白楊素對胰脂肪酶的抑制作用及機制

張國文，黎 沙，朱 苗

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

肥胖是一種慢性疾病，與艾滋病、吸毒、酗酒并列為世界性四大醫學社會問題[1]。胰脂肪酶(Pancreatic Lipase，簡稱PL)是胰腺合成和分泌的重要脂解酶，它能將膳食甘油三酯水解成單甘油酯和脂肪酸，然后被重新吸收并最終合成為人體所需的脂肪[2]。過多的脂肪蓄積導致的肥胖容易引起糖尿病、脂肪肝、高血脂、高血壓、骨關節炎等多種疾病[3-4]。抑制胰脂肪酶活性是防治肥胖及其并發癥最有效的方法之一，然而，臨床藥物如奧利司他等對人體都會產生一定的副作用，因而限制了其臨床應用。因此，開發高效、低毒的新型胰脂肪酶抑制劑已成為近年來的研究熱點之一。白楊素是一種主要存在于蜂膠、紫葳科和松科植物等食品和天然植物中的黃酮化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗高血壓、抗糖尿病、抗高血脂等藥理活性[5]，是新藥研發中的一種非常重要的資源。研究表明，白楊素不僅可以顯著改善大鼠血清蛋白水平，還能降低低密度脂蛋白膽固醇水平，而高膽固醇水平是動脈粥樣硬化和許多與肥胖、心臟病、中風等脂質相關疾病的致病因素[6]。白楊素已成為治療肥胖及其并發癥等疾病的研究熱點。

Mangal等[4]報道來源于木蝴蝶中白楊素對胰脂肪酶有一定的抑制活性，當其濃度為250 μg mL-1時，胰脂肪酶的抑制率為52.08%±2.14%，但其抑制機制尚不清楚。本研究運用多種光譜學方法并結合分子模擬技術，研究白楊素對胰脂肪酶的抑制作用及機制，以期為白楊素作為抗肥胖營養補充劑的深入研究提供理論參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UV-2450紫外可見分光光度計(日本島津公司)；F-7000型熒光光度計(日本日立公司)；MOS 450型圓二色譜儀(法國Bio-Logic公司)；pHS-3C型pH酸度計(中國上海雷磁儀器有限公司)；Millipore Simplicity超純水機(法國Millipore公司)。

PL(Ⅱ型，來自豬胰腺，100-400單位Mg-1蛋白)購自Sigma-Aldrich公司；奧利司他(純度≥98%)購自(上海源葉生物科技有限公司)；白楊素(純度≥98%)和對硝基苯丁酸酯(pNPB)來自阿拉丁(上海)有限公司。用Tris-HCl緩沖液(pH8.0,0.05 mol)配制PL和pNPB儲備液，將白楊素溶于二甲基亞砜(DMSO)中作為儲備溶液。由于DMSO有較強的極性，所以體系中DMSO的含量控制在5%(v/v)以下。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶活性測定

通過抑制動力學方法測定白楊素對PL的抑制能力。首先，用Tris-HCl緩沖液配制5 mg mL-1PL溶液，充分溶解后將PL溶液放置在離心速度為10,000×g的離心機上離心5 min后，得到的上清液作為PL儲備液。在濃度為6.67×10-6mol L-1PL溶液中加入不同濃度的白楊素，混勻后置于37℃恒溫水浴中孵育30 min，冷卻至室溫后，快速加入一定量的底物pNPB(最終濃度1.71×10-3mol L-1)啟動反應，采用分光光度計的動力學/時間掃描模式在200 s內每間隔10 s測定1次反應體系在405 nm處的吸光度。通過關系式(1)，計算在含有不同濃度白楊素下PL的相對活性，并計算白楊素的半抑制濃度(IC50，表示PL活性被抑制50%時白楊素在反應體系中的濃度)[7]。未加抑制劑的PL活性定義為100%，奧利司他為陽性對照。

相對酶活性(%)=(R/R0)×100%

(1)

R0、R分別表示不存在抑制劑和添加不同濃度抑制劑時反應體系的吸光度隨時間的變化率(均已扣除空白對照)。

1.2.2 抑制可逆性和抑制類型測定

采用上述相同的實驗條件，在5組白楊素對PL活性抑制的測定體系中，固定pNPB濃度(最終濃度1.71×10-3mol L-1)，測定加入不同白楊素濃度時測定PL對pNPB的催化反應速率(ΔOD)，繪出ΔOD與PL濃度的關系曲線，根據該關系曲線分析白楊素對PL抑制可逆性。

在上述相同的條件下，在4組實驗中，改變白楊素的濃度，同時保持PL最終濃度在6.67×10-6mol L-1，測定反應體系中不同濃度的pNPB對酶促反應速率的影響，根據Lineweaver-Burk雙倒數方程，繪出酶促反應速率倒數與底物濃度倒數的關系曲線，評估白楊素對PL的抑制類型[8]。

1.2.3 熒光猝滅實驗

分別準確移取0.1 mL的PL溶液和2.4 mL的Tris-HCl緩沖液于1 cm熒光比色皿中，反應體系中PL的濃度固定為2.67×10-6mol L-1，隨后依次加入等體積的白楊素，共10次，每次滴加后混勻并靜置5 min，測定反應體系在不同溫度(298、304和310 K)下300～500 nm范圍的熒光光譜，并扣除緩沖溶液的背景熒光。設置激發波長為280 nm，激發和發射狹縫寬度為2.5 nm。

同時配制上述相同的反應系列，在298 K下測定反應體系在Δλ=15和60 nm(Δλ=λem-λex)時200～400 nm范圍的同步熒光光譜。為了消除“內濾光效應”，收集的熒光數據均通過以下方程進行校正[9]：

Fc=Fme(A1+A2)/2

(2)

Fc、Fm分別為校正后和測定的反應體系熒光強度，A1、A2分別表示白楊素在激發和發射波長下的吸光度。

1.2.4 非輻射能量轉移

當PL的發射光譜和白楊素的吸收光譜有足夠重疊時，它們的結合過程有可能發生非輻射能量轉移。在相同條件下，以人血清白蛋白(HSA)為標準溶液(HSA熒光量子產率φst為0.13[10])，測量HSA和PL的熒光強度Fst和Fx及其激發和發射波長下HSA和PL的吸光度Ast和Ax，根據方程(3)計算PL的熒光量子產率(φx)[11]：

(3)

白楊素與PL之間的能量轉移效率和結合距離可根據以下F?rster非輻射能量轉移理論方程求得[12]：

(4)

(5)

(6)

式中E代表PL與白楊素之間的能量轉移效率，R0表示E=50%時的臨界距離，κ2表示酶-抑制劑隨機分布的取向因子，其值為2/3，N代表介質的折射率(1.336)，J為白楊素的吸收光譜與PL的熒光發射光譜之間的重疊光譜積分，ε(λ)和F(λ)分別表示白楊素在波長λ處的摩爾吸收系數和PL的熒光強度。

1.2.5 圓二色光譜測定

在反應體系中保持PL的濃度為1.0×10-5mol L-1，將不同濃度的白楊素加入反應體系中，充分混勻靜止后，在連續氮氣通入下，測定游離PL及白楊素與PL不同摩爾比時的圓二色光譜(190～250 nm)，扣除緩沖介質信號，所得數據運用在線SELCON3程序(http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml)處理獲得PL二級結構的含量[12]。

1.2.6 分子對接

應用Discovery Studio 4.5程序的CDOCKER算法進行白楊素、奧利司他、底物pNPB與PL的分子對接。白楊素、奧利司他、底物pNPB的3D結構文件選自PubChem網站，PL的晶體結構(PDB ID：1ETH)從RCSB：PDB蛋白質數據庫獲得[13]。對接前先除去PL晶體結構中的所有水分子，同時加入氫原子和加極性處理；通過軟件中的CDOCKER程序執行受體PL和配體白楊素的對接，設定運行次數和對接公差分別設置為100和0.25。根據獲得的對接結果，選擇最低CDOCKER結合能的對接構象分析白楊素與PL的相互作用。

2 結果與討論

2.2.1 白楊素對PL抑制作用

隨著加入的白楊素濃度增大，PL的相對活性逐漸減小(圖1A)，當白楊素的濃度達到1.01×10-3mol L-1時，PL的殘留活性不再下降，隨后基本達到穩定，表明白楊素能夠抑制PL活性且存在濃度依賴關系。白楊素的IC50值為(8.21±0.02)×10-4mol L-1，而陽性對照奧利司他的IC50值則為(6.05±0.02)×10-5mol L-1，表明白楊素對PL有一定的抑制能力，但要弱于奧利司他。

(A)c(PL)=6.67×10-6 mol L-1,c(pNPB)=1.71×10-3 mol L-1;(B)c(pNPB)=1.71×10-3 mol L-1,c(chrysin)=0,1.80,3.60,5.40 and 7.20×10-4mol L-1 for curves a→e,respectively.

圖1B為不同濃度白楊素存在下，酶促反應速率v與PL濃度的關系圖。圖中所有直線均通過原點，在相同濃度抑制劑存在下，PL的濃度與酶促反應速率v呈正相關，而反應體系中白楊素的濃度越大，直線斜率越低，表明白楊素對PL的抑制過程是可逆的，其主要通過形成分子間的非共價鍵而產生相互作用。

2.2.2 白楊素對PL的抑制類型

如圖2所示，不同濃度下白楊素的擬合直線都在Y軸相交，同時直線斜率隨著白楊素濃度增加而增大，而vmax保持不變，表明白楊素對PL的抑制為競爭型抑制[14]。對于競爭型抑制劑，可用以下動力學方程進行描述[9]：

(7)

(8)

觀察到的每條直線的斜率與白楊素的濃度具有良好的線性關系(圖2左上角插圖)，表明白楊素與PL只有一個結合位點。根據方程(7)-(8)，計算出白楊素的抑制常數Ki值為(3.32±0.51)×10-4mol L-1，表明白楊素對PL具有中等強度的結合親和力。

c(PL)=6.67×10-6 mol L-1,c(chrysin)=0,2.70,5.40 and 8.10×10-4mol L-1 for curves a→d,respectively.The upper left was a plot of slope vs.[chrysin].

2.2.3 白楊素對PL的熒光猝滅分析

圖3A顯示在激發波長為280 nm時，PL在345 nm處有最大熒光發射峰，而白楊素在此激發波長下的熒光強度很弱(曲線L)，幾乎可以忽略不計。隨著滴加白楊素濃度的增大，PL的熒光強度逐漸減小，表明白楊素與PL發生相互作用而猝滅PL內源熒光。

c(PL)=2.67×10-6 mol L-1,c(chrysin)=0,1.97,3.93,5.90,7.87,9.83,11.80,13.77,15.73,17.70 and 19.67×10-6 mol L-1for curves a→k,respectively.Curve L was the fluorescence spectrum of chrysin alone at the concentration of 19.67×10-6 mol L-1.

熒光猝滅根據猝滅機制不同分為靜態猝滅和動態猝滅，靜態猝滅是猝滅劑與熒光物質相互作用形成不發熒光的基態復合物而導致熒光猝滅，其猝滅常數與溫度之間呈負相關，而動態猝滅則發生于猝滅劑與熒光物質的分子碰撞，其猝滅常數與溫度呈正相關[15]。應用Stern-Volmer方程評估熒光猝滅機制：

(9)

其中F0和F分別表示白楊素加入前后PL的熒光強度，Ksv代表猝滅常數，[Q]是白楊素的濃度，Kq表示雙分子猝滅速率常數，τ0表示未加入白楊素時熒光團分子的平均壽命，約為10-8s[9]。

根據Stern-Volmer方程，作F0/F與[Q]的關系圖(圖3B)，不同溫度下(298、304和310 K)，F0/F對[Q]線性回歸呈現出良好的線性關系(R>0.99)，表明白楊素對PL熒光猝滅為單一猝滅方式。通過方程(9)計算的猝滅常數Ksv值隨溫度升高呈降低的趨勢(表1)，其相應的Kq(Ksv=Kqτ0)值也遠大于生物分子的最大擴散碰撞猝滅速率常數(2.0×1010L mol-1s-1)，表明白楊素對PL熒光猝滅機制為靜態猝滅[16]。

表1 不同溫度下白楊素與PL相互作用的結合參數及熱力學參數

2.2.4 結合常數、結合位點數及熱力學參數分析

靜態猝滅過程中猝滅劑與熒光分子相互作用的結合常數(Ka)和結合位點數(n)通過以下方程計算[10]：

(10)

[Qt]和[Pt]分別代表白楊素和PL的濃度。計算出白楊素與PL的結合常數Ka值為104數量級L mol-1(表1)，表明其相互作用存在中等強度結合親和力，Ka值隨溫度的升高而降低，表明溫度升高兩者結合作用減弱。3個溫度下白楊素與PL的結合位點數n值都約為1，表明白楊素在PL上只有一個或一類結合位點，這與上述“2.2.2白楊素對PL的抑制類型”分析結果一致。

由熱力學參數可以確定白楊素和PL之間的結合力的類型，焓變(ΔH°)、熵變(ΔS°)和吉布斯自由能(ΔG°)可由van’t Hoff方程求得[17]。

(10)

ΔG°=ΔH°-TΔS°

(11)

式中R值表示氣體常數，其值為8.314 J mol-1K-1。由表1可見，白楊素與PL結合作用的ΔG°<0，表明兩者結合是自發進行的；ΔH°<0，ΔS°>0，表明白楊素與PL相互作用過程是一個放熱過程，疏水作用力和氫鍵是其結合的主要驅動力[18]。

2.2.5 同步光譜分析

Δλ=15和60 nm的同步熒光光譜分別為蛋白質中酪氨酸和色氨酸殘基的特征光譜。圖4A顯示隨著體系中白楊素濃度的增加，PL中酪氨酸和色氨酸殘基的熒光強度逐漸降低，且2個熒光峰最大波長均有一定的紅移(酪氨酸從286→291 nm，色氨酸從290→292 nm)，表明白楊素與PL的結合增強了酪氨酸和色氨酸周圍微環境的極性[19]。同時，白楊素對同步熒光的猝滅百分率RSFQ(RSFQ=1-F/F0)結果表明，白楊素對色氨酸殘基的熒光猝滅百分率稍大于酪氨酸殘基(圖4B)，當白楊素的濃度達到1.97×10-5mol L-1時，對色氨酸殘基熒光猝滅百分率65.12%，而對酪氨酸殘基熒光猝滅百分率62.35%，表明白楊素誘導PL的熒光猝滅，色氨酸殘基的貢獻稍大于酪氨酸殘基，類似的結果在表沒食子兒茶素與α-葡萄糖苷酶相互作用中也被發現[20]。

c(PL)=2.67×10-6 mol L-1,c(chrysin)=0,1.97,3.93,5.90,7.87,9.83,11.80,13.77,15.73,17.70 and 19.67×10-6 mol L-1for curves a→k,respectively.

2.2.6 非輻射能量轉移和結合距離測定

圖5顯示白楊素的紫外-可見吸收光譜與PL的熒光發射光譜有一定的重疊。根據方程(3)計算出PL的熒光量子產率φx為0.12。再由上述方程(4)-(6)計算得到白楊素與PL之間的重疊光譜積分J=5.44×10-14cm3L mol-1，臨界距離R0=3.26 nm，結合距離r=4.41 nm，r<8 nm 且0.5R0

c(PL)=c(chrysin)=2.67×10-6 mol L-1

2.2.7 圓二色譜分析

圓二色譜法是測定配體對蛋白質結構影響的一種靈敏有效的方法。如圖6所示，游離PL的圓二色光譜在208和228 nm附近顯示兩個負的吸收峰，是PL結構α-螺旋的多肽骨架發生n→π*躍遷產生的特征峰[21]。隨著加入白楊素濃度的增大，PL的2個峰信號強度逐漸降低，208 nm特征峰的位置也發生一定程度的紅移，PL二級結構含量發生了變化(表2)。當白楊素與PL的摩爾比由0:1增大到4:1時，PL的α-螺旋由32.10%增加到34.37%，β-轉角從23.97%提高到25.76%，而β-折疊則是從21.33%減少至19.84%，無規則卷曲從22.60%下降到20.03%，表明白楊素與PL相互作用導致PL的結構緊縮，其表面疏水性有所增加，將影響底物和PL的結合[22]。

c(PL)=1.00×10-5 mol L-1,the molar ratios([chrysin]/[PL])were 0:1,1:1 and 4:1

表2 白楊素對PL二級結構的影響

2.2.8 分子對接

分子對接技術可以直觀地顯示配體與受體的結合位點和結合構象并可用于其相互作用機理分析。圖7A,C,E為白楊素、奧利司他和pNPB與PL進行100次分子對接結果中能量最低和結合次數最多的復合物結合構像。白楊素、奧利司他、pNPB結合于PL疏水空腔活性位點所需要的最低能量分別為-35.28、-54.78和-32.33 kJ mol-1，表明它們與PL的結合能力大小依次為奧利司他>白楊素>pNPB[23]。

圖7 白楊素(A)、奧利司他(C)和pNPB(E)與PL分子模擬的3D結構圖；白楊素(B)、奧利司他(D)及pNPB(F)相互作用的氨基酸殘基

3 結論

本研究發現白楊素以競爭性方式可逆地抑制PL活性，其IC50值為(8.21±0.02)×10-4mol L-1，白楊素通過氫鍵和疏水作用與胰脂肪酶結合形成復合物，白楊素在胰脂肪酶上有一個結合位點且該位點更接近色氨酸殘基，結合過程很可能發生了非輻射能量轉移。白楊素主要與胰脂肪酶疏水空腔中Glu188,Pro194,Gln220、Thr221,Val322和Ser323殘基發生氫鍵和疏水相互作用且占據了酶活性中心位點，導致胰脂肪酶的α-螺旋和β-轉角含量增加，β-折疊和無規則卷曲含量減少，酶二級結構發生了變化，結構變得更加緊密，影響酶活性中心的形成，阻礙了底物進入活性中心與酶作用，從而降低了胰脂肪酶的催化活性。該發現為進一步研究白楊素作為天然抗肥胖的食品功能因子提供了理論參考。