一株副溶血性弧菌拮抗菌的篩選、鑒定及其抑菌物質(zhì)特性研究

劉婷,尹啟蒙,周滟晴,趙帥東,季旭,張曉妍,王浩鵬,汪立平,2,3*,樊現(xiàn)遠(yuǎn)

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海,201306) 2(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室,上海,201306) 3(上海海洋大學(xué) 食品熱加工工程技術(shù)研究中心,上海,201306)4(青島海德誠生物工程有限公司,山東 青島,266000)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌,廣泛存在于世界范圍內(nèi)的河口和海洋環(huán)境中,不僅是引起水產(chǎn)養(yǎng)殖(特別是蝦類養(yǎng)殖)中細(xì)菌性疾病出現(xiàn)的主要致病菌,還是海產(chǎn)品中引起人類食源性疾病的最常見病原菌[1]。目前防控副溶血性弧菌感染最主要的方式是使用抗生素,但是抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖和農(nóng)業(yè)中的濫用已導(dǎo)致許多細(xì)菌出現(xiàn)了耐藥性,特別是出現(xiàn)了具有多重抗生素耐藥性的副溶血性弧菌菌株,對人類健康和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重的威脅[2]。因而尋求抗生素的理想替代品迫在眉睫。

抗菌肽是生物體經(jīng)誘導(dǎo)而自身合成的一種具有生物抗菌活性的小分子蛋白質(zhì),多數(shù)具有強(qiáng)堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性以及殺菌、抗菌等特點(diǎn),且不易使病原微生物產(chǎn)生耐藥性,可對動物和人類的健康發(fā)揮重要作用。其中,細(xì)菌抗菌肽還具有生產(chǎn)周期短、成本低、得率高、提取容易等優(yōu)勢,被認(rèn)為是傳統(tǒng)抗生素的理想替代品[3]。因此,利用細(xì)菌產(chǎn)生的抗菌肽來控制副溶血性弧菌的感染已經(jīng)成為一個重要的發(fā)展趨勢和研究方向[4]。當(dāng)前可產(chǎn)生抗菌肽的細(xì)菌中研究較多的是乳酸菌和芽胞桿菌,但乳酸菌所產(chǎn)抗菌肽的抑菌譜較窄,而芽胞桿菌本身具有抗逆性,對環(huán)境的適應(yīng)力更強(qiáng),且其所產(chǎn)抗菌肽的種類多,抑菌譜廣,因此具有更大的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值[5]。目前已有將枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)所產(chǎn)抗菌肽應(yīng)用于防治副溶血性弧菌感染的研究,如PU等[6]表明枯草芽胞桿菌產(chǎn)生的抗菌肽不僅可以抑制副溶血性弧菌,還可以改善蝦類的生長。另外,CHENG等[7]從枯草芽胞桿菌E20發(fā)酵豆粕中提取出了抗菌肽FSB-AMP,其可抑制蝦類養(yǎng)殖中的弧菌感染。然而,目前來自海洋環(huán)境中的產(chǎn)抗菌肽的枯草芽胞桿菌的報(bào)道較少,部分枯草芽胞桿菌所產(chǎn)抗菌肽對副溶血性弧菌的抑制作用不夠強(qiáng),抑菌特性的研究也不夠深入。

本文從蘆潮港的海泥中篩選出1株產(chǎn)廣譜抗菌肽的枯草芽胞桿菌,其對副溶血性弧菌、腐生葡萄球菌和大腸桿菌等致病菌有較強(qiáng)的抑制作用,并對其生物學(xué)性質(zhì)和抑菌譜進(jìn)行了研究,為該抗菌肽的深入研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品

海泥：上海市浦東新區(qū)臨港新城蘆潮港附近海域的海灘。

1.1.2 指示菌及培養(yǎng)條件

供試指示菌的種類和來源見表1,細(xì)菌于37 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h,酵母菌于30 ℃,150 r/min培養(yǎng)16 h。

表1 指示菌種類及來源Table 1 Origins and classification of indicator strains

1.1.3 培養(yǎng)基

目標(biāo)菌株分離純化與形態(tài)觀察所用培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基。

目標(biāo)菌株初篩培養(yǎng)基：Landy液體培養(yǎng)基[8](葡萄糖20.0 g/L,L-谷氨酸5.0 g/L,酵母提取物1.0 g/L,L-苯丙氨酸 2.0 mg/L,KCl 0.5 g/L,KH2PO41.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,FeSO4·7H2O 0.15 g/L,MnSO45.0 mg/L,CuSO4·5H2O 0.16 mg/L,pH 7.0)。

目標(biāo)菌株復(fù)篩所用種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基：Landy液體培養(yǎng)基[8]。

指示菌培養(yǎng)基：單核細(xì)胞增生李斯特菌采用胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯(tryptic soy broth-yeast extract,TSB-YE)培養(yǎng)基培養(yǎng),其他細(xì)菌采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng),真菌采用YPD培養(yǎng)基培養(yǎng),劃線純化時固體培養(yǎng)基中瓊脂含量為1.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),進(jìn)行抑菌試驗(yàn)時培養(yǎng)基中瓊脂含量為1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))[9]。

1.1.4 試劑及儀器

Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)及1492R(5′-GGTTACCTTGTTAGG ACTT-3′)、木瓜蛋白酶,生工生物工程(上海)股份有限公司；堿性蛋白酶,北京索萊寶科技有限公司；其他化學(xué)試劑,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

LDZX-30FA型立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1F型超凈工作臺,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司；PHS-25型pH計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；ZQWY-218V型臥式大容量全文振蕩培養(yǎng)箱、ZHSY-50S型水浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱,上海知楚儀器有限公司；H2050R型高速冷凍離心機(jī),湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀,北京六一儀器廠；A300型PCR儀,杭州朗基科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海泥樣品中菌株的分離

稱取10 g海泥樣品于盛有90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中,均質(zhì)后90 ℃恒溫水浴10 min以殺死大部分的非芽胞桿菌,再接著用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-5。分別吸取稀釋度為10-2、10-3、10-4、10-5的稀釋液100 μL均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。選取稀釋倍數(shù)合適的平板,挑取具有芽胞桿菌典型形態(tài)的菌落進(jìn)行劃線純化,純化3次后編號并用甘油保藏。

1.2.2 抗副溶血性弧菌菌株的初篩與復(fù)篩

初篩：采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行菌株初篩[10]。將上述純化后的菌種接種至Landy液體培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h后,將發(fā)酵液置于4 ℃冰箱中備用。將副溶血性弧菌(V.parahaemolyticusATCC 17802)接種至LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h后,制備成菌濃度為107CFU/mL的指示菌懸液。將15 mL LB培養(yǎng)基(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂)與50 μL指示菌懸液混合均勻后,倒入直徑為90 mm的無菌平板內(nèi)。待其完全凝固后打孔(直徑為7 mm),每孔加入發(fā)酵液50 μL,置于37 ℃培養(yǎng)12 h。觀察孔周圍是否形成抑菌圈。試驗(yàn)重復(fù)3次,選擇具有抑菌活性的菌株進(jìn)行下一步復(fù)篩。

復(fù)篩：將初篩得到的活性菌株于LB固體培養(yǎng)基上劃線活化3次后,將單菌落接種到Landy種子培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h后,再以5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種到Landy發(fā)酵培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h。然后將發(fā)酵液于4 ℃、10 000 r/min離心15 min,上清液經(jīng)過0.22 μm的無菌濾膜過濾得到無細(xì)胞上清液,置于4 ℃冰箱中備用[9]。以副溶血性弧菌(V.parahaemolyticusATCC 17802)、蠟樣芽胞桿菌(BacilluscereusAS-1)、大腸桿菌(EscherichiacoliBL21)和炭疽桿菌(BacillusanthraciDS-1)為指示菌,采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行復(fù)篩,按照上述初篩的方法制備各指示菌平板,每孔加入50 μL無細(xì)胞上清液,37 ℃培養(yǎng)12 h后,測定抑菌圈的直徑,試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 活性菌株H5的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：先采用平板劃線法對活性菌株H5進(jìn)行3次純化,得到單菌落后根據(jù)菌落的形態(tài)特征進(jìn)行初步判斷,再采用革蘭氏染色法對其進(jìn)行染色,在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)一步觀察其染色情況和形態(tài)。

分子生物學(xué)鑒定：使用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒對活性菌株H5的DNA進(jìn)行提取,以提取出的H5基因組DNA為模板,27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)為引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增[11]和瓊脂糖凝膠電泳,然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送到生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。然后將測序所得的16S rDNA序列在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中利用BLAST功能進(jìn)行同源性比對,并使用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,最后將該菌株的16S rDNA序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中。

1.2.4 活性菌株H5所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌譜測定

選用包括革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和酵母菌在內(nèi)的22株菌株作為檢測的指示菌,按照1.2.2中的方法測定活性菌株H5的無細(xì)胞發(fā)酵上清液對這些指示菌的抑制作用,每孔50 μL,37 ℃培養(yǎng)12 h后,測量抑菌圈的直徑,試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 活性菌株H5所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的理化性質(zhì)

1.2.5.1 熱穩(wěn)定性

分別取等量無細(xì)胞發(fā)酵上清液于離心管中,置于0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、121 ℃條件下各處理10和30 min,然后立即用冰水浴冷卻至室溫,以未經(jīng)處理的無細(xì)胞發(fā)酵上清液為對照,以副溶血性弧菌ATCC 17802為指示菌,采用1.2.2中的方法測定抑菌圈直徑,并按照J(rèn)AMALUDDIN等[12]的方法計(jì)算抑菌活性,試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5.2 酸堿穩(wěn)定性

分別取等量無細(xì)胞發(fā)酵上清液于離心管中,用5 mol/L的HCl溶液和5 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)樣品的pH,使其pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0,以加無菌水至相同體積的無細(xì)胞上清液為對照,37 ℃水浴1 h后[13],再調(diào)節(jié)pH值至7.0,并用無菌水定容至相同體積,抑菌活性的測定和計(jì)算方法同上,試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5.3 紫外線穩(wěn)定性

分別取等量無細(xì)胞發(fā)酵上清液于離心管中,置于距30 W紫外燈90 cm處照射10、20、30、40、50、60 min后[9],以未經(jīng)處理的無細(xì)胞發(fā)酵上清液為對照,抑菌活性的測定方法和計(jì)算方法同1.2.5.1,試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5.4 金屬離子穩(wěn)定性測定

配制濃度均為100 mmol/L的NaCl、KCl、MnCl2、MgCl2、CaCl2、ZnCl2和AlCl3溶液,滅菌后備用。分別取等量無細(xì)胞發(fā)酵上清液于離心管中,并分別加入上述溶液使得體系中Na+、K+、Mn2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Al3+的終濃度為10 mmol/L[14],以加入相同體積無菌水的無細(xì)胞上清液為對照,室溫靜置2 h。抑菌活性的測定方法和計(jì)算方法同1.2.5.1試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5.5 有機(jī)溶劑穩(wěn)定性測定

取等量無細(xì)胞發(fā)酵上清液于離心管中,分別與等體積的丙酮、甲醇、乙醇、乙腈混合,對照組加入等體積的無菌水,室溫下作用2 h[15],抑菌活性的測定方法和計(jì)算方法同1.2.5.1試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5.6 蛋白酶敏感性

將胃蛋白酶用25 mmol/L HCl-KCl(pH 2.0)配制成4 mg/mL的母液,中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K用25 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)也分別配制成4 mg/mL的母液,分別加入到等量的無細(xì)胞發(fā)酵上清液中,使得樣品中各酶的最終質(zhì)量濃度均為1 mg/mL,調(diào)節(jié)pH值至各酶作用的最適pH值,以加入相同體積無菌水的無細(xì)胞上清液為對照,37 ℃條件下水浴2 h后,再將pH值調(diào)節(jié)至7.0[16],用無菌水定容至相同體積。抑菌活性的測定方法和計(jì)算方法同1.2.5.1,試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗副溶血性弧菌菌株的篩選

本試驗(yàn)從上海市蘆潮港海泥樣品中共分離得到90株具有明顯芽胞桿菌形態(tài)的菌株,依次編號為H1～H90。經(jīng)過初篩共得到15株對副溶血性弧菌有抑菌活性的菌株,進(jìn)一步復(fù)篩后得到6株可產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的活性菌株,分別為菌株H1、H5、H17、H18、H20和H26,其對4種致病菌的抑菌效果如表2所示。菌株H17僅對副溶血性弧菌有抑制作用,菌株H1、H18和H26都僅對4種致病菌中的其中3種有抑制作用,而菌株H5和H20對4種致病菌均有抑制作用,且菌株H5的抑菌活性更顯著,因此選擇菌株H5進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

表2 具有抑菌活性的菌株對4種致病菌的抑制作用Table 2 Inhibition effect of antimicrobial bacteria against four pathogenic bacteria

2.2 活性菌株H5的鑒定

2.2.1 活性菌株H5的形態(tài)學(xué)觀察

如圖1-a所示,活性菌株H5在LB固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)12 h后,菌落為微黃色、圓形、隆起,邊緣整齊,不透明,表面粗糙；如圖1-b所示,菌株H5經(jīng)革蘭氏染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察,菌體呈紫色,證明該菌株為革蘭氏陽性菌,菌體呈桿狀,可初步判斷菌株H5屬于芽胞桿菌屬。

a-LB固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)； b-革蘭氏染色形態(tài)(1 000×)圖1 菌株H5的形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Morphological features of strain H5

2.2.2 活性菌株H5的分子鑒定

以27F和1492R為引物,菌株H5的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測,在1 000～2 000 bp處形成1條清晰的擴(kuò)增條帶,將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果顯示,菌株H5的16S rDNA序列大小為1 101 bp,采用MEGA 5.0軟件以芽胞桿菌屬下的8個種的模式菌株的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,進(jìn)行1 000次bootstrap測試分析,結(jié)果如圖2所示。

其中相似性最高的是B.subtilisstrain NBRC 13719T(NR 112629.1),相似性為98.72%,其次是Bacillusvallismortisstrain DSM 11031T(NR 024696.1),相似性為98.61%,表明菌株H5在親緣關(guān)系上與枯草芽胞桿菌最為相近。因此,結(jié)合菌落形態(tài)學(xué)特征、菌株形態(tài)學(xué)特征和16S rDNA序列分析,將菌株H5鑒定為枯草芽胞桿菌。將菌株H5的測序結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中,登陸號為MK880419.1。

圖2 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的枯草芽胞桿菌H5 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of B.subtilis H5 based on 16S rDNA gene sequence

2.3 枯草芽胞桿菌H5的抑菌譜

如表3所示，通過對包括常見的致病菌和酵母菌在內(nèi)的22株指示菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)B.subtilisH5對所有供試的9株革蘭氏陽性菌、除嗜水氣單孢菌以外的8株革蘭氏陰性菌和3株酵母菌均有抑制作用，且對革蘭氏陽性菌抑菌的抑制作用要大于革蘭氏陰性菌。

表3 枯草芽胞桿菌抑菌譜Table 3 Antimicrobial spectrum of B.subtilis H5

B.subtilisH5對10株革蘭氏陰性菌的抑菌圈直徑在(10.86±0.21)～(32.05±0.10)mm，其中對副溶血性弧菌ATCC17802的抑制作用最強(qiáng)，其次是大腸桿菌和銅綠假單胞菌；其對9株革蘭氏陽性菌的抑菌圈直徑為(13.08±0.12)～(27.92±0.06)mm，其中對金黃色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌ATCC19114有強(qiáng)烈的抑制作用。而朱晶婷[17]篩選出的枯草芽胞桿菌D9產(chǎn)生的抗菌肽僅對哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、金黃色葡萄球菌有抑制作用，且抑菌圈直徑均小于12.0 mm。此外，孫珊[18]篩選出的枯草芽胞桿菌W321所產(chǎn)抗菌肽可抑制沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌等10株致病菌。由此可見，B.subtilisH5所產(chǎn)的抑菌物質(zhì)具有廣譜的抑菌活性2。

2.4 枯草芽胞桿菌H5所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的理化性質(zhì)

2.4.1 熱穩(wěn)定性

由圖3可知,B.subtilisH5產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)在10～70 ℃下處理10 min時,其抑菌活性無顯著變化；在80～100 ℃分別處理10和30 min后,其抑菌活性稍有下降,且在100 ℃條件下處理30 min,其抑菌活性僅下降了21%；在經(jīng)過高壓蒸汽滅菌(121 ℃,30 min)后,仍保留62%的抑菌活性。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),B.subtilisR75和H19產(chǎn)生的抗菌肽僅在121 ℃處理10 min后,其抑菌活性基本喪失,不能耐受高壓蒸汽滅菌[9,19]。結(jié)果表明,B.subtilisH5產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性,可以在巴氏殺菌和高壓蒸汽滅菌的條件下保持較高的抑菌活性,為其在食品加工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

圖3 溫度對B.subtilis H5所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響Fig.3 Effect of temperature on antimicrobial substance produced by B.subtilis H5

2.4.2 pH穩(wěn)定性

由圖4可知,B.subtilisH5產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)在中性和中酸性條件下的抑菌活性較高,在堿性條件下的抑菌活性略低于在酸性條件下的抑菌活性,尤其是在pH>9.0時,其抑菌活性明顯下降。白杰等[20]和ANGELIKI[21]等的研究均表明抗菌肽在堿性環(huán)境中的活性損失更大,這與本研究的結(jié)果一致。另外,當(dāng)pH值分別為2.0和12.0時,B.subtilisH5所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)仍保留77%和67%的抑菌活性,說明其在極端酸堿的環(huán)境中仍可發(fā)揮明顯的抑菌作用,而抗菌肽brevibacillin和brevibacillin V等在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下基本失活[22]。結(jié)果表明,B.subtilisH5產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)有較好的酸堿穩(wěn)定性,可耐受極端環(huán)境,有利于其在食品工業(yè)等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

圖4 pH對B.subtilis H5所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響Fig.4 Effect of pH on antimicrobial produced by B.subtilis H5

2.4.3 紫外線穩(wěn)定性

由圖5可知,B.subtilisH5產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)經(jīng)過紫外線照射處理10～60 min后,其抑菌活性基本無變化,表明其具有良好的紫外線穩(wěn)定性。因此,可將紫外線殺菌技術(shù)和生物防腐劑聯(lián)合應(yīng)用于食品中,大大地提高食品的保鮮防腐效果,從而延長食品的保質(zhì)期。

圖5 紫外線對B.subtilis H5所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響Fig.5 Effect of UV on antimicrobial substance produced by B.subtilis H5

2.4.4 有機(jī)溶劑穩(wěn)定性

由圖6可知,B.subtilisH5產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)分別與甲醇、乙醇、丙酮和乙腈在室溫條件下作用2 h,發(fā)現(xiàn)其對4種有機(jī)溶劑具有較好的耐受能力,抑菌活性無明顯變化,這為該抑菌物質(zhì)的提取、分離純化和分析提供了有力的理論依據(jù)[23]。

2.4.5 金屬離子穩(wěn)定性

由圖7可知,供試的各種陽離子對B.subtilisH5所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的活性有不同程度的影響,10 mmol/L的Na+和Al3+對其抑菌活性基本無影響,Ca2+和Mg2+會抑制其約7%的抑菌活性,而Mn2+和Zn2+則可提高其抑菌活性。尚偉[24]的研究結(jié)果表明,Bacillusvelezensis產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)同樣會受到Ca2+的抑制,且高濃度的Mn2+會促進(jìn)其抑菌活性。

圖7 金屬離子對B.subtilis H5所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響Fig.7 Effect of metal ions on antimicrobial substance produced by B.subtilis H5

2.4.6 酶穩(wěn)定性

由圖8可知,經(jīng)過胃蛋白酶、堿性蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶處理后,B.subtilisH5所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的活性均有不同程度的下降,表明該抑菌物質(zhì)屬于蛋白質(zhì)類或者肽類物質(zhì)。其中,經(jīng)木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和堿性蛋白酶處理后,抑菌物質(zhì)的活性僅下降了9%～20%,說明其對大多數(shù)蛋白酶具有一定的耐受性,這與抗菌肽分子質(zhì)量小和它可能有環(huán)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)[25]。另外,B.subtilisH5產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對蛋白酶K和胰蛋白酶最為敏感,尤其是在胰蛋白酶的作用下,其抑菌活性下降了約28%。

圖8 蛋白酶對B.subtilis H5所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響Fig.8 Effect of proteases on antimicrobial substance produced by B.subtilis H5

3 結(jié)論

枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)是一種內(nèi)生胞子的革蘭氏陽性菌,在過去的幾十年里,其產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的能力得到了廣泛的認(rèn)可[26]。本研究從蘆潮港海泥中篩選出1株具有廣譜抑菌性的枯草芽胞桿菌H5,尤其是對副溶血性弧菌、腐生葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌有強(qiáng)烈的抑制作用。經(jīng)過6種蛋白酶處理后,B.subtilisH5所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的活性均有不同程度的下降,可見其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)屬于蛋白質(zhì)類或者肽類物質(zhì)。通過對B.subtilisH5所產(chǎn)抗菌肽的理化性質(zhì)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)其具有良好的溫度穩(wěn)定性、紫外線穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑穩(wěn)定性,可耐受高壓蒸汽滅菌；可在較寬的pH范圍內(nèi)(2.0～11.0)保持活性,有利于其在食品工業(yè)等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用；10 mmol/L的Ca2+和Mg2+會抑制其抑菌活性,而Mn2+和Zn2+則可提高其抑菌活性,為其開發(fā)和應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。與已報(bào)道的枯草芽胞桿菌產(chǎn)生的抗菌肽相比[9,17-18,25],枯草芽胞桿菌H5產(chǎn)生的抗菌肽不僅具有良好的穩(wěn)定性,且抑菌譜更廣,抑菌活性更強(qiáng),在食品工業(yè)、畜牧業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)室將進(jìn)一步對枯草芽胞桿菌H5所產(chǎn)抗菌肽的純化、鑒定與抑菌機(jī)制等進(jìn)行深入研究。