液相色譜串接質譜儀測定有機茶葉中的苦參堿與氧化苦參堿

李 麗

（江蘇聯合職業技術學院鎮江分院 鎮江高等職業技術學校，江蘇鎮江 212000）

苦參堿、氧化苦參堿屬于喹諾里西啶類生物堿，廣泛存在于豆科的槐屬、野決明屬及山豆根屬等植物中[1-2]。苦參堿、氧化苦參堿對于治療結核病、潰瘍性結腸炎、乙型肝炎以及癌癥的輔助治療都有一定的療效，在醫學上得到了廣泛的應用[3-7]。在植物的病蟲害防治方面，苦參堿、氧化苦參堿可以有效防治竹斑蛾[8]、對異色瓢蟲[9]、茶毛蟲[10]等病蟲害，是良好的殺蟲劑。中國是世界最大的茶葉生產和貿易國，也是歐盟茶葉的最大輸入國，僅2014年中國出口到歐盟的茶葉就有2.49萬t，貨值達到1.04億美元，其中有相當一部分是有機茶葉[11-12]。中國國家標準《有機產品》（GB/T 19630.1—2011）[13]，明確規定苦參堿、氧化苦參堿可以作為殺蟲劑投入品進行使用，且沒有最大殘留限量的規定。但是近年來，歐盟加強了對茶葉中農藥殘留的監控，其監控項目由過去的458項增加到現在的將近600項。對于沒有授權使用的農藥，其最大允許殘留限量均采用了一律標準，要求不得大于10μg/kg。僅今年9月份，西班牙就在歐盟快速預警平臺上公布了3起從中國進口紅茶中檢出未經授權使用的化學物質苦參堿，并且在口岸自動拒收，給出口商造成了很大的損失。

目前檢測苦參堿、氧化苦參堿的方法包括：氣相色譜法[17]、高效液相色譜法、滴定法、薄層色譜法、比色法、瑞利散射法、液相色譜串接質譜法。這些方法有的是針對苦參堿、氧化苦參堿的制品或者生物檢樣，并不針對茶葉樣品；有些檢測植物產品的方法，樣品前處理的過程復雜，提取凈化耗時長，重復性不佳，影響檢測的周期。到目前為止，我國尚未制定出同時檢測茶葉中苦參堿、氧化苦參堿含量的標準。因此，有必要建立檢測方法對茶葉中苦參堿、氧化苦參堿的含量進行本底調查，確保茶葉的安全質量，規避有機茶葉出口面臨的風險。

1 材料與方法

1.1 儀器

Thermo TSQ Quantan Access液相色譜-串接質譜儀：配電噴霧離子源（ESI）和自動進樣器（Finnigen Surveyor）；XPE205電子天平：感量0.01mg（梅特勒公司，瑞士）；DS-1組織搗碎機（上海右一儀器有限公司，中國）；3K15高速冷凍離心機（Sigma公司，德國）；SB-1000YDTA超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司，中國）。

1.2 試劑及耗材

乙腈，乙醇：均為色譜純（Merck公司，德國）；氨水，三氯甲烷，氯化鈉：均為分析純（上海國藥集團）；實驗用水為Milli-Q高純水（Millipore公司，美國）；N-丙基乙二胺固體粉末（PSA，上海安普公司）；石墨化炭黑（GCB，深圳逗點公司）。

苦參堿標準溶液（CAS：519-02-8 分子式C15H24N2O）購自廣州碩譜生物科技有限公司（1 000 μg/mL），于4℃保存；氧化苦參堿（CAS：16837-52-8 分子式C15H24N2O2）購自上海國藥集團，純度大于98%。標準溶液：取適量的氧化苦參堿，用乙腈配制成1 000μg/mL的標準儲備液，于4℃保存。臨用時將苦參堿、氧化苦參堿標準儲備液等體積混合，根據實驗需要，用乙腈稀釋至適當濃度用于生成標準曲線和試樣加標。

1.3 樣品處理

（1）用于實驗的20份樣品均從本地市場、上海、福建等地采購。

（2）取300g茶葉，用組織搗碎機充分打碎，過100目篩子，取篩下物混合均勻備用。

（3）樣品的提取凈化

①稱取茶葉0.500g（±0.002）于50mL離心管中，加入10mL去離子水渦旋30s，水浴20min（50℃）后超聲20min。加入100μL濃氨水渦旋30s，加入1g氯化鈉渦旋2min，加入20mL三氯甲烷渦旋2min超聲20min。以8 000r/min（離心半徑8cm）離心5min后，棄去上層的水相，取15mL三氯甲烷層氮吹至干（避免將上層的水相吸入）。殘渣中加入100mg PSA和1.0mL乙醇，超聲2min復溶，過有機相膜進樣。

②加標回收試驗，采用經過檢測的不含待測組分的茶葉進行加標，提取凈化程序按照1.3.3.1實施。

1.4 儀器條件

Se QuantTMZic?-Hillic 親水柱（150mm×2.1mm，5um）；流動相：A相：乙腈、D相：10mmoL/L乙酸銨（含有0.15%甲酸），梯度洗脫（表1），流速0.3mL/min；進樣量，25μL；柱溫30℃。

電噴霧離子源（ESI），正離子模式掃描；質譜掃描方式：多反應監控（MRM）；噴霧電壓4200V；離子源溫度380℃；輔助氣流速3mL/min；殼氣流速4mL/min；碰撞氣（氬氣）流速0.45mL/min?？鄥A的定量、定性對和碰撞能量分別為249/148.1m/z、32eV，249/150.1m/z、31eV，249/112.2m/z、32eV，249/110.2m/z、35eV，249/98.2m/z、37eV；氧化苦參堿的定量、定性對和碰撞能量分別為265/205.1m/z、30eV，265/150.0m/z、32eV，265/148.0m/z、30eV，265/136.1m/z、29eV，265/98.2m/z、34eV。標準溶液的總離子流圖，如表1，圖1所示。

表1 色譜梯度洗脫條件

圖1 苦參堿、氧化苦參堿總離子流圖（濃度0.312 μg/L）

2 結果

2.1 方法的標準曲線、線性范圍、檢出限和定量限

吸取100.0μL苦參堿、氧化苦參堿混合標準溶液（100.0μg/L）于900.0μL乙腈中，渦旋混合均勻。再用乙腈倍比稀釋，共計6個點：0.312、0.625、1.25、2.50、5.00、10.0μg/L。以峰面積對質量濃度作圖，苦參堿的標準工作曲線Y=8.19×104X-2.93×103，如圖2所示；氧化苦參堿的標準工作曲線Y=3.62×104X-5.18×103（圖3）。結果顯示，在所測定的質量濃度范圍內，苦參堿、氧化苦參堿工作曲線有良好的線性，相關系數（R2）大于0.999。

圖2 苦參堿的標準曲線（0.312～10.0μg/L）

圖3 氧化苦參堿的標準曲線（0.312～10.0μg/L）

參照EPA[28]的方法，先計算儀器的檢出限和定量限。然后在儀器的定量限上做實際樣品的加標回收，以7次平行試驗的標準偏差計算方法的檢出限和定量限。苦參堿、氧化苦參堿的檢出限均為1.0μg/kg；苦參堿、氧化苦參堿的定量限均為2.0μg/kg。

2.2 實驗的回收率和精密度

用三種有機茶葉的陰性樣品做加標回收試驗，添加水平為2.00μg/kg、4.00μg/kg、10.0μg/kg，每個加標水平測定6次，苦參堿的回收率70.5%～78.3%，相對標準偏差4.60%～7.80%，如表2所示；氧化苦參堿的回收率93.0%～105%，相對標準偏差3.21%～5.17%（表2）。陰性樣品以及加標樣品的總離子流圖，如圖4～5所示。

表2 茶葉陰性樣品的加標回收率、精密度（苦參堿、氧化苦參堿）（n=6）

圖4 茶葉空白樣品提取液總離子流圖

2.3 樣品的篩查

20份有機茶葉樣品，其中有3份樣品檢出苦參堿，分別為綠茶（8.31μg/kg、12.3μg/kg）和紅茶（6.77 μg/kg），其他均未檢出。

3 討論

嘗試了C18柱、C8柱、親水柱、離子交換柱（SCX柱、MCX柱）等色譜柱用于待測組分的分離。C18、C8柱排除樣品基質干擾的效果不佳，易出現假陽性的結果。離子交換柱對待測組分的保留性強，峰型較寬并且拖尾。采用親水柱，在梯度洗脫條件下，空白樣品基質在苦參堿和氧化苦參堿的出峰處會產生微小的干擾峰，但是其含量不足定量限的1/5，對檢測結果以及產品的合規性沒有影響；待測組分的峰型、保留時間等方面，都能夠滿足相關的技術要求（圖5）。因此，選擇Se QuantTMZic?-Hillic 親水柱作為分離柱。

圖5 茶葉加標樣品提取液總離子流圖

QuEChERS方法是檢測農藥殘留經常使用的技術，但是實驗中發現其主要的試劑——石墨化炭黑（GCB）對苦參堿、氧化苦參堿有很強的吸附作用，基本沒有加標回收率。茶葉中富含鞣酸，苦參堿容易與之形成鞣酸苦參堿，水溶性增大。但是試驗結果顯示，采用純水（中性的、酸化或者堿化的）、水/乙腈體系（中性的、酸化或者堿化的）、水/甲醇體系（中性的、酸化或者堿化的）、純乙腈、純甲醇，對目標化合物的提取效果都不佳，回收率偏低，且基質干擾較大。在茶葉樣品中加入過量的氨水可以有效中和茶葉中鞣酸之類的酸性物質，有利于苦參堿、氧化苦參堿轉移至三氯甲烷中；水相中加入氯化鈉可以使水的飽和度增加，能夠降低苦參堿、氧化苦參堿在水相中的分配系數。通過優化，本實驗的選擇性、回收率、精密度、檢出限、定量限等指標均符合歐盟殘留監控指南的要求。

4 結論

本研究建立了有機茶葉中苦參堿、氧化苦參堿的液相色譜串接質譜的檢測方法。樣品用水溶解超聲萃取后，加入氨水中和茶葉中的酸性物質；水相中加入氯化鈉后，用三氯甲烷提取待測組分，經PSA凈化后上機測定。該方法具有良好的分離效果、線性關系，也具有理想的回收率和精密度。方法的檢出限、定量限分別為1.00μg/kg和2.00μg/kg。篩查的茶葉中有3份呈陽性結果。該方法簡便、快速、準確，適用于茶葉中苦參堿、氧化苦參堿的檢測，為出口茶葉的質量安全監測提供技術支撐。