牛磺酸通過調控AKT/GSK-3β通路抑制結直腸癌細胞侵襲轉移

陳春香，萬慧芳，李淑英，鐘小菊，萬福生,*

(1.南昌大學撫州醫學院生化與分子生物學教研室，江西 撫州 344000；2.南昌大學醫學實驗教學中心，江西 南昌 330031；3.南昌大學基礎醫學院生化與分子生物學教研室，江西 南昌 330006)

結直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是人類最常見的胃腸道惡性腫瘤之一，發病率和死亡率高,目前是世界范圍內癌癥相關死亡的第二大原因[1-2]。近年來由于飲食結構和生活方式的改變，我國CRC的發病率保持了快速上升的趨勢，是我國第三大常見惡性腫瘤[3-4]。研究[5-7]表明，CRC高發病率和高死亡率的主要原因是其具有難以控制的持續增殖和侵襲轉移能力，最終縮短了患者的生存時間。糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)是一種獨特的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，既是由NF-κb介導的癌細胞生存調節因子，又是多種細胞功能的復雜調節因子，涉及的疾病廣泛，包括神經退行性變、炎癥、纖維化、非胰島素依賴性糖尿病及癌癥等[8-11]。

最近的研究認為GSK-3β可作為多種不同類型癌癥的一個潛在的治療靶點[12]，在控制癌細胞侵襲和遷移方面發揮重要作用。GSK-3β是AKT/GSK-3β信號通路調控上皮-間質轉化(EMT)的關鍵分子，與結直腸癌的侵襲轉移密切相關[13-14]。牛磺酸(Taurine,Tau)是細胞內含量最豐富的游離氨基酸之一，具有較廣泛的生理功能及藥理作用。我們前期研究表明Tau能誘導結直腸癌細胞凋亡，抑制增殖[15]，但Tau對結直腸癌侵襲轉移及AKT/GSK-3β/β-Catenin通路的影響如何尚不清楚。本文旨在觀察GSK-3β在Tau抑制SW480和HT29細胞侵襲轉移中的作用，探討Tau抑制結直腸癌侵襲轉移的作用靶點及分子機制。

1 材料和方法

1.1 細胞系和細胞培養

人結腸癌細胞系SW480、HT29購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。SW480細胞常規培養于含10%胎牛血清的1640培養基上，HT29細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM完全培養液中，保存于37 ℃，5% CO2培養箱中。

1.2 主要試劑和材料

牛磺酸(Sigma公司)；胎牛血清、RPMI-1640培養基、胰蛋白酶、細胞裂解液及二甲亞風(DMSO)均購于Solarbio公司；抗AKT(cat.#40576)多抗購自SAB公司，p-AKT(cat.No.#3787)多抗購自中國上海細胞信息技術有限公司，PTEN單抗(cat.Ab32199),E-cadherin單抗(Cat.Ab1416)，N-cadherin單抗(Cat.Ab18203),Vimentin單抗(Cat.Ab92547)；MMP-2(cat.Ab6302),MMP-7(cat.Ab37150),MMP-9多抗(cat.Ab38898)，β-Catenin多抗(cat.Ab92547),GSK-3β單抗(cat.Ab32391),p-GSK-3β-Ser9(Cat.ab75814)多抗及β-actin多抗(cat.20536-1-AP)均購自Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔IgG購于北京中杉金橋生物技術有限公司。CCK8試劑(上海東仁化學科技有限公司)。康寧基底膜基質(356234)購自康寧公司(中國上海)。Transwell小室(8 μmoL)購自Corning公司，JetPRIME轉染試劑購自上海英捷生物有限公司。質粒p-EGFP-GSK-3β及空載體p-EGFP-N1購買于上海諾百生物科技有限公司。

1.3 Transwell分析細胞遷移和侵襲實驗

Transwell小室細胞遷移實驗：收集對數生長期的SW480和HT29細胞，實驗分為正常對照組(Control)、4個Tau組(40，80，160，200 mmoL)。將生長良好的細胞用不含血清的培養基處理12 h，然后用含0.25% EDTA的胰蛋白酶消化，在不含血清的上室中以1×105/孔的密度放置。Transwell裝置下腔填充600μl RPMI 1640或DMEM,DMEM中添加10%胎牛血清，含不同濃度的Tau。培養48 h后，用棉拭子從上孔取出無創細胞，4%多聚甲醛固定20 min,1%結晶紫烘干20 min，洗3次。小室干燥后在倒置顯微鏡下觀察并使用圖像采集系統選取上、中、下、左、右5個視野，于100倍光鏡下拍照，計數其平均穿膜細胞數。

細胞侵襲實驗：將Matrigel膠分別與不含血清的H-DMEM和RPMI-1640基礎培養基按1:8的比例混合均勻。將Matrigel膠和培養基混合好后，取該混合物60 μL鋪于已預冷的小室中，將小室置24孔板中，在37℃過夜凝固成膠狀。然后接種，接種于小室的細胞數變為2×105個/孔，其余步驟與Transwell小室遷移實驗相同，計算平均細胞數，即侵襲細胞數。實驗重復3次。

1.4 細胞轉染和Tau處理

收集對數生長期的SW480和HT29細胞，實驗分為以下5組：①正常對照組(Control)：細胞于37℃、5%CO2正常培養48 h；②Tau(80 mmol·L-1)：加入終濃度為80 mmol·L-1的Tau，正常培養；③空載體對照組(p-EGFP-N1)：轉染NC-shRNA后正常培養；④p-EGFP-GSK-3β轉染組：轉染p-EGFP-GSK-3β，6 h后換液，正常培養48 h；⑤p-EGFP-GSK-3β轉染+Tau(80 mmol·L-1)聯合處理組：轉染p-EGFP-GSK-3β，6 h后換液，加入終濃度為80 mmol·L-1的Tau，培養48 h。轉染過程按jetPRIME轉染試劑說明書進行，基本步驟如下：將2 μg DNA溶于200 μL的jetPRIME緩沖液中，漩渦震蕩混勻。往上述混合液中加入4 μL jetPRIME轉染試劑，漩渦混勻10 s，簡單地上下顛倒。室溫孵育10 min后，每孔加入200 μl的轉染復合物到含有完全培養基的細胞中，且分布均勻，并將其放回培養箱中培養48 h，然后進行其他實驗。實驗重復3次。

1.5 CRC細胞劃痕愈合實驗

收集對數生長期的SW480和HT29細胞，實驗分組與1.4細胞轉染和Tau處理相同。用Marker筆在6孔板的外底部橫著畫4條線，然后收集對數生長期的細胞接種于6孔板中，5×105個/孔，貼壁生長12 h后用10 μL移液器的槍頭在6孔板內底部垂直Marker筆的畫線而豎直劃痕4條；用2 mL PBS洗去懸浮細胞，加入2 mL/孔新鮮培養液并在光學顯微鏡下拍照(40倍)，以此時為0 h；接著按實驗分組，分別加入不同濃度Tau培養處理細胞12 h、24h，在固定時間點，同一條件下拍下劃痕照片并記錄細胞遷移情況。最后，用Image Pro Plus 6.0軟件統計平均值，計算細胞遷移率。細胞遷移率(%)=(0h劃痕距離-24h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。實驗重復3次。

1.6 Western blot檢測細胞中蛋白水平

收集經Tau處理48 h的細胞，在冰上用細胞裂解液進行裂解，12 000 r·min-1離心(4℃)10 min，取上清液。采用Pierce BCA ProteinAssayKit試劑盒檢測蛋白濃度。按20 μg蛋白上樣量將蛋白樣品與上樣緩沖液(5×)按4:1的體積比例混合，沸水中煮5 min，冷卻后上樣。經10%SDS-PAGE并半干電泳轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h后，分別加入PTEN、AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、E-cadherin、Vimentin、β-catenin及MMP2/7等抗體，并4 ℃孵育過夜。次日，在室溫下加入二抗孵育2h，ECL化學發光法顯色，X線膠片曝光成像，掃描儀掃描蛋白條帶。實驗重復3次。

1.7 統計處理

所有結果被描述為均數加減標準偏差(SD)。采用SPSS 19.0軟件進行雙尾配對t檢驗，以檢測各組間測量變量的顯著性差異，P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 Tau對人結直腸癌細胞侵襲和遷移的抑制作用

通過Transwell小室實驗檢測了SW480和HT29細胞的侵襲和遷移情況(見圖1)。結果顯示，對照組SW480細胞的侵襲能力明顯大于HT29細胞，Tau對SW480和HT29細胞侵襲和遷移的抑制作用均隨著藥物濃度的增加而增強(P<0.05)。經Tau處理48 h后SW480細胞的侵襲能力也明顯比HT29細胞強；

注：a為Tau作用48 h的細胞侵襲結果(n=3)，b為Tau作用48 h的細胞遷移結果(n=3)，c為細胞侵襲統計結果圖，d為細胞遷移統計結果圖。

2.2 Tau對人結直腸癌細胞PTEN/AKT/GSK-3β通路的影響

為了探討Tau抑制CRC細胞生長、侵襲和遷移的分子機制，我們觀測了Tau對SW480和HT29細胞中PTEN/AKT/GSK-3β通路相關蛋白表達變化(見圖2)。結果顯示，當Tau作用細胞48 h后，對CRC細胞中PTEN，AKT，p-AKT,GSK-3β及p-Gsk-3β蛋白水平有不同程度的影響，與對照組比較，Tau有一定的濃度依賴性上調SW480和HT29細胞中PTEN,GSK-3β及p-GSK-3β蛋白水平(P<0.05),下調AKT，p-AKT Ser473蛋白水平;在SW480細胞中Tau對GSK-3β，AKT和p-AKT Ser473的作用要大于HT29細胞，而對PTEN和p-GSK-3β的作用要小于HT29細胞。結果提示Tau可提高CRC細胞內PTEN、GSK-3β表達及p-GSK-3β水平，下調AKT，p-AKT Ser473蛋白水平。

注：A為Tau作用48h后SW480細胞結果(n=3)，B為Tau作用48hHT29細胞結果(n=3)；

2.3 質粒轉染效果

結果如圖3所示，SW480和HT29細胞經轉染48h后，p-EGFP-N1和p-EGFP-GSK-3β組細胞在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光，而Control組未見熒光，說明這兩組有熒光蛋白導入；NC-shRNA組也顯綠色熒光，說明有RNA干擾片段導入SW480和HT29細胞中。

注：圖左邊有綠色熒光蛋白是在熒光顯微鏡下的結果(顯綠色熒光)；右邊呈黃色的是普通光鏡下結果。

2.4 GSK-3β過表達對結直腸癌細胞侵襲和遷移的影響

為探討GSK-3β在Tau抑制CRC細胞侵襲和轉移中的作用，我們觀察了GSK-3β過表達在Tau在抑制SW480和HT29細胞侵襲和轉移中的影響。Transwell小室實驗結果(見圖4)顯示，與Control或p-EGFP-NC組比較，Tau組的細胞侵襲和遷移的數量呈顯著性減少(P<0.01)；與p-EGFP-NC組相比，p-EGFP-GSK-3β組的細胞侵襲和遷移數量有顯著性減少(P<0.01)；與p-EGFP-GSK-3β或Tau組比較，p-EGFP-GSK-3β+Tau組的侵襲和遷移細胞數量有顯著性降低(P<0.01)。劃痕愈合實驗結果(圖5)與Transwell小室實驗結果基本一致，細胞遷移的能力被GSK-3β顯著抑制，但pEGFP-GSK-3β組的劃痕愈合速度比Tau組慢；與pEGFP-GSK-3β組比較，pEGFP-GSK-3β+Tau組的愈合速度顯著降低(P<0.01)。結果提示GSK-3β能增強Tau對CRC細胞侵襲和遷移的抑制作用。

注：A為SW480細胞的結果，B為HT29細胞的結果；*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs p-EGFP-NC;&P<0.05,&&P<0.01 vs p-EGFP-GSK-3β or Tau 80 mmoL group.Tau的濃度是80 mmoL·L-1，作用時間48 h;n=3

注:A為SW480細胞劃痕愈合實驗結果(處理48 h)，B為HT29細胞劃痕愈合實驗結果(處理48 h)，C為SW480細胞統計結果圖，D為HT29細胞統計結果圖.*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs p-EGFP-NC;&P<0.05,&&P<0.01 vs p-EGFP-GSK-3β or Tau 80 mmoL group。

2.5 GSK-3β過表達對EMT、MMPs及AKT/GSK-3β/β-Catenin通路相關蛋白表達的影響

為探討GSK-3β對SW480細胞中EMT、MMPs及AKT/GSK-3β/β-Catenin通路相關蛋白表達的作用。我們的實驗結果(見圖6)發現，與p-EGFP-NC組比較，p-EGFP-GSK-3β組的E-Cadherin、GSK-3β蛋白表達有顯著升高(P<0.01)，而N-Cadherin,Vimentin,β-Catenin,MMP2,MMP7和AKT蛋白表達均有顯著降低(P<0.01或P<0.05)；與Tau組或p-EGFP-GSK-3β組比較，p-EGFP-GSK-3β+Tau組的E-Cadherin,GSK-3β蛋白表達有顯著升高(P<0.01)，而N-Cadherin、Vimentin、β-Catenin、MMP2、MMP7和AKT蛋白表達均有顯著降低(P<0.01)。結果表明GSK-3β蛋白能增強Tau抑制SW480細胞EMT過程，下調細胞內MMP2、MMP7及β-Catenin含量。

注：A為Western blotting結果，B，C和D為結果統計處理圖；*P<0.05,**P<0.01 vs control;##P<0.01

3 討論

牛磺酸(又名2-氨基乙磺酸)是一種不用于蛋白質合成的含硫氨基酸，在哺乳動物中被稱為半必需氨基酸，主要由肝臟和腎臟產生,是哺乳動物組織中含量最多的游離氨基酸[16]。牛磺酸具有許多基本的生物學作用，它存在于包括視網膜、大腦、心臟和胎盤等不同的器官，對心血管功能、骨骼肌、視網膜及中樞神經系統發育和功能至關重要[17-19]。在人體內各種器官和組織成分中起著重要的生理和病理作用，包括滲透壓調節、膜穩定、鈣水平的調節、能量代謝、基因表達、抗氧化、抗凋亡、抗炎及抗脂質活性等[20-22]。牛磺酸的抗氧化作用已被發現可以影響細胞增殖、炎癥和膠原蛋白沉積。近年來不斷有研究表明[23-26]Tau具有較強的抗腫瘤作用，主要表現為誘導癌細胞凋亡、自噬及對化療藥物的增效減毒作用等，但牛磺酸抗腫瘤作用的機制尚未弄清。據報道牛磺酸與順鉑聯合應用可下調基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)，抑制膠質瘤細胞侵襲轉移，也可抑制前列腺癌EMT過程[23]。本文實驗結果顯示，牛磺酸不僅對結直腸癌侵襲遷移有抑制作用(圖1)，且可提高CRC細胞內PTEN、GSK-3β表達及p-GSK-3β水平，下調AKT，p-AKT Ser473蛋白水平(圖2)。結果表明牛磺酸可下調p-AKT Ser473蛋白水平，提高CRC細胞內GSK-3β，而GSK-3β能增強牛磺酸對CRC細胞侵襲遷移的抑制作用(見圖4和5)。最近有研究[27]結果顯示，在使用偶氮氧基甲烷(AOM)/硫酸鈉(DSS)誘導的結腸癌小鼠模型上，牛磺酸能顯著提高凋亡標記物、cleaved caspase-9和腫瘤抑制蛋白PTEN的水平，證明牛磺酸在體內有顯著降低致癌性的作用。類似研究[28-29]結果是使用二甲基苯[a]蒽(DMBA)誘導的大鼠乳腺癌發生作為乳腺癌模型。給藥牛磺酸可顯著降低DMBA誘導的大鼠乳腺癌發生率(從80%降至40%)。但牛磺酸在體內是否有抑制癌細胞侵襲遷移的作用，目前罕見有關研究報道。

另有研究結果[30-31]表明，牛磺酸還可以作為一種化學保護劑對抗金屬離子Cr(VI)誘導的氧化損傷，并可能被用于緩解這種過渡金屬離子的毒性作用；牛磺酸也可以降低赭曲霉素A(OTA)的毒性作用，其機制是牛磺酸通過降低LC3-II蛋白表達和GFP-LC3點的熒光強度來降低OTA誘導的自噬，減少細胞凋亡，維持細胞穩態。簡而言之，牛磺酸可緩解OTA誘導的凋亡，抑制pk15細胞自噬，這些作用也與牛磺酸的抗腫瘤作用有關。

GSK-3β屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,最初被描述為一種參與糖原代謝的關鍵酶。近年來研究發現GSK-3β是一種多功能蛋白，是磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)下游作用的主要介質，協調多種細胞內信號，控制細胞對外源性刺激的反應，對細胞內信號通路至關重要，參與多種細胞活動[8]，如調節心肌細胞生長[9]、細胞遷移、葡萄糖代謝調節、炎癥反應及細胞凋亡[10]等，GSK-3β是AKT信號傳導途徑的重要下游靶標，AKT通過Ser473處被磷酸化激活和使GSK-3β失活來促進細胞侵襲轉移。PTEN則是AKT的上游信號分子，對AKT起著負調控作用。GSK-3β參與β-catenin的降解，是調節細胞內β-catenin含量、分布和功能的重要因子[32]；胞內β-catenin水平的降低可能是GSK-3β-介導的在β-catenin Ser 33/37和Thr 41上的磷酸化所致，β-catenin的磷酸化形式由蛋白酶體降解的β-TrCP泛素E3連接酶泛素化。GSK-3β的失活會導致胞內β-catenin的累積，促進腫瘤侵襲轉移[33]。本文實驗結果表明，牛磺酸通過調控AKT/GSK-3β通路，抑制CRC細胞EMT過程和下調MMP2、MMP7及β-Catenin表達，最終抑制CRC細胞侵襲遷移。