以TGase催化交聯魚皮明膠為壁材制備羅伊氏乳桿菌微膠囊工藝

郭帥玲，張鈺龍，廖嘉婧，徐 進，巫小丹，萬 茵，付桂明，b*

(南昌大學a.食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047;b.國際食品創新研究院，江西 南昌 330000)

羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)作為一種內源性乳酸菌，主要存在于脊椎動物和哺乳動物胃腸道內，是應用最廣的益生乳酸菌之一[1]。但L.reuteri在熱干燥加工及貯藏過程中，菌體活性隨時間的延長大幅降低，嚴重影響其益生作用。噴霧干燥微膠囊包埋技術是對乳酸菌的一種保護技術，可在活菌表面形成一層半透性或密封的囊膜，構成微膠囊，在特定條件下將內部包埋的菌體釋放[2]，從而增強乳酸菌對環境的抵抗力，顯著提升菌體存活率，使其在腸道中定殖，充分發揮乳酸菌益生功能的作用[35]。噴霧干燥法包埋乳酸菌相比于冷凍干燥，包埋率更高，粒徑大小更均勻，氧化穩定性更好，故噴霧干燥法是更優的制備微膠囊的干燥技術[6]。魚皮明膠作為一種新型壁材，因其具有良好的生物相容性、生物降解性和低免疫原性等特性，廣泛應用于制備可食性膜和食品表面涂層等方面。

谷氨酰胺轉氨酶(Transglutaminase，TGase)可催化蛋白質分子中谷氨酰胺殘基和賴氨酸殘基，形成ε-(γ-谷氨酸)賴氨酸共價鍵，在分子內或分子間產生交聯，提高凝膠強度和成膠性能。姜燕[12]等研究了TGase分別處理大豆分離蛋白(SPI1和SPI2),酪蛋白酸鈉(NaCN1和NaCN2)及明膠(G1和G2)可改善3類蛋白質膜的抗拉強度和表面疏水性。Wang[24]等采用MTGase與酪氨酸酶催化明膠-殼聚糖偶聯反應，兩種酶共同作用，提高了明膠-殼聚糖雙酶改性材料在水介質中的穩定性。

本文通過TGase對魚皮明膠進行交聯改性，使得明膠α-螺旋相對含量增加，并保留更多的分子內氫鍵，增強了肽鏈間相互作用力，提高其成膜性能，復配麥芽糊精制備壁材，采用噴霧干燥法進行壁材包埋L.reuteri微膠囊，并進行噴霧干燥單因素和響應面優化實驗，確定最優噴霧干燥工藝參數，為生產提供一種低成本，活菌存活率高的L.reuteriNCUF 203.1微膠囊產品提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

主要材料：B型魚皮明膠購于上海鑫汐生物科技有限公司(中國上海市)；TGase購自江蘇省一鳴生物有限公司(中國江蘇省)；L.reuteriNCUF 203.1是實驗室保存菌株(MRS斜面培養基，37 ℃靜置培養)

主要儀器：B-290小型噴霧干燥機(瑞士步琦有限公司)、MCR302流變儀(上海安東帕商貿有限公司)、ZDX-35BI立式蒸汽滅菌鍋(上海申安醫療器械有限公司)、TG16-WS冷凍高速離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)

1.2 實驗方法

1.2.1 魚皮明膠TGase催化交聯改性制備L.reuteri微膠囊壁材

按照魚皮明膠與麥芽糊精溶液(混合比例為3:7)混合均勻，調節溶液pH值為7.0，加入TGase(20 U/g魚皮明膠)，在40 ℃催化交聯反應90 min，反應結束后100 ℃加熱5 min，進行滅酶，不加TGase作為空白對照組。

1.2.2L.reuteri微膠囊壁材溶液性質分析

TGase催化的交聯度測定采用Caterina[7]方法測定，用%表示；壁材溶液的乳化性能采用Xin[8]實驗方法；壁材溶液的起泡性能采用Cokun Z[9]實驗方法。

1.2.3L.reuteri微膠囊的制備

1.2.3.1 濃縮菌液的制備

L.reuteri經過MRS平板37 ℃培養48 h后，挑單菌落于5 mL MRS液體培養基中，并在37 ℃下培養12 h，然后轉接到100 mL MRS液體培養基中進一步擴大培養24 h后，將處于對數期后期的菌液，在4 ℃離心后棄上清液，以無菌生理鹽水洗滌兩次，菌體重新懸浮于生理鹽水中得到濃縮菌液(1011 CFU/mL)，最后利用平板計數法對該菌液精確計數。

1.2.3.2 噴霧干燥制備微膠囊

將1.2.1所制備的交聯溶液與濃縮菌液按照一定比例混合均勻，分別設置進口溫度、進料流量和菌壁比不同參數進行噴霧干燥。干燥結束后，立即將制備得到的TG-FSG-M(經TGase交聯處理的壁材)包埋的微膠囊收集于無菌密封玻璃瓶中，于4 ℃儲存。以FSG-M(不添加TGase的魚皮明膠溶液)為對照組。

1.2.3.3 不同噴霧干燥條件的單因素實驗

分別設置進風溫度(100 ℃，110 ℃，120 ℃，130 ℃，140 ℃)，進料流量(1.5，3，6，9，12 mL·min-1)和菌壁比(0.02，0.1，0.2，0.5，1)不同參數進行噴霧干燥三個因素分別進行單因素實驗，每組重復3次，來優化噴霧干燥工藝。

1.2.4 響應面法優化噴霧干燥微膠囊活菌數

以L.reuteri微膠囊的包埋活菌數為響應值，根據單因素的實驗結果，采用Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，TG-FSG-M包埋，選擇進風溫度、進料流量、菌壁比這3個因素進行響應面分析實驗，每組實驗重復3次，取平均值。

設計的響應面因素水平編碼如下表所示。

表1 響應面法因素水平編碼表

1.2.5 微膠囊活菌數的測定

采用活菌計數法測定[10]。

1.2.6 微膠囊水分含量的測定

采用水分含量測定儀測定，用%表示[11]。

1.3 數據統計與分析

每組實驗設定3個平行樣本，利用Design Expert 8.0設計以及分析數據，Excel 2016計算平均值及偏差，SPSS 25進行數據顯著性分析，Origin 2018作圖。

2 結果與分析

2.1 TGase催化魚皮明膠的溶液性質

由表2可知隨著TGase催化魚皮明膠的交聯時間延長，魚皮明膠的交聯度逐漸升高，當交聯時間為90 min時，其交聯度為15.45%，出現這種現象的原因可能是因為TGase的加入使得魚皮明膠分子中的賴氨酸和谷氨酰胺發生交聯反應后使得魚皮明膠溶液中的氨基總濃度降低，與試劑反應的化合物減少，吸光度降低導致的，這與姜燕[12]等人的研究結果一致。史瑩[13]研究發現，TGase交聯兩種牛乳酪蛋白后，其交聯度分別增加，這與本文所研究的結果一致。TGase因其可以修飾強化蛋白質的結構穩定性，并能改善其控釋性能，在微膠囊包埋益生菌領域具有良好的應用[14]。

表2 TGase催化魚皮明膠的交聯時間對其交聯度的影響

2.2 TGase交聯魚皮明膠對壁材溶液的乳化性能的影響

由表2可知隨著TGase交聯魚皮明膠交聯度的升高，壁材溶液的乳化性呈現先升高再降低的趨勢，且當交聯度為15.45%時，乳化性為64.25 m2/g，較未交聯的提高了14.5%；乳化性較高可顯著降低壁材溶液的油-水界面的張力，減少溶液不穩定和液滴凝聚現象，是壁材有效包裹芯材的前提條件。Petruccelli[15]研究發現TGase將賴氨酸上的氨基和谷氨酰胺上的羥酰胺基結合，減少了自由氨基的量，導致明膠分子的疏水性增加，增強了了疏水基團與油的相互作用，乳化性增加。劉穎[16]在研究TGase改善大豆11S蛋白聚合的條件時發現，經過TGase交聯改性后大豆11S蛋白的乳化性從30.27%提高至61.15%；Hu X[17]研究發現采用TGase交聯花生分離蛋白時發現TGase處理形成聚合物可改善乳化活性，這與本文研究結果相似。

2.3 TGase交聯魚皮明膠對壁材溶液起泡性的影響

由表2可知經TGase交聯魚皮明膠后，隨著其交聯度的增加，溶液的起泡性呈現先升高后降低的趨勢，且在交聯度為15.45%時起泡性最高達到140.00%，較未交聯的提高了17.90%；出現這種現象的原因可能是隨著TGase交聯魚皮明膠的交聯程度增加使得明膠溶液的黏度增大，氨基含量減少引起靜電斥力減小，使蛋白質分子之間的相互作用增強，更易于吸附到界面，導致起泡性增加。當交聯度超過15.45%時，明膠溶液的黏度過大，嚴重影響溶液的流動性，使得起泡性降低。張曉琳[18]在研究TGase對大豆分離蛋白的起泡性時發現TGase酶量40 U/g，pH值6.0，交聯溫度45 ℃，交聯時間2 h時起泡性較原料提高了46.66%；這與本文的研究結果相一致。

2.4 TGase交聯魚皮明膠對L.reuteri進行噴霧干燥的單因素實驗結果

2.4.1 噴霧干燥包埋L.reuteri過程中不同進風溫度的單因素結果

從圖1可以看出，隨著進風溫度的提高，出風溫度不斷提高，采用FSG-M制備微膠囊時的出風溫度顯著高于TG-FSG-M；而水分和L.reuteri活菌數隨進風溫度的提高呈現逐漸降低的趨勢，TG-FSG-M制備的微膠囊的含水量和內部的活菌數顯著高于FSG-M

注：*代表顯著性差異(p<0.05)。

這些結果表明TGase交聯改性對提高包埋L.reuteri的活菌數有良好改善效果。出現這種現象的可能的原因是，TGase交聯使魚皮明膠分子內部的網絡結構更加致密，與FSG-M微膠囊相比TG-FGS-M對熱量的緩沖能力更強，對活菌的熱損傷有更好的保護作用。

TG-FSG-M制備微膠囊水分含量略高于FSG-M，可能的原因是TGase交聯導致壁材溶液的黏度增加，水分蒸發困難，干燥速率降低，導致水分含量升高。進風溫度過低，水分受熱蒸發不完全，微膠囊含水量過高，菌粉黏度大，塔內黏壁現象明顯，噴霧干燥效果差、微膠囊得率低。隨著進風溫度的升高，出風溫度不斷升高，微膠囊顆粒干燥時間減少，使其較迅速地在表面形成完整且致密的微膠囊結構[19]。不同菌種的抗熱性能具有一定差別，L.reuteri可在60 ℃～65 ℃的出風溫度下存活，相比于其他種類乳酸菌，抗逆性較強。

進風溫度為120 ℃時，出風溫度為64.5 ℃±0.5 ℃時，對L.reuteri不會產生明顯的熱損傷，此時微膠囊水分含量為4.17%。含水量是體現微膠囊性能的一個重要指標，適當低的含水量可以保證細胞處于休眠狀態，對微膠囊內L.reuteri的活性有著重要的作用。進風溫度過高，料液液滴表面水分迅速蒸發，內部的水分來不及遷移到表面來補充，會引起微膠囊產品水分過低，囊殼表面開裂，熱量通過裂縫進入微膠囊內部，加劇L.reuteri的活菌損失，使微膠囊化效率和產率均下降，同時，含水量太低在儲存和運輸過程中容易破裂，影響產品品質[20]；含水量太高會引起料液結塊、霉變、滋生雜菌、儲存期短。因此選擇進風溫度120 ℃為進行下一步研究。

2.4.2 不同進料流量的單因素實驗

從圖2可以看出，隨著進料流量的提高，TG-FSG-M制備微膠囊的出風溫度降低，所得微膠囊中L.reuteri活菌數呈現先升高再下降的趨勢；其中TG-FSG-M制備的微膠囊內部的活菌數和含水量較FSG-M微膠囊更高，而TG-FSG-M微膠囊的出風溫度要顯著低于FSG-M微膠囊。

注：*代表顯著性差異(p<0.05)。

進料流量從1.5 mL·min-1增加到9 mL·min-1時，TG-FSG-M制備的微膠囊中的L.reuteri活菌數從7.96 log CFU/g上升到8.22 log CFU/g。這可能的原因是在噴霧干燥進風溫度不變的情況下，進料流量過低，導致出風溫度過高，使得活菌數減少；隨著進料流量的提高，水分不斷蒸發，由于汽化作用導致出風溫度降低，對L.reuteri菌體的熱損傷作用減弱，失活菌體數減少。但是進料流量過大，微膠囊中的水分來不及蒸發就被旋風分離器帶走，導致產品中水分過高，容易粘到噴霧塔壁造成微膠囊產率下降。

Endo[21]等研究指出，乳酸菌微膠囊產品的含水量對其儲存穩定性有影響，益生菌微膠囊產品的水分含量應保持在2.8%～5.0%。當進料流量增加到9 mL·min-1時，TG-FSG-M制備的微膠囊其水分含量高達5.45%，不利于長期保存。進料流量對微膠囊顆粒也有一定影響，但進料流量過大，導致微膠囊干燥效果和產品的流動性不佳，容易相互粘連[22]。因此進料流量選擇6 mL·min-1進行下一步研究。

2.4.3 不同菌壁比的單因素實驗

由圖3可以看出，由于進風溫度和進料流量不變，需要蒸發的水分量不變，吸收的汽化潛熱不變，故出風溫度差別不大，得到微膠囊的溫度基本相同，使不同菌壁比對微膠囊水分含量的影響不大，水分含量均在5%以下，符合微生物微膠囊的儲存要求。但隨著菌壁比的提高，微膠囊中L.reuteri活菌數呈現先升高再下降的趨勢，在菌壁比為0.5時活菌數最高為8.18 log CFU/g。采用相同體積壁材溶液噴霧干燥制備微膠囊的過程中，菌壁比較低時，單個微膠囊包埋的菌體數量較少，包埋率及存活率較低。隨著菌壁比的增加，L.reuteri被壁材包埋的可能性增加，使微膠囊中L.reuteri活菌數顯著增加，同時節約了壁材投料量，降低了成本。但當菌壁比超過0.5時，噴霧干燥得到的單個微膠囊中的菌體數量超出壁材最大包裹能力后，多余部分附著于壁材液滴外部，可能會破壞壁材溶液分散狀態，引發乳滴聚集，降低微膠囊包埋率，對于受熱易失活的L.reuteri，暴露越多受熱變性越嚴重，故活菌數顯著下降[23]。TG-FSG-M制備微膠囊中的L.reuteri為8.18 log CFU/g，比FSG-M微膠囊的活菌數提高0.58 log CFU/g，表明魚皮明膠經過TGase交聯后，壁材溶液的黏度增加，成膜性提高，包裹菌體的能力增強，因此菌壁比選擇0.5比較合適。

注：*代表顯著性差異(p<0.05)。

2.4.4 響應面法優化噴霧干燥制備L.reuteri微膠囊活菌數

以進風溫度、進料流量、菌壁比為自變量，以TG-FSG-M包埋，利用響應面法分析優化噴霧干燥制備L.reuteri微膠囊工藝參數。

以活菌數為響應值，測定結果如下表所示：

根據Design-expert 8.0軟件分析，以進風溫度、進料流量、菌壁比為自變量，L.reuteri活菌數為因變量，建立的回歸方程如下：

活菌數(log CFU/g)=8.48-0.39A+0.56B+0.15C-1.26A2-1.27B2-1.25C2+0.33AB+0.04AC-0.24BC

2.4.5 進風溫度和進料流量對L.reuteri微膠囊活菌數的影響

由圖4A可知，進風溫度一定時，包埋活菌數隨著進料流量的增加而增大，但當進料流量增加到一定量時，包埋活菌數隨進料流量的增加而減小；進料流量一定時，進風溫度變化呈現相似的變化趨勢。結果表明進風溫度和進料流量對L.reuteri活菌數有影響，適當的進風溫度和進料流量可以使包埋活菌數達到最大。

2.4.6 進風溫度和菌壁比對L.reuteri微膠囊活菌數的影響

由圖4B可知，進風溫度和菌壁比對L.reuteri包埋活菌數有影響。在進風溫度一定時，包埋活菌數隨著菌壁比的增加而增大，但當菌壁比增加到一定量時，包埋活菌數隨菌壁比的增加而減小；在菌壁比一定時，進風溫度變化呈現相似的趨勢。這個結果表明適當的進風溫度和菌壁比可以使包埋活菌數達到最大，與單因素實驗的結論相吻合。

2.4.7 進料流量和菌壁比對L.reuteri微膠囊包埋活菌數的影響

由圖4C可知，進料流量一定時，包埋活菌數隨著菌壁比的增加而增大，但當菌壁比增加到一定量時，包埋活菌數隨菌壁比的增加而減小；菌壁比一定，進料流量變化出現相似的趨勢。這個結果表明進料流量和菌壁比對L.reuteri包埋活菌數有影響，適當的進料流量和菌壁比可以使包埋活菌數達到最大。

圖4 不同因素對L.reuteri微膠囊包埋活菌數的交互作用

2.5 回歸方程方差分析

運用Design-expert 8.0軟件對17個實驗點的響應值進行回歸分析，得到L.reuteri微膠囊包埋活菌數的回歸方程分析如表3所示。

表3 響應面試驗結果

表4 實驗設計方差分析

由表可以看出，活菌包埋率總回歸模型在α=0.01水平上是極顯著的，而失擬項則是不顯著的，說明所建立的模型是正確的。由各因素檢驗可以看出，對活菌數的影響程度為進料流量>進風溫度>菌壁比，進風溫度、進料流量，進風溫度的二次項，進料流量的二次項，菌壁比的二次項，進風溫度和進料流量的交互作用、進料流量和菌壁比的交互作用的影響在α=0.01水平上是極顯著的，菌壁比的影響在α=0.05水平上是顯著的。

2.6 驗證實驗

根據軟件計算得到最優反應條件為：進風溫度為117.46 ℃，進料流量為7.79 mL·min-1，菌壁比為0.5，在此條件下，軟件預測的活菌數為8.57 log CFU/g。根據噴霧干燥儀的實際操作要求，調整條件為：進風溫度為117 ℃，進料流量為7.8 mL·min-1，菌壁比為0.5，噴霧制備L.reuteri微膠囊，此時出風溫度在62.5 ℃±2.5 ℃。按此條件所得微膠囊活菌數為8.18±2.50 log CFU/g，與模型預測值差距較小，證明該模型的重現性較好。

3 結論

魚皮明膠由于其乳化性和成膜性好，可使蛋白質分子形成穩定的空間結構，使得L.reuteri在噴霧干燥包埋過程中迅速形成熱可逆凝膠膜，使其免受高溫脫水損傷，提高微膠囊在加工和儲存期間的穩定性。本文采用TGase對魚皮明膠進行改性，制備壁材溶液，魚皮明膠的交聯度為15.45%，壁材溶液的乳化性和起泡性分別為為64.25 m2/g，140.00%，通過單因素和響應面優化實驗確定了最佳噴霧干燥工藝參數為進風溫度117 ℃，進料流量7.8 mL·min-1，菌壁比0.5。在此條件下，L.reuteri微膠囊包埋活菌數為8.18±2.50 log CFU/g，較未交聯的活菌數提高了104%，可為食品明膠作為壁材原料進行噴霧干燥制備L.reuteri微膠囊工業化生產提供了良好的理論指導。