIKA1,曹欣然1*

1. 青島農業大學植物醫學學院,山東 青島 266109 2. 山東農業大學植物保護學院,山東 泰安 271018

RNA提取是現代分子生物學中的一項常用技術，是后續試驗的基礎。櫻桃樣品中富含大量的糖類和酚類物質，同時富含降解RNA酶，為提取高質量的RNA帶來了極大的困難。為探尋能夠提取櫻桃中高質量RNA以滿足Northern Blot等分子實驗的要求，對近年來國內外常用的RNA提取方法進行了篩選和歸納，進行優化并同商品化試劑盒進行了比較和評價分析。結果表明：盡管適用于櫻桃RNA提取的方法有很多，但其在提取櫻桃總RNA的效果各有不同，試劑盒B提取的RNA質量好，改良SDS法可以提取出純度高且量大的櫻桃總RNA，改良CTAB法次之。

櫻桃; 植物病毒; 提取RNA

提取核酸和蛋白質是分子生物學中最基礎但也是最關鍵的方法。它是后續實驗和產品開發(包括診斷試劑盒)的起點[1]。提取高質量的RNA對于Northern雜交實驗至關重要[2-4]，分離出的核酸質量和完整性將直接影響所有后續實驗的結果[5]。常見的分離提取試劑有SDS和CTAB兩種；同時在富集核酸時也可以使用Oligo(dT)富集柱[6]和功能化磁珠[7]等方法。高質量的核酸應不含污染物，常見的污染物包括蛋白質、碳水化合物、脂質或酚類等[1]，可通過添加還原劑、螯合劑、氧化抑制劑等方法去除酚類化合物，可通過鹽酸胍、低濃度乙醇、高濃度NaCl等去除多糖，可通過加入蛋白質變性劑去除蛋白質[4]。

櫻桃(Sweet Cherry)為薔薇科櫻屬落葉果樹，櫻桃葉片與根莖組織內多糖、多酚及色素等次生代謝物質含量很高，提取RNA時受這些成分的干擾嚴重[8]。同時櫻桃組織中核糖核酸酶含量較高，提取過程中RNA易降解；組織中含水量高，導致核酸濃度低等問題[9]。常規提取方法不能有效去除櫻桃中富含的多糖多酚等雜質，不能有效抑制RNA酶的分解，導致提取的RNA不能適用于Northern雜交等后續實驗[9]。因此，本試驗通過改良傳統的SDS與CTAB法，使其適用于櫻桃葉片的高質量RNA提取，用于后續實驗，可為提取其他植物組織材料中也富含多糖多酚類的RNA提供參考指導。

1 材料與方法

1.1 材料

櫻桃葉片采集自青島農業大學城陽校區附近果園

1.2 試劑

RNA Extraction Buffer:0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8）、0.01 mol/L EDTA、0.5 % SDS、0.05 mol/L NaCl；CTAB:2 % (w/v)CTAB、0.1 mol/L Tris-HCl (pH=8)、0.02 mol/L EDTA、1.4 mol/L NaCl；8 mol/L LiCl；3 mol/L NaAC （pH=5.2）；5 mol/L KAC （pH=5.8）；無水乙醇；5 mol/L NaCl；DEPC 處理過的 ddH2O；異丙醇；酚仿（苯酚:氯仿:異戊醇=25:24:1）；氯仿異戊醇（氯仿:異戊醇=24:1）；PVP；PVPP；β-巰基乙醇；以上所有試劑均為分析純。試劑A：AG RNAex Pro Reagent購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；試劑B：TAKARA RNAiso plus購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；試劑C：TAKARA RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；試劑盒A：TRANS TransZol Plant購自北京全式金生物技術有限公司；試劑盒B：TIANGEN RNA Easy Fast Plant Tissue Kit購自天根生化科技（北京）有限公司；試劑盒C：AG SteadyPure Qiuck RNA Extraction Kit購自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.3 RNA提取方法

傳統SDS法：傳統SDS法沿用同實驗室Andika等[10]的方法。傳統CTAB法：傳統CTAB提取方法參考河北農業大學張愷愷等[11]的方法。商品化RNA提取試劑方法參照各自說明書。

1.4 實驗設計

將RNA提取過程分為研磨提取過程、抽提雜質過程、沉淀過程、三個部分。根據這三個過程，設計單因素變量進行RNA提取方法優化。

1.4.1提取過程優化使用RNA Extraction Buffer作為提取液，又分別加入（1）1 %體積的β-巰基乙醇[12]；（2）0.2 g PVP[13]；（3）0.02 g PVPP[12]；（4）1 %體積的β-巰基乙醇和0.2 g PVP[12,14,15]；（5）1 %體積的β-巰基乙醇和0.02 g PVPP[9]；（6）0.2 g PVP和0.02 g PVPP；（7）1 %體積的β-巰基乙醇、0.2 g PVP和0.02 g PVPP[16]七組以及對照組，其余步驟相同。使用CTAB作為提取液，也同樣添加以上7組試劑以及對照組，其余步驟相同。

1.4.2 抽提過程優化使用RNA Extraction Buffer作為提取液，在抽提時分別采用以下方式進行：（1）氯仿抽提1次；（2）氯仿異戊醇（24:1）抽提1次；（3）酚仿（25:24:1）抽提1次；（4）酚仿抽提1次，氯仿抽提1次；（5）酚仿抽提1次，氯仿異戊醇抽提1次；（6）酚仿抽提兩次；（7）酚仿抽提1次，取上清加入1/2體積NaCl和1/2體積氯仿異戊醇抽提1次[17,18]；（8）酚仿抽提1次，取上清加入1/3體積KAC混勻冰浴30 min，加入等體積氯仿異戊醇抽提1次；（9）酚仿抽提1次，取上清加入1/10體積KAC和1/5體積無水乙醇冰浴30 min，加入等體積氯仿異戊醇抽提1次。使用CTAB作為提取液，也同樣添加以上9組試劑，其余步驟相同。

1.4.3 沉淀過程優化沉淀過程分別對沉淀試劑和沉淀方法進行優化；沉淀試劑分別使用異丙醇-NaAC和LiCl，其余步驟相同；沉淀方式分別采用離心管沉淀和富集柱沉淀，其余步驟相同。

2 結果與分析

2.1 提取過程

使用RNA Extraction Buffer時，添加β-巰基乙醇、PVP和PVPP的處理提取效果最好，添加PVPP和β-巰基乙醇效果次之；使用RNA Extraction Buffer所有處理中，添加β-巰基乙醇效果明顯優于未添加的處理。當使用CTAB時，添加PVP和PVPP的處理提取效果最好，添加β-巰基乙醇、PVP和PVPP的處理次之，在使用CTAB的所有處理中含有PVPP的處理均優于未添加PVPP的處理。在相同處理條件下，使用CTAB作為提取緩沖液的RNA濃度高于使用RNA Extraction Buffer。

2.2 抽提過程

當使用RNA Extraction Buffer 時，進行兩次酚仿抽提的處理效果最好，進行一次酚仿抽提，一次氯仿異戊醇抽提的處理次之；對于所有處理，兩次抽提效果明顯優于一次抽提效果，但兩次抽提會損耗部分RNA。使用CTAB處理結果與RNA Extraction Buffer結果一致。經過此次優化后，抽提兩次后，使用CTAB的處理RNA損耗高于使用RNA Extraction Buffer的處理。

2.3 沉淀過程

使用RNA Extraction Buffer處理中，使用LiCl作為沉淀試劑的效果明顯優于使用異丙醇-NaAC。當使用CTAB處理中，使用LiCl作為沉淀試劑的效果略低于使用異丙醇-NaAC。

使用富集柱法的處理中，其RNA質量與對照組無明顯差異，但使用富集柱法的處理中，離心時間縮短，沉淀溶解時間縮減，可大幅縮短沉淀時間。

2.4 最終優化方案

改良SDS法提取過程中使用RNA Extraction Buffer同時添加β-巰基乙醇、PVP和PVPP；抽提過程使用兩次酚仿抽提；沉淀過程使用LiCl作為沉淀試劑。改良CTAB法提取過程中使用CTAB同時添加PVP和PVPP；抽提過程使用兩次酚仿抽提；沉淀過程使用異丙醇作為沉淀試劑。結果顯示，改良SDS法與改良CTAB法均優于傳統SDS法和傳統CTAB法，且在所有組別中改良SDS法最優，改良CTAB法次之。在商品化試劑中，試劑盒B最優。

圖1 RNA質量比較

注：使用1 %TAE瓊脂糖凝膠，點入等量的樣品進行電泳。依據膠圖樣品順序，在研磨樣本量均為0.2 g的條件下，使用微量分光光度計測量濃度，結合加水量計算RNA提取總量，RNA提取量=RNA濃度×加水量。

Note: We used 1% TAE agarose gel and added equal volume samples. According to the order of the samples on the gel picture, under the condition that the sampling quantities were 0.2 g, we measured the concentration with a micro spectrophotometer, and calculated the total RNA extracted quantity considered with the amount of water added. RNA extraction quantity = RNA concentration × Amount of water added.

3 討論

提取高質量的RNA是Northern Blot的核心關鍵步驟。植物組織中存在的蛋白質、多糖多酚以及其他次生代謝物質嚴重影響了RNA的提取，尤其是甜櫻桃葉片組織中富含多糖多酚。在植物細胞空間內，這些物質是與核酸分離的，但當植物細胞被研磨破碎后，這些物質就會與RNA產生相互作用[19]。酚類化合物被氧化后會與RNA結合，該過程不可逆，并會導致RNA的活性喪失；多糖會與RNA共沉淀形成難溶的膠狀物；無論內源還是外源的RNase均會造成RNA的降解；同時細胞中的次級代謝產物極易與RNA結合，從而阻礙RNA的分離。因此能否有效地去除甜櫻桃葉片中多糖、酚類化合物、RNase和其它代謝產物是能否提取到高質量RNA的關鍵[19-22]。

本實驗中使用傳統SDS法的樣品濃度最高，但條帶降解較重；改良SDS法的樣品濃度與傳統SDS法差別不大，并且條帶完整，非常適合后續核酸分子雜交試驗；試劑盒B雖然條帶完整性較好，但其濃度較低；傳統SDS法與傳統CTAB法濃度相對較高，RNA條帶降解嚴重，均不能滿足Northern Blot要求。其他試劑雖然濃度相對較高，但是條帶幾乎不可見，推測是RNA降解導致，但可以滿足RT-PCR及常規分子生物學實驗要求。吸附柱的沉淀方法對于RNA質量并無明顯提升，但是可以有效減少RNA沉淀過程的耗時。

本研究優化出改良SDS法，可提取出櫻桃樣品中高質量的RNA，RNA完整性較好，濃度高，可滿足后續Northern雜交。改良SDS法比天根試劑盒性價比高，但總提取時間較長，可根據實驗室具體情況進行選擇。尤其在進行大批量Northern雜交實驗時，更適宜選擇改良SDS法。若RT-PCR等常規分子生物學實驗時，也可以選擇傳統方法和商品化試劑。若進行快速檢測時，商品化試劑盒更為適合。總而言之，該RNA提取方法的建立為櫻桃樣品的分子生物學研究提供了的技術基礎，同時也為其他富含多糖多酚的植物材料的RNA提取有提供了借鑒。

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Establishment and Optimization of the Method Extracting the Virus RNA from Sweet Cherry

LIU Jie1, YU Cheng-ming2, CHEN Fang-long1, GUO Jing-jing1, IDA BAGUS ANDIKA1, CAO Xin-ran1*

1.266109,2.271018,

RNA extraction is a common technology in modern molecular biology and the basis of subsequent experiments. Sweet cherry samples are rich in carbohydrate and phenolic compound, as well as RNase, which brings great difficulties to extract high-quality RNA. In order to explore the extraction of high-quality RNA from cherry for the requirements of Northern blot and other molecular experiments. During recent years the commonly used domestic and international RNA extraction methods were screened and summarized. We also optimized the RNA extraction methods, and the RNA extraction methods were compared with the commercial RNA extraction kit. The results showed that although there are many methods for extracting plant virus RNA from sweet cherry, the effects of extracting total RNA were different. The quality of RNA extracted by kit B is good. The improved SDS method can extract total RNA with the highest purity and quantity. The improved CTAB method is less effective than the improved SDS method.

Sweet cherry; plant virus; RNA extraction

[Q939.46]

A

1000-2324(2021)06-0922-04

2021-06-08

2021-07-25

國家自然科學基金(32001867,31970159);山東省自然科學基金(ZR2020QC129)

劉杰(1994-),男,碩士研究生,研究方向:分子植物病毒學. E-mail:904328951@qq.com

通訊作者:Author for correspondence. E-mail:xinran1001@163.com