虛擬篩選研究Islatravir衍生物抗新型冠狀病毒RdRp潛力

汪 燕，吳瀟然，劉曉玲

（黃山學院 化學化工學院，安徽黃山 245041）

SARS-CoV-2自從2019年發現以來，病例數量呈指數增長，在全球造成了巨大的人員傷亡和經濟損失[1-2]。SARS-CoV-2是一種單鏈RNA病毒正鏈包膜β冠狀病毒，RdRp是它的一種重要結構蛋白。SARS-CoV-2病毒進入宿主細胞后，基因組會被釋放到細胞質中，病毒的RNA會與宿主細胞的核糖體結合，開始翻譯RdRp和解旋酶，并形成復制-轉錄復合體，該復合體通過疏水域附著在宿主細胞的內質網上，合成亞基因組的mRNA，產生結構蛋白和輔助蛋白[3-5]。由核衣殼蛋白（N）和基因組RNA組裝而成的螺旋核衣殼與其他結構蛋白相互作用，形成組裝的病毒體，最后通過胞吐作用釋放到細胞外區室[6]。

由此可見，SARS-CoV-2的RdRp在病毒的轉錄復制中起到關鍵作用，尋找合適的小分子抑制劑即可阻止病毒的自我復制[7-8]。通過對新冠病毒基因組序列的最初分析表明，新冠病毒眾多病毒酶的催化位點具有保守性，與SARS和MERS中的酶具有高水平的序列相似性，因此根據老藥新用原則，市面上的抗病毒藥物核苷逆轉錄酶抑制劑有可能對病毒的RdRp起到抑制作用，該類藥物屬于RdRp底物的競爭性抑制劑，藥物分子磷酸化后摻入病毒的RNA鏈，阻斷RNA鏈的進一步合成，從而達到終止病毒自我復制的目的[9-11]。

Islatravir（EfdA，MK-8591）是一種新型的以腺嘌呤核苷為基礎的核苷逆轉錄酶易位抑制劑，在臨床前研究中顯示出巨大的前景，包括卓越的效力和較長的細胞內半衰期，具有獨特的結構和較高的抗病毒活性，目前正用于抗病毒治療[12-13]。Islatravir與抗病毒活性藥物瑞得西韋同屬于核苷類藥物，具有一定的結構相似性。目前文獻報道中，瑞德西韋與RdRp靶蛋白的結合作用被科研工作者廣泛研究[14-16]。基于此，推測Islatravir能與SARS-CoV-2的RdRp蛋白具有良好的結合性，從而抑制SARS-CoV-2復制[16]。參考瑞得西韋分子在體內的代謝方式[17-18]，Islatravir在細胞內被2-脫氧胞苷激酶轉化為具有抗病毒活性的三磷酸鹽，通過對天然底物三磷酸脫氧核苷的競爭來發揮抑制作用，Islatravir的三磷酸活性結構，簡稱Triislatravir，如圖1所示。

圖1 Tri-islatravir的生成及三類修飾位點

本文選擇RdRp為靶標蛋白，構建了Tri-islatravir配體衍生物分子庫，通過D3Targets-2019-nCoV 平臺的分子對接技術，對Islatravir類配體進行了虛擬篩選，探討了Islatravir衍生物抗病毒的潛在價值，為篩選和開發抗冠狀病毒活性結構提供參考，也為我們后續進行潛在活性分子的化學合成工作提供了研究基礎。

1 試驗部分

1.1 數據和工具

PDB 數據庫（RCSB Protein Data Bank）；Islatravir類分子配體庫；D3Targets-2019-nCoV 平臺；Pymol；Chemof fice suite 2019；Discovery Studio等。

1.2 Islatravir類配體庫設計與構建

應用于虛擬篩選的小分子配體應具有多樣性，在Tri-islatravir結構基礎上選取三個修飾位點，如圖1所示；設計了三類配體衍生物：Ⅰ類改造是對磷酸基團與堿基母核的連接處進行改造，例如引入醚鍵、雙鍵或者增加碳鏈長度等；Ⅱ類改造是以骨架躍遷的方式對堿基母核進行改造，并引入氰基、烷基、硝基。Ⅲ類是對堿基母核上裸露的氨基進行取代，例如還原胺化得到烷基氨，酰胺縮合得到酰胺等。

如圖2所示，選取21種Tri-islatravir改造衍生物，將其分子結構繪制在Chemof fice suite 2019中，進行能量最小化處理，導出為mol2格式文件，為平臺對接備用。

圖2 Tri-islatravir衍生物配體庫的設計

1.3 分子對接計算

本文應用D3Targets-2019-nCoV 平臺進行對接運算[19]。進入平臺后，在功能區D3Docking下的VirtualScreening模塊進行以下操作：

（1）設置任務標題；

（2）上傳配體文件（格式為.sdf或.mol2）；

（3）選擇靶標蛋白RdRp；

（4）平臺運行計算，輸出對接結果。輸出文件為Islatravir分子在RdRp靶蛋白不同口袋處結合的能量最低構象和打分結果。篩選打分最高構象，利用Pymol和Discovery Studio進行可視化處理，如圖3所示。

圖3 D3Targets-2019-nCoV的D3Docking功能：輸入（左）和輸出界面（右）

2 結果與討論

2.1 Islatravir與RdRp結合模式分析

D3Targets-2019-nCoV平臺將Tri-islatravir與RdRp活性位點進行了對接，選取最高對接得分（-12.31 kcal/mol）的結合口袋1（Pocket 1）處的對接復合物，可視化處理后的結果顯示，在圖4中，A圖是靶標蛋白RdRp的結構，B圖中綠色網格線部分表示Pocket1所在位置，C圖是Tri-islatravir三維結構，D圖顯示了RdRp的活性結合口袋1表面是明顯的凹槽狀，Tri-islatravir的分子結構與口袋1具有良好的適配性，能有效嵌入口袋，形成結構穩定的復合物。

圖4 Islatravir與RdRp的結合模式：

根據對接復合物能量最低構象的3D圖（E）和2D（F），Tri-islatravir與 RdRp在 Pocket1處 的 結合 作 用 力 有 ：Tri-islatravir與 ASN691、SER759、THR687、U20、GLU811、SER814產 生 了Conventional Hydrogen Bond作用，主要由核苷和三磷酸結構上的N、O原子形成；與ALA688、U20、SER682產生Carbon Hydrogen Bond作用；與RdRp上鎂離子MG1004、MG1005和MG1006均產生了Metal-Acceptor作用；Tri-islatravir的核苷結構與殘基U20產生了Carbon Hydrogen Bon和Halogen（氟）作用；Tri-islatravir的C≡C結構與ARG555產生了π-烷基疏水相互作用。此外，Tri-islatravir與ASN-691間還存在unfavorable donor-donor作用，屬于不利作用力。

以上看出，芳香堿基上，三磷酸側鏈及連接處與受體蛋白作用力類型較少。Tri-islatravir與RdRp結合力最主要的為Conventional Hydrogen Bond和Metal-Acceptor作用。考慮Metal-Acceptor作用由RdRp上的Mg離子主導，且三磷酸活性分子結構是Islatravir在體內的代謝形式，Metal-Acceptor為固定作用力，因此主要從增強Conventional Hydrogen Bond作用的角度出發，進行骨架和藥效團的改造，以提高Triislatravir衍生物與RdRp的結合效果。

觀察Hydrogen bond的電子供體受體圖（E），堿基母核的五元環和N3區域周圍主要作為電子受體的氨基酸殘基，如果基于蛋白配體的適配性來改造Triislatravir結構，應該在Tri-islatravir上的對應區域引入氫鍵供體基團；C4和N7區域周圍則是電子供體的殘基，在這里應該引入氫鍵受體基團，以增強小分子配體與周圍殘基的結合。

另外，參考市面上的小分子RdRp抑制劑的藥效團和活性結構，進行修飾和改造，也是一種Islatravir衍生改造的途徑。

2.2 Islatravir衍生物和RdRp的構效關系分析

將圖2中設計的Tri-islatravir衍生物配體提交至D3Targets-2019-nCoV平臺，與靶標蛋白RdRp進行分子對接運算，對接結果顯示Pocket 1處得分最高，推測口袋1是核苷類藥物與新冠病毒RdRp的最佳結合位點。21種Tri-islatravir衍生物配體的對接得分如表1所示。

從表1可以看出，Tri-islatravir三類衍生物得分整體差值不大，其中有9種衍生物（衍生物1、衍生物2、衍生物3、衍生物4、衍生物5、衍生物9、衍生物12、衍生物15、衍生物20）得分優于Tri-islatravir（-12.31 kcal/mol）。改造方式分別是，Ⅱ類是通過骨架躍遷引入官能團對堿基母核進行改造，Ⅲ類是對堿基母核上的氨基進行多種取代。

表1 Tri-islatravir衍生物與RdRp口袋1的對接得分

結合對接得分發現，Ⅰ類改造明顯提高了結合力影響，改造方式是在側鏈連接處引入單個官能團或原子，對整個分子結構和空間位阻影響最小。Ⅱ和Ⅲ類組別內衍生物得分差異較大。Ⅱ類改造方式是通過骨架躍遷和引入官能團對堿基母核修飾，該類改造中大部分衍生物引入基團的分子量或構象變化較小，對接得分也與Tri-islatravir接近。其中有四個衍生物6、7、8和9，引入基團分子量較大，會明顯增大衍生物的空間位阻。而衍生物9由于引入的是環戊烷結構，具有共軛效應。因此衍生物6～8的對接得分明顯減小，而9略有增加。Ⅲ類改造中，對堿基母核上的氨基進行多種取代，當取代基團分子較大時，也會增大衍生物空間位阻，使得結合力減小。與衍生物9類似的衍生物20，由于取代了芳香基團，存在共軛作用力，因此對接得分明顯增加。

綜上，Ⅰ類改造對分子構象影響最小，更容易提高結合力，而Ⅱ和Ⅱ類改造會影響分子的空間結構，基于引入的不同官能團，改造的衍生物具有不同的結合效應。選擇每個類別得分最高的衍生物，對其與RdRp的Pocket 1處結合模式進行分析。

2.2.1 Ⅰ類配體衍生物

衍生物3得分最高。它的衍生途徑是在三磷酸側鏈與堿基母核的連接處引入了烯丙醚的結構，通過增加了醚鍵和C=C雙鍵來增長了碳鏈長度。圖5顯示了衍生物3與RdRp的結合模式，主要結合力有：衍生物3與殘基SER814、U20、ASN691、U10、LYS545產生了Conventional Hydrogen Bond作用；母核上的N原子與ALA688間產生Carbon Hydrogen Bond作用；三磷酸的O原子與RdRp上MG1004、MG1005和MG1006產生多對Metal-Acceptor作用；衍生物的C≡C結構與RdRp上殘基VAL557、LYS545和ARG555間產生了π-烷基疏水相互作用。

圖5 衍生物3與RdRp結合作用力：A 3D圖；B 2D圖

結合2D圖可以看出，與Tri-islatravir相比，Carbon Hydrogen Bond和Metal-Acceptor作用數量相似，烯丙醚的引入實際上增加了側鏈的長度，在空間上拉近了磷酸結構上O原子與殘基U20的距離，新形成了兩個氫鍵；另外由于空間構象的改變，增加了C≡C結構和殘基的π-烷基疏水作用數目。由于氫鍵作用的主導性和新增的疏水作用，衍生物3對接得分高于Tri-islatravir。

在藥物小分子中引入烯丙醚鍵后，醚類化合物分子中氧原子的孤電子對能與水形成氫鍵，有一定親水性，而與醚相連的烯丙基則有親脂性，使化合物易于通過生物膜，有利于藥物的轉運，從而提升藥物活性，增加類似的雙親基團是一個較好的藥效團改造思路。

2.2.2 Ⅱ類配體衍生物

Ⅱ類衍生改造中，得分最高的是衍生物12。如圖6所示，衍生物12與RdRp之間的結合力有：與殘基SER814、GlU811、U20、ASN691、SER759之 間 產生了Conventional Hydrogen Bond作用；與MG1004、MG1005和MG1006產生了5對Metal-Acceptor作用；與ASP760產生了Carbon Hydrogen Bond作用等。

圖6 衍生物12與RdRp結合模式：A 3D圖；B 2D圖

衍生物12和RdRp的結合模式與Tri-islatravir很相似，主要為氫鍵和金屬受體作用。相對于Triislatravir，六元環上F原子位置發生變化。由于F原子有較強的電負性，使得附近的氮原子上氫的正電性增加，以及空間構象的變化，使得堿基母核上的N與U-20新形成2個氫鍵，從整體上增加了Tri-islatravir與RdRp的結合能力。

在小分子藥物的化學修飾中，往往采用引入鹵素的修飾策略以提高小分子藥物的親脂性，氟原子的引入廣泛應用于藥物的設計和修飾之中，藥物設計中的氟取代策略也已經成為藥物結構中的重要研究策略之一。氟原子可以改變藥物的酸堿性和親脂性，改善藥物的作用時間，減少藥物半衰期，而且能夠提高配體-蛋白的親和力，增強藥效等。Islatravir腺嘌呤基環上的2-氟（2-F）使它對腺苷脫氨基的氧化具有顯著的耐受性。

2.2.3 Ⅲ類配體衍生物

在Ⅲ類配體衍生物中，衍生物20對接得分最高。衍生物20 在芳香堿基母核上引入苯環，它與RdRp的結合模式如圖7所示，主要作用力有：與殘基 SER814、ASP618、U20、A19、LYS545產 生 了Conventional Hydrogen Bond作 用； 與MMG1004、MG1005和MG1006之間產生了Metal-Acceptor作用；F原子與U20產生了Halogen（氟）作用；衍生物的新增苯環與U-18殘基中帶負電荷的原子產生了Pi-Anion作用，與ALA-547產生Pi-Alkyl疏水作用。

圖7 衍生物20與RdRp的結合模式

觀察發現，與Tri-islatravir相比，引入苯環后，衍生物分子尾端的空間構象發生變化，導致堿基母核上與RdRp的結合區域發生了偏移，與RdRp的作用殘基和作用力隨之改變。結合氫鍵供受體示意圖（圖8），衍生物20與RdRp形成氫鍵和鹵素作用的殘基由U20、ASN691、ALA688、SER759和 THR687變 為SER814、ASP618、U20、A19和LYS545。此外，由于末端苯基官能團的引入，衍生物20的堿基母核與RdRp產生了完全不同于Tri-islatravir的結合力，新增了Pi-Anion和Pi-Alkyl兩種Pi共軛作用。在藥物設計中引入苯基，可與分子結構中不飽和鍵形成穩定的共軛體系，存在誘導效應和共軛效應，有利于發揮藥效和維持化合物穩定性。

圖8 衍生物20與RdRp結合的氫鍵供受體示意圖

綜合三種衍生物的結合力可以看出，為了提高Tri-islatravir類配體與RdRp的結合力，對Triislatravir配體的改造可以采取兩種策略：①在不影響Tri-islatravir空間構象的基礎上增加氫鍵數，例如可增加氫鍵供受體原子或改變供受體原子位置；②氫鍵數目穩定的前提下，增加與RdRp上殘基、原子間的作用力類別和數目，例如通過取代官能團或改變空間構象的方式，來增強與RdRp的疏水作用、靜電作用、共軛作用等其他多種作用形式。

3 結束語

新型冠狀病毒具有傳染性強、變異快、不易失活的特點，目前急需篩選和研發藥物進行治療。通過計算機輔助藥物設計進行虛擬篩選，可有效加速新藥研發。

Islatravir是一種新型藥物，具有獨特的抗病毒活性和良好的應用前景。本文基于其活性代謝分子Triislatravir，構建Tri-islatravir衍生物配體分子庫。以SARS-CoV-2的RdRp為靶標受體，通過D3Targets-2019-nCoV 平臺D3Docking功能，進行分子對接運算，分析Islatravir衍生物配體與RdRp的結合模式，篩選出具有潛在RdRp抑制活性的Tri-islatravir衍生物和活性結構。本文為抗SARS-CoV-2活性成分篩選和研究提供了參考，為后續對潛在活性分子的化學合成提供了研究依據。