TEAD4與子宮頸鱗狀細胞癌增殖和侵襲的關系及分子機制探討

姚華娟，張雨婷，王紅梅，熊秀娟，宋恩霖*

(1.南昌大學撫州醫學院，江西 撫州 344000；2.南昌大學基礎醫學院，江西 南昌 330006)

子宮頸癌是影響女性健康的常見惡性腫瘤之一，且近年其發病有年青化趨勢，許多年青患者早期即出現不良的生物學行為，如局部浸潤和轉移，導致預后不良。故鑒定出與子宮頸癌不良生物學行為有關的分子靶標，對子宮頸癌的治療和預后評估具有重要意義。高危型人乳頭瘤病毒(HPV16/18)感染是引起子宮頸癌最主要的原因，目前有實驗證據表明，在HPV16誘導下的角質細胞中存在TEAD4的高水平表達[1]，說明TEAD4很可能參與子宮頸鱗狀細胞癌發生發展的過程，然而它對子宮頸鱗癌的具體調節功能尚不清楚。

TEAD4(transcriptional enhancer associate domain family member 4)屬于TEAD轉錄因子蛋白家族成員之一[2]，TEAD4分子的轉錄激活結構域能與YAP(Hippo信號通路中主要的共激活因子)相結合，形成轉錄調控復合體，調控下游靶基因的轉錄。目前已發現，TEAD4與胃癌[3]、口腔鱗癌[4]等多種惡性腫瘤的不良生物學行為有關，但關于TEAD4與子宮頸癌的關系目前尚未見報道。本課題通過檢測子宮頸鱗狀細胞癌組織中TEAD4蛋白的表達情況，分析TEAD4的表達與子宮頸鱗狀細胞癌不良生物學行為之間的關系，在細胞學水平觀察高水平TEAD4的條件下，子宮頸鱗癌細胞增殖和侵襲能力的變化，并進一步觀察此條件下癌細胞中相關信號蛋白的表達變化情況，從而研究TEAD4與子宮頸鱗狀細胞癌增殖和侵襲的關系及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 組織標本

收集南昌大學撫州醫學院附屬醫院確診的浸潤性子宮頸鱗狀細胞癌癌石蠟包埋標本50例，患者平均年齡44歲。所有患者術前均未行放、化療。另取20例正常宮頸上皮組織標本作為對照組。

1.2 免疫組化

采用MaxVision法，石蠟標本3～5 μm厚切片，65 ℃烘箱烤片2 h，常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，自來水沖洗，檸檬酸鈉抗原熱修復，3%H2O2處理，PBS漂洗。取目標蛋白一抗(兔抗人TEAD4多克隆抗體，504151，成都正能生物技術有限公司；兔抗人MMP9多克隆抗體，27306-1-AP，美國Proteintech公司))工作液50 μL孵育，4 ℃過夜，PBS洗滌后，每片滴加MaxVision二抗工作液(KIT-5010，福州邁新生物公司)50 μL，室溫下孵育30 min，充分洗滌后DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封固。以PBS代替一抗作陰性對照。測量平均光密度(mean optic density,MOD)進行蛋白表達半定量結果判定。在光鏡下選取腫瘤組織中陽性最強的3個高倍視野(×400)，數碼拍照，圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0準確分割陽性區域，測量MOD值。相同條件下，每張圖片測量3次，每張切片選取3張視野測量，以9次測量的MOD均值作為該視野中蛋白的表達強度。

1.3 子宮頸鱗癌SiHa細胞TEAD4基因瞬時轉染

子宮頸鱗癌細胞SiHa(TCHu113，中國科學院上海細胞庫)用含10%胎牛血清及雙抗的DMEM培養基常規培養于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中。3×105/mL的細胞濃度接種2 mL細胞懸液于6孔板，24 h后更換為無血清無雙抗的基礎培養基。實驗分為3組：control組、vector組(空載質粒)、pCMV3-TEAD4組，分別用無血清無雙抗的DMEM 500 μL稀釋6 μg的pCMV3-TEAD4過表達質粒(上海吉凱基因科技有限公司)、6 μg的pCMV3空載質粒(上海吉凱基因科技有限公司)和2只10 μL脂質體Sinofection(STFO2，北京義翹神州生物公司)，室溫孵育5 min，各自將質粒和轉染試劑混合形成轉染復合物，室溫孵育20～25 min，加入對應孔板中。control組加入正常培養細胞的完全培養基，轉染后培養6 h，更換培養基為新鮮含10%血清不含雙抗的培養基，繼續培養至48 h，通過Western blot檢測轉染效果及相關蛋白變化，每組實驗重復3次。

1.4 Western blot

Ripa裂解液中加入蛋白酶抑制劑和磷酸酯酶抑制劑，配成細胞裂解液。利用該細胞裂解液裂解目的細胞從而提取總蛋白，用以檢測TEAD4、p-ERK(兔抗人多克隆抗體，AF1015，購自美國Affinity公司)、total-ERK(兔抗人多克隆抗體，16443-1-AP，美國Proteintech公司)和MMP9蛋白表達；蛋白濃度測定后，按每孔20 μL上樣量用Loading Buffer和Ripa液配平，沸水加熱(5min)后冷卻離心上樣，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉，加入一抗4 ℃過夜；TBST洗滌后加入二抗(1:5 000)常溫搖床孵育；洗滌膜后，利用ECL化學發光試劑盒孵育發光，顯影。利用Image Pro Plus軟件測量目的蛋白條帶和內參條帶的灰度值，以目的條帶灰度值與內參灰度值的比值作為蛋白的相對表達水平。每組目標蛋白的表達水平檢測實驗重復3次。

1.5 CCK-8細胞增殖實驗

將正常SiHa細胞制成細胞懸液，按每孔100 μL含2 000個細胞的濃度接種于96孔板，分為control組、vector組、pCMV3-TEAD4組，每組5個復孔，孔板中為無血清無雙抗的培養基。細胞貼壁后分別對vector組和pCMV3-TEAD4組的癌細胞分別進行空質粒和pCMV3-TEAD4質粒轉染，轉染6 h后更換培養基為新鮮含10%血清不含雙抗的培養基，繼續培養至48 h，加入10%的CCK-8工作液(CCK-8試劑盒，CK04，北京沃比森科技公司)，在培養箱繼續培養3 h，于酶標儀450 nm處測OD值，計算各組細胞增殖活力值。

1.6 Transwell小室細胞侵襲實驗

將pCMV3空載質粒(vector組)和pCMV3-TEAD4過表達質粒(pCMV3-TEAD4組)分別轉染SiHa細胞48 h后，調整細胞濃度為5×104/mL，將含有基膜提取物涂層并包被有聚碳酸酯膜的Coring Transwell小室置于24孔板，于小室的上室脂膜上鋪一層薄層Matrigel基質膠(約100 μL)，待基質膠自然干燥后再于上室接種100 μL上述細胞懸液(含5000個細胞)，通過上室的測孔于下室中加入含有15%FBS的DMEM培養基500 μL，并使得上室底部與下室培養基剛好接觸，37 ℃培養24 h后，各上室加入適量的蘇木精染色5 min，PBS洗滌，環形切割上室底部微孔膜，粘貼于載玻片，中性樹膠固封，顯微鏡下(×200)隨機觀察5個代表性視野，計數每個視野中細胞數，取均數代表各組細胞的侵襲能力，每組實驗重復3次。

1.7 統計學分析

采用SPSS19.0統計軟件進行統計學分析，實驗數據采用“均數±標準差”，組間比較采用t檢驗，相關性分析采用Spear相關分析法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮頸鱗癌組織中TEAD4的表達

TEAD4在正常子宮頸上皮中的表達呈弱陽性甚至陰性(圖1A)；而在子宮頸癌組織中的表達呈明顯強陽性，其主要表達于子宮頸鱗癌細胞的胞質和(或)胞核(圖1B)。光密度檢測分析發現，TEAD4在宮頸鱗癌組織的平均表達水平(0.186±0.355)顯著高于其在正常子宮頸上皮中的表達水平(0.0494±0.0105，P<0.001，圖1C)。

圖1 (A)TEAD4在正常宮頸上皮組織中呈微弱表達(Maxvision染色,×400，箭頭：微弱表達的陽性細胞)、(B)TEAD4在宮頸鱗癌組織中呈強陽性表達，表達于癌細胞的胞質和/或胞核(Maxvision染色,×400，箭頭：強陽性表達的細胞)、(C)TEAD4在宮頸鱗癌(50例)中表達水平顯著高于正常宮頸上皮組織(20例)，*，P<0.001。

2.2 子宮頸鱗狀細胞癌組織中TEAD4的表達與臨床病理參數之間的關系

TEAD4的表達與子宮頸鱗狀細胞癌淋巴結轉移(P<0.05)、脈管浸潤(P<0.05)和宮旁浸潤(P<0.05)有關，與腫瘤大小、分化程度以及患者的年齡無關(表1)。

表1 TEAD4的表達與子宮頸鱗狀細胞癌病理參數之間的關系

2.3 子宮頸鱗狀細胞癌組織中TEAD4的表達與MMP9表達的相關性

MMP9在正常宮頸上皮組織中呈弱表達(圖2A)，在子宮頸癌組織中呈明顯陽性表達，胞質呈棕黃色顆粒(圖2B)，且MMP9的表達與TEAD4的表達呈正相關(r=0.394，P<0.01，圖2C)。

子宮頸鱗狀細胞癌組織中TEAD4表達水平

2.4 TEAD4過表達對子宮頸鱗癌細胞增殖能力的影響

pCMV3-TEAD4質粒轉染組癌細胞中TEAD4的表達水平(0.84±0.037)顯著高于control組(0.43±0.061，P<0.01)和vector組(0.47±0.045，P<0.01)，而control組和vector組癌細胞中TEAD4的表達水平無明顯差異，說明基因轉染成功(圖3A-B)。CCK-8細胞增殖實驗結果顯示(圖3C)，pCMV3-TEAD4組癌細胞增殖活力(1.18±0.067)分別顯著高于control組和vector組癌細胞(0.94±0.033，P<0.01；0.93±0.037，P<0.01)。

圖3 (A)宮頸鱗癌細胞TEAD4基因轉染組、空白對照組和陰性轉染組中TEAD4蛋白的表達，con,空白對照組；vec，空質粒轉染的陰性對照組；pCMV3-TEAD4，TEAD4基因表達質粒轉染組、(B)TEAD4在TEAD4基因表達質粒轉染組(n=3)的表達水平分別顯著高于空白對照組(n=3,P<0.001)和陰性對照組(n=3,P<0.001)、(C)TEAD4基因轉染組宮頸鱗癌細胞的增殖能力分別顯著高于空白對照組(n=5,P<0.001)和陰性對照組(n=5,P<0.001)。

2.5 TEAD4過表達對子宮頸鱗癌細胞侵襲能力的影響

Transwell小室實驗結果顯示(圖4A)，pCMV3-TEAD4組癌細胞侵襲能力(81.3±7.23)分別顯著高于control組和vector組癌細胞(55.3±8.50，P<0.05；59.0±8.54，P<0.05)(圖4B)。

圖4 (A)Transwell小室實驗檢測比較TEAD4基因轉染組、空白對照組和陰性轉染組的宮頸鱗癌細胞侵襲能力；con，空白對照組，vec，陰性對照組，pCMV3-TEAD4,TEAD4基因轉染組(n=3，蘇木素染色，×200)、(B)TEAD4基因轉染組(n=3)癌細胞侵襲能力分別顯著高于空白對照組(n=3，P<0.05)和陰性對照組(n=3，P<0.05)。

2.6 TEAD4高表達對子宮頸鱗癌細胞中ERK磷酸化與MMP9蛋白表達的影響

pCMV3-TEAD4組癌細胞中MMP9的表達水平為(0.93±0.046)顯著高于未轉染組(0.51±0.040，P<0.05)組(圖5)，而且pCMV3-TEAD4質粒轉染組癌細胞中p-ERK的表達水平(0.57±0.056)顯著高于control組(0.34±0.021，P<0.05)，提示TEAD4高表達可上調子宮頸鱗癌細胞MMP9的表達水平(圖5)。

2.7 ERK活化對TEAD4上調MMP9表達的影響

利用ERK抑制劑U0126預處理癌細胞后再進行pCMV3-TEAD4質粒轉染，此聯合處理組的癌細胞中p-ERK的表達水平(0.277±0.060)顯著低于上述pCMV3-TEAD4質粒轉染組(P<0.01)，且此時聯合處理組癌細胞中MMP9的表達水平(0.46±0.046)也顯著低于pCMV3-TEAD4質粒轉染組(0.93±0.046，P<0.01)，而聯合處理組和pCMV3-TEAD4質粒轉染組之間的TEAD4的表達水平無顯著差異性(P>0.05)(圖5)。圖5結果顯示，高表達TEAD4能增強或提高癌細胞中p-ERK水平和MMP9的表達，且p-ERK能提高MMP9的表達，表明TEAD4能提高癌細胞中MMP9的表達是通過增加p-ERK水平實現的。

圖5 (A)MMP9和P-ERK在正常對照組癌細胞、TEAD4基因轉染組癌細胞和ERK抑制劑與TEAD4基因轉染的聯合處理組癌細胞中的表達，con，正常對照組(n=3)，TEAD4+，TEAD4基因轉染組(n=3)，U0126+TEAD4+,ERK抑制劑U0126與TEAD4基因轉染聯合處理組(n=3)、(B)MMP9和P-ERK在TEAD4基因轉染組癌細胞中的表達水平分別顯著高于對照組(P<0.05，P<0.05)，而MMP9和P-ERK在ERK抑制劑與TEAD4基因轉染的聯合處理組癌細胞中的表達水平分別顯著低于TEAD4基因轉染組(P<0.01，P<0.01)。

3 討論

作為TEAD轉錄因子家族蛋白之一，TEAD4分子結構N-末端含有能與基因啟動子區MACT模序結合的TEA(transcription enchance activation)結構域[5]，C-末端具有與轉錄共激活因子結合的轉錄激活結構域[2]。TEAD4的分子結構特征決定了它能與Hippo信號通路中的核心轉錄共激活子YAP(Yes-associated protein)相結合，形成轉錄激活復合物，從而介導下游靶基因的轉錄或偶聯其他信號通路的激活。Hippo在調控器官大小與組織穩態方面起著非常重要的作用[6]，Hippo信號通路失調會導致器官過度生長乃至腫瘤的發生，因此TEAD4對YAP轉錄功能的活化作用，決定了TEAD4具有類似原癌基因的功能。TEAD4-YAP作用可通過介導多種下游靶基因的表達，調節腫瘤的代謝[7]、生長[8]、浸潤[9]和轉移[10]等生物學行為，從而影響惡性腫瘤的進展。有研究報道，TEAD4的高表達與頭頸鱗癌[11]、膀胱癌[12]和膠質瘤[13]等多種腫瘤的不良預后有關。至于TEAD4與宮頸癌之間的關系，目前鮮有報道，然而卻有實驗證據表明，HPV16可誘導角質上皮細胞中TEAD4的高表達[1]。HPV16感染是宮頸鱗狀細胞癌的主要病因之一，HPV16能誘導TEAD4表達上調，這一實驗證據提示TEAD4很可能參與調節子宮頸鱗狀細胞癌發生發展的過程。鑒于前人已研究證實TEAD4對多種惡性腫瘤進展具有調節作用，出于興趣，本實驗通過組織學和細胞學兩個水平，研究TEAD4對宮頸鱗狀細胞癌的生長和浸潤能力的影響，并初步探討其可能的分子機制。

本實驗組織學結果顯示，子宮頸鱗狀細胞癌組織中TEAD4的表達水平顯著高于正常子宮頸上皮組織，提示子宮頸鱗狀細胞癌中存在TEAD4的高表達。進一步的臨床病理參數分析結果顯示，TEAD4的表達與子宮頸鱗狀細胞癌淋巴結轉移、脈管浸潤和宮旁浸潤有關，提示TEAD4可能調節子宮頸鱗狀細胞癌的生長、局部浸潤和轉移能力等不良生物學行為，從而促進子宮頸鱗癌的發生發展。Zhang[11]等研究證實，TEAD4高表達于頭頸鱗癌組織，且與腫瘤的淋巴結轉移等不良生物學行為有關，我們的組織學實驗結果與Zhang等的研究報道基本相符。為初步揭示TEAD4促進子宮頸鱗狀細胞癌侵襲進展的可能機制，我們檢測了與癌生長侵襲有關的最常見指標MMP9的表達情況，結果發現，子宮頸鱗狀細胞癌組織中MMP9的表達與TEAD4的表達呈正相關關系，這一結果暗示，TEAD4可能是通過介導MMP9的表達上調從而調節子宮頸鱗狀細胞癌的進展。

為進一步驗證上述組織學實驗結果，本課題通過基因轉染的手段改變子宮頸鱗癌SiHa細胞中TEAD4的表達水平，從而觀察高水平的TEAD4對子宮頸鱗癌細胞生長和侵襲能力的影響。CCK8實驗結果顯示，TEAD4基因轉染后的癌細胞增殖活力顯著高于未轉染組和陰性對照組，說明TEAD4能提高子宮頸鱗癌細胞的增殖能力。Transwell小室實驗結果顯示，與未轉染和陰性對照的癌細胞相比，TEAD4基因轉染后的癌細胞表現出顯著升高的侵襲能力，說明TEAD4能提高子宮頸鱗癌細胞的侵襲能力。為進一步探明TEAD4提高子宮頸鱗癌細胞增殖和侵襲能力是否與MMP9有關，本實驗通過Western blotting進一步檢測在上述條件下子宮頸鱗癌細胞中MMP9的蛋白水平，結果發現，在TEAD4基因轉染后的癌細胞中，MMP9的表達水平也高于未轉染組和陰性對照組。該結果說明，TEAD4能介導子宮頸鱗癌細胞MMP9的表達上調。MMP9是一個經典的調節因子，在不同組織起源的癌細胞中能通過不同的信號機制提高癌細胞生長和浸潤能力[14-16]，我們的實驗結果暗示，TEAD4可能通過上調MMP9的表達而促進子宮頸鱗癌細胞的增殖和侵襲能力。誠然，TEAD4能介導多種下游效應分子的表達，例如有研究報道，TEAD4-YAP能通過介導CTGF(結締組織生長因子)轉錄從而調節胃癌細胞的增長和浸潤能力[17]，且可通過介導Jagged1的表達上調而促進肝癌細胞的增殖能力[18]。除了MMP9之外，TEAD4是否還能通過介導其他的下游靶基因轉錄從而促進子宮頸鱗癌細胞的增殖和浸潤能力，尚須進一步研究。

為深入研究TEAD4調節子宮頸鱗癌增殖和浸潤能力的分子機制，本課題檢測了在不同的TEAD4表達水平條件下癌細胞中相關信號分子的活化水平情況。在TEAD4基因轉染后的癌細胞中，ERK的活化形式P-ERK的水平顯著高于未轉染組，說明TEAD4能活化子宮頸鱗癌細胞中ERK信號。為進一步明確TEAD4介導MMP9的表達上調是否與ERK信號的活化有關，本實驗利用ERK活化抑制劑U0126預處理子宮頸鱗癌細胞，然后再進行TEAD4基因轉染，結果驚奇的發現，與正常轉染組的癌細胞相比，在ERK活化受抑制的條件下，癌細胞中MMP9的表達水平顯著低于正常轉染組，這一結果說明TEAD4是通過激活子宮頸鱗癌細胞ERK信號這一途徑來上調下游靶基因MMP9的表達。Chang等研究證實[19]，TEAD4能通過活化ERK信號通路而促進肺腺癌的進展，我們的實驗結果與Chang的研究結果相符。作為經典的Hippo信號共激活子，TEAD4通常與YAP結合形成復合物介導下游靶基因的轉錄或者偶聯其他信號通路的活化，但最新有學者通過與YAP結合缺陷的突變體TEAD4Y429進行回補實驗證實，TEAD4能通過不依賴與YAP結合的方式調控結腸癌中Vimentin的表達，從而促進結腸癌EMT的發生[20]，這可能與TEAD4分子結構中的DNA結合域的功能有關。可見，TEAD4可通過YAP依賴和YAP非依賴的方式介導下游靶分子的活化或轉錄，那么在子宮頸鱗癌細胞中，TEAD4介導ERK信號的活化是否具有YAP依賴性，尚需要進一步研究證實。此外，本課題組織學研究發現，TEAD4表達于子宮頸鱗癌細胞的胞質和/或胞核，TEAD4促進子宮頸鱗癌生長浸潤能力是否與它在癌細胞中的表達定位有關，也值得我們深入研究。

綜上所述，本研究證實子宮頸鱗癌中存在TEAD4的高表達，TEAD4能提高子宮頸鱗癌的生長浸潤能力，其分子機制與TEAD4活化ERK信號從而上調癌細胞MMP9的表達有關。