131I標記的NaGdF4:Eu3+納米顆粒用于自發光/SPECT/MR三模態成像

2

(1.浙江工業大學 材料科學與工程學院，浙江 杭州 310014；2.中國藥科大學，藥物質量與安全預警教育部重點實驗室，江蘇 南京 211198；3.廈門大學附屬中山醫院，福建 廈門 361005)

稀土下轉換納米顆粒(DCNPs)在光學成像方面有許多優異的特性，例如發射帶寬窄、斯托克斯位移較大和光化學穩定性良好[1-4]。常見的DCNPs可摻雜Eu3+，Dy3+，Tb3+等稀土離子，能在紫外光(UV)的激發下，通過斯托克斯位移發射出可見光[4]，進而通過熒光顯微鏡進行體外光學成像[5-9]。然而，UV不但會損傷細胞，而且激發產生的生物體自發熒光會與發光信號混淆。因此，直接使用UV作為DCNPs的激發光在生物體內光學成像具有一定的局限性[4]。

切倫科夫輻射(CR)是一種在放射性核素衰變過程中發出的電磁輻射，發射的光譜主要位于UV或藍光區域[10]。當輻射體與DCNPs以適當的方式連接時，輻射體發射的UV或藍光能通過切倫科夫能量共振轉移(CRET)激發DCNPs發光。作為一種內置“光源”，CR可直接激發DCNPs進行自發光，從而克服外部光源的不足[11-13]。這種基于CR的納米顆粒自發光已經用于對量子點[14-15]、金納米簇[16]、長余輝納米顆粒[17-18]和有機納米顆粒[19-20]等激發光譜在200～500 nm處的納米顆粒激發。目前，可產生切倫科夫輻射的放射性核素有18F，131I，90Y，64Cu，89Zr等[21]。其中，131I的半衰期為8.02 d，適用于精準的醫學成像。此外，131I在β衰變過程中可以發射少量γ射線，在與DCNPs連接后不但能用于自發光成像，還可以用于單光子發射計算機斷層掃描(SPECT)成像，通過兩種成像模式的相互印證提高診斷的靈敏度和準確性[22]。為此，開發了一種以131I標記的NaGdF4:Eu3+納米顆粒(131I-GENPs)用于多模態成像。131I不但可用作CR“光源”激發NaGdF4:Eu3+(GENPs)納米顆粒發出熒光信號，而且能產生γ射線用于SPECT成像。131I-GENPs中的Gd3+是一種臨床上常用的T1加權磁共振成像(T1-MR成像)造影劑，可用于增強T1-MR成像的對比度和靈敏性。因此，131I-GENPs可用于自發光、SPECT和MR三模態成像。

1 材料和方法

1.1 材 料

六水合氯化釓(GdCl3·6H2O)、六水合氯化銪(EuCl3·6H2O)、油酸、1-十八烯、氟化銨、氫氧化鈉和羥苯基丙酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(SHPP)，阿拉丁有限公司；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基(DSPE-PEG2000-NH2)，上海拓旸生物科技有限公司；Na131I和Na99mTcO4從廈門大學附屬中山醫院獲得。

1.2 材料表征

透射電子顯微鏡(TEM)和X射線能譜分析(EDS)通過FEI Tecnai F20 TEM在200 kV下測量。材料的晶相通過配備有CuKα(λ=1.540 5 ?)輻射(Ultima IV)的X射線粉末衍射儀(XRD)確認。用熒光分光光度計(Hitachi F-7000)測量材料的熒光激發和發射光譜。

1.3 GENPs的制備

GENPs的合成方法基于文獻[23]稍作修改。將0.95 mmol GdCl3·6H2O，0.05 mmol EuCl3·6H2O，8 mL油酸和15 mL 1-十八烯添加到100 mL的四口燒瓶中。將混合溶液在磁力攪拌下加熱至160 ℃并保溫1 h，以形成稀土油酸絡合物。冷卻至室溫后，滴入含有NH4F(2.64 mmol)和NaOH(4 mmol)的10 mL 甲醇溶液，再攪拌30 min。然后將溶液加熱至110 ℃并保溫15 min以除去甲醇，繼續加熱至300 ℃，保溫1 h。用乙醇作為沉淀劑離心分離(8 000 r/min，5 min)納米顆粒，將獲得的顆粒分散在正己烷中備用。

1.4 SHPP修飾的GENPs的制備

將10 mg GENPs和30 mg DSPE-PEG2000-NH2溶于5 mL氯仿中，超聲處理5 min，得到均勻溶液。將混合物密封后在通風櫥中攪拌過夜，然后用氮氣流除去氯仿。將獲得的產物溶解在水中，加入5 mg SHPP后攪拌反應24 h。最后通過離心(3 000 r/min，3 min)除去未反應的SHPP，獲得SHPP修飾的GENPs。

1.5 131I-GENPs的制備

使用標準的Iodogen碘化法[24]完成131I標記。將100 μL經SHPP修飾的GENPs(2 mg/mL)和100 μCi的Na131I添加到涂有Iodogen(20 μg)的2 mL 離心管中，混合10 min。通過離心(8 000 r/min，3 min)除去游離的Na131I。通過瞬時薄層色譜(ITLC)測試放射化學穩定性。

1.6 動物模型構建

選取6周齡的雌性BAlB/c鼠，體重約20 mg，在屏障環境中飼養。在老鼠右腿接種含4×106個4T1細胞的PBS溶液，等到腫瘤體積約80 mm3時進行活體實驗。

1.7 自發光成像

體外的自發光成像在96孔板中測試。先將Na131I(100 μCi)，131I-GENPs(100 μCi，0.2 mg GENPs)和SHPP修飾的GENPs(0.2 mg GENPs)分散在200 μL水中，再將其轉移到黑色的96孔板中。利用GFP濾光片(515～575 nm)，Dsred濾光片(575～650 nm)，Cy5.5濾光片(695～770 nm)，ICG濾光片(810～875 nm)和不加濾光片的IVIS Spectrum系統(Caliper life sciences)測量并記錄熒光圖像，曝光時間為2 min。在1.6節所述荷瘤小鼠上進行體內自發光成像。瘤內注射131I-GENPs(20 μCi，40 μg131I-GENPs)1 h后進行熒光成像，曝光時間為2 min。自發光成像使用1組老鼠，每組2只，以注射前后的信號作為對照。

1.8 SPECT成像

通過荷瘤小鼠評價SPECT成像效果。將131I-GENPs(20 μCi，40 μg131I-GENPs)以瘤內注射的方式注射到荷瘤小鼠中。注射1 h后，使用nanoScan SC系統(Medisomedical imaging system)進行SPECT成像。掃描時間為30 min，分辨率為0.4 mm。使用InVivoScope軟件(Bioscan Inc.)分析SPECT圖像。SPECT成像使用1組老鼠，每組2只，以注射前后的信號作為對照。

1.9 MR成像

在3.0 T的MR掃描儀(Achieva TX, Philips medical system, Netherlands)上進行體外MR成像測試。以0.03 mmol/L為Gd3+濃度梯度，將131I-GENP配制成0～0.3 mmol/L的水溶液。將不同Gd3+濃度的131I-GENPs水溶液置于排管中，使用快速自旋回波序列(Turbo spin echo，TSE)測定樣品的T1弛豫時間，檢測參數為TE=11.6 ms，TR=500 ms。利用T1弛豫時間的倒數與濃度進行線性擬合，計算出的斜率即為T1弛豫率(Relaxivity，R)。通過荷瘤小鼠評估體內MR成像。將131I-GENPs(20 μCi，40 μg131I-GENPs)以瘤內注射的方式注射到小鼠中，然后立即進行MR成像，1 h后再次進行MR成像。T1加權MRI的檢測參數為Flip angle=10°，ETL=60，TR=7.8 ms，TE=7.3 ms，Field of view(FOV)=65×65 mm2，Slice thickness/gap=50 mm/0.5 mm，NEX=4。MR成像使用1組老鼠，每組2只，以注射前后以及注射后1 h的信號作為對照。

1.10 生物安全性評估

將PBS和131I-GENPs(20 μCi，40 μg)分別以瘤內注射的方式注射到上述荷瘤小鼠中。兩天后主要器官(心、肝、脾、肺、腎)被分離出來，并浸泡在4%福爾馬林溶液中固定，隨后進行包埋、切片。通過倒置熒光顯微鏡觀察比較蘇木精-伊紅(H&E)染色結果，評價131I-GENPs的生物安全性。該實驗使用2組老鼠，每組1只老鼠，以PBS作為對照組。

2 結果與討論

圖1是制備的納米顆粒的典型TEM圖像，從圖1中可以看出：合成的材料呈現單分散狀態，顆粒的形貌為均勻的球形，其尺寸約為15 nm。利用Nano measure軟件統計了顆粒的尺寸并使用高斯分布函數擬合數據，結果如圖2所示，納米顆粒的平均粒徑為15.5 nm，且粒徑分布較窄，為(15.5±3) nm，說明顆粒非常均勻。

圖1 分散于正己烷的納米顆粒的TEM圖Fig.1 TEM image of nanoparticles dispersed in hexane

圖2 納米顆粒大小分布統計圖Fig.2 Statistical graph of nanoparticle size distribution

圖3是合成的材料在10°～80°處的X射線衍射(XRD)圖譜，結果顯示：合成材料在2θ為17.01°，30.17°，42.84°，52.97° 時出現明顯的衍射峰，對應的晶面分別為(100)，(101)，(201)和(102)，與NaGdF4的標準六方相(JCPDS 27-0699)結果基本一致，說明形成了以NaGdF4為主相的納米材料。其中30.17°，42.84°，52.97° 處的衍射峰與標準卡片對比有0.5°～1° 的右移，可以推測與Eu3+的摻雜有關。在六方晶系NaGdaF4中，存在3種不同的晶體學格位，分別為被Gd3+占據的單一點陣(1a)，被Na+和Gd3+隨機占據的單一點陣(1f)，以及被Na+占據的雙點陣(2h)。Eu3+的離子半徑為0.095 nm，Gd3+的離子半徑為0.094 nm，故Eu3+會占據1a和1f點陣位，由于Eu3+的摻雜，晶格發生一定的改變，導致衍射峰位置發生偏移[25]。圖4是GENPs的EDS映射圖，其中左上方、右上方、左下方和右下方分別為Gd，Eu，Na，F元素的信號，分別顯示了這4種元素在顆粒上的面分布情況，4種元素完全重疊，說明成功合成GENPs，并且這4種元素在顆粒上均勻分布，說明Eu3+被均勻摻進了納米顆粒中。

圖3 納米顆粒的X射線衍射圖譜Fig.3 XRD pattern of nanoparticles

圖4 GENPs的EDS映射圖Fig.4 EDS mapping of GENPs

因為GENPs是一種典型的稀土下轉換納米顆粒，所以通過測試其熒光激發光譜和發射光譜驗證其發光性能。圖5是GENPs的熒光激發光譜圖，可以看出：該顆粒在277，315，395 nm附近出現了明顯的激發峰，說明這3個波段均可作為GENPs的激發波長，且最高峰在395 nm處。進而以277，395 nm兩個波長的光作為激發光，分別測試GENPs的發射光譜。如圖6所示，在這兩個波長的光的激發下，GENPs均出現了明顯的熒光發射峰。其中，592，615，695 nm處出現的發射峰是由于Eu3+離子的5D0→7F1，5D0→7F2，5D0→7F4能級躍遷引起的[26]。此外，395 nm光激發比277 nm光激發引起的熒光更強，這與395 nm為GENPs最大激發波長的結果相一致。采用標準的Iodogen碘化法[21]將131I連接在GENPs上。由于該過程需在水溶液中完成，而制備的GENPs呈現明顯的疏水性，所以需要對GENPs進行修飾[27]。首選使用DSPE-PEG2000-NH2對GENPs進行表面修飾。其中，DSPE端能通過疏水-疏水相互作用包覆在GENPs表面，而親水的PEG鏈與溶液接觸，帶動整個納米顆粒溶于水，GENPs在水溶液中具有良好的分散性能。Iodogen碘化法還需要修飾SHPP用于連接131I。因此，在修飾DSPE-PEG2000-NH2的基礎上，進一步在其表面修飾SHPP。

圖5 用615 nm濾光片測得的GENPs的激發光譜Fig.5 Excitation spectrum of GENPs with a 615 nm filter

圖6 277，395 nm波長光激發后GENPs的發射光譜Fig.6 Emission spectra of GENPs upon excitation at 277，395 nm

修飾PEG和SHPP后GENPs的TEM圖如圖7(a)所示，可以發現：修飾后納米顆粒的形貌和尺寸均沒有發生明顯的變化，并且能在水溶液中分散良好。進而采用Iodogen碘化法對GENPs進行131I標記，其TEM圖如圖7(b)所示，標記后顆粒仍保持原有形貌，尺寸分布也和在正己烷中分散的類似。如圖8所示，水相中納米顆粒的平均粒徑約為15 nm，且分布較窄，能在水中實現分散，沒有明顯團聚。良好的放射穩定性是實現材料CRET和SPECT成像的前提，因此用瞬時薄層色譜(ITLC)評估131I-GENPs的放射穩定性。如圖9所示，在37 ℃條件下，經過12，24 h生理鹽水的孵育，131I-GENPs分別保持了98%和95%的放射化學純度，而在37 ℃條件下，在含有10%血清的培養基(10% FBS)中孵育12，24 h后，131I-GENPs的放射性純度保持了98%和96%，說明131I能被穩定地標記到GENPs上，且在生理鹽水和血清條件下均不易分離，為將131I-GENPs用于自發光成像和SPECT成像奠定了基礎。

圖7 TEM圖像Fig.7 TEM images

圖8 131I-GENPs的大小分布統計圖Fig.8 Statistical graph of 131I-GENPs size distribution

圖9 131I-GENPs的放射穩定性Fig.9 Radiolabeling stability of 131I-GENPs

131I-GENPs不僅具有良好的放射穩定性，還具備優秀的熒光成像潛力，將131I-GENPs的水溶液置于IVIS Lumina型熒光成像系統中用于體外CRET熒光成像。在關閉激發光源的條件下，拍攝了熒光照片，結果如圖10所示。不同樣品的光子通量見圖11，由圖11可知：131I-GENPs產生的光子數為18.42×105p/(sec·cm2·s)，高于Na131I產生的光子數11.18×105p/(sec·cm2·s)，說明131I可以成功激發GENPs自發熒光。由于131I衰變時可以同時生成β和γ兩種射線，為了研究何種射線是激發GENPs產生熒光的激發源，測試了γ射線發射體Na99mTcO4對GENPs的激發作用。結果顯示：單獨的Na99mTcO4不產生熒光信號，與GENPs混合后也沒有明顯的熒光信號，其產生的光子數分別為0.23×105，0.31×105p/(sec·cm2·s)，說明γ射線不會產生熒光，也不能激發GENPs產生自發熒光，進而說明β射線才是激活GENPs產生熒光信號的關鍵。

圖10 Na131I，131I-GENPs，Na99mTcO4和Na99mTcO4+GENPs的熒光圖像 Fig.10 Fluorescence images of Na131I, 131I-GENPs, Na99mTcO4 and Na99mTcO4+GENPs

1—Na131I；2—131I-GENPs；3—Na99mTcO4；4—Na99mTcO4+GENPs。圖11 Na131I，131I-GENPs，Na99mTcO4和Na99mTcO4+GENPs的光子通量 Fig.11 Photon flux of Na131I, 131I-GENPs, Na99mTcO4, and Na99mTcO4+GENPs

為了考察131I激發GENPs產生熒光的原因，利用不同波長的濾光片考察了釋放熒光的波段。Na131I(100 μCi)、131I-GENPs(100 μCi，0.2 mg)和GENPs(0.2 mg)在GFP濾光片(515～575 nm)、Dsred濾光片(575～650 nm)、Cy5.5濾光片(695～770 nm)和ICG濾光片(810～875 nm)下的的熒光圖像和SPECT圖像如圖12所示。游離Na131I由于自身CR效應產生的熒光主要集中在GFP(515～575 nm)和Dsred(575～650 nm)波段。將131I標記至GENPs后，兩個波段的光均有所增強，且Dsred波段的信號增加更為明顯，是游離Na131I的2.6倍(圖13)，這與GENPs的發射峰位置吻合較好，說明GENPs成功地將131I以短波為主的切倫科夫輻射轉化成了以近紅外光為主的CRET熒光，驗證了其作為近紅外自激發的CRET熒光探針的可行性。此外，單獨的GENPs在4個濾光片下均未檢測到明顯的熒光信號，說明GENPs自身并不會發光。綜上所述，131I-GENPs可通過131I與GENPs之間的CRET作用實現自發光。此外，由于131I還可發射γ射線，Na131I和131I-GENPs都表現出明顯的SPECT信號，說明131I-GENPs可用于自發光和SPECT雙模態成像。

圖12 熒光圖像和SPECT圖像Fig.12 Fluorescence images and SPECT images

圖13 Na131I和131I-GENPs在不同濾光片中的光子通量Fig.13 Photon flux of Na131I and 131I-GENPs in different emission filters

由于合成的131I-GENP具有優良的光學性質和放射性，所以具有潛在的生物醫學應用空間。為此，進一步在荷瘤小鼠上檢測其自發光成像和SPECT成像的效果。將131I-GENPs(20 μCi，40 μg)以瘤內注射的方式注入小鼠體內，1 h后獲取腫瘤部位的熒光信號和SPECT信號。結果如圖14(a)所示，注射1 h后腫瘤部位呈現明顯的SPCET信號。Dsred波段是131I-GENPs熒光信號最強的波段，在熒光成像中，分別測試了全波長濾光片和Dsred濾光片濾光后的熒光信號。如圖14(b)所示，兩者均呈現出較強的熒光信號，且Dsred濾光片中的光子通量占總光子通量的25%(圖15)。由于Dsred波段(575～650 nm)屬于紅、橙、黃光波段，其對皮膚的穿透深度較131I自身CR作用產生的藍綠熒光(515～575 nm)更深，更適用于體內成像。

圖14 SPECT圖像以及體內自發光圖像Fig.14 SPECT images and in vivo self-illuminating images

圖15 腫瘤區域中的光子通量Fig.15 Photon flux in tumor region

含有Gd3+的配合物，如Gd-DTPA，Gd-DOPA等都是臨床上廣泛應用的T1-MR成像造影劑，可用于增強T1-MR成像靈敏度和準確性。筆者構建的131I-GENPs也含有Gd3+，因此有望用于MR成像。T1弛豫率(R1)是表征T1-MR成像造影劑成像性能的關鍵參數，為此測試了不同Gd3+濃度131I-GENPs的T1-MR成像效果并計算其R1，結果如圖16，17所示。這種納米材料在Gd3+濃度為0～0.3 mmol/L時呈現出明顯的T1-MR成像信號增強，其R1可高達4.85 mmol/(L·s)，優于臨床應用的Gd-DTPA[28]，是一種性能優異的T1-MR成像造影劑。進而將這些131I-GENPs以瘤內注射的方式注入荷瘤小鼠中，比較注射前后以及注射1 h后腫瘤區域的T1-MR成像信號強度，結果如圖18，19所示。在注射后，小鼠的腫瘤區域在T1-MR成像模式下立刻呈現明顯的亮信號，其信號強度較注射前提高約41%，而在注射131I-GENPs 1 h后，腫瘤部位的T1-MR成像信號強度較注射前高21%，與已報道的Gd3+基T1-MR成像造影劑的半衰期[29]類似，為其MR成像提供了依據。

圖16 不同Gd3+濃度131I-GENPs的MR圖像Fig.16 MR images of different concentrations of 131I-GENPs

圖17 T1弛豫時間的倒數與Gd3+濃度之間的線性關系擬合結果Fig.17 Linear relationship between the reciprocal of T1 relaxation time and Gd3+concentration

圖18 T1加權信號強度變化Fig.18 Intensity changes of T1-weighted signal

圖19 T1加權MR圖像Fig.19 Representative T1-weighted MR images

生物安全性是生物醫用材料應用的重要指標之一。通過H&E染色的方法評價了131I-GENPs的生物安全性，結果如圖20所示。將131I-GENPs以瘤內注射的方式注射到小鼠體內，兩天后處死老鼠，解剖出心、肝、脾、肺、腎等重要臟器并進行H&E染色。與注射PBS的對照組相比，注射131I-GENPs后的小鼠組織未發現明顯的細胞形態學改變，表明這種納米顆粒具有良好的生物安全性。

圖20 小鼠主要器官的H&E染色圖像(比例尺：200 μm)Fig.20 H&E stained images of major organs of mice (scale bar: 200 μm)

3 結 論

制備了131I標記的NaGdF4：Eu3+納米顆粒(131I-GENPs)用于自發光成像、SPCET和MR成像。131I作為切倫科夫輻射源，不僅通過下轉換激發了NaGdF4：Eu3+納米顆粒的熒光信號，而且基于發射γ射線可以提供SPECT信號。同時，Gd3+的存在也可增強T1-MR成像信號。因此131I-GENPs有望作為自發光、SPCET和MR三模態成像探針用于精準診斷。