歐李內生促生菌分離、鑒定及促生、耐鹽堿特性

白 潔，姚 拓，王占軍，雷 楊，楊曉蕾，張 蔚

(1.甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；2.寧夏農林科學院荒漠化治理研究所，寧夏 銀川 750000)

歐李(Cerasushumilis)是一種落葉叢生小灌木，主要生長于我國北方的草原、森林、沙漠邊緣以及一些丘陵地區[1]。其自身表現出的抗逆性是其在不良環境下穩定生長的重要原因之一，如耐寒、耐旱、耐鹽堿等特性。因此，可作為防風固沙、抵抗水土流失、改善生態環境的先鋒樹種[2]。此外，由于歐李葉量大，莖細且質地柔軟，便于牛羊的啃食，在畜牧業中被視為一種良好的飼料。前人研究發現，歐李莖葉中不僅含有糖和蛋白質等牛羊生長所需的一般營養，而且其鈣元素含量較高，是牛羊骨骼發育的重要補鈣來源[3]。因此，該灌木不管是在生態建設還是作為飼料生產方面均具有較大發展前景。

歐李所表現出的較強的生態價值，主要源于其龐大且呈網狀分布的根系能夠在瘠薄的土壤中吸收水分和營養物質，供給植物生長[4]。而定殖于植物根系內的內生促生菌(Plant growth-promoting endo phytes,PGPE)所分泌的多種生理活性物質，如生長素、細胞分裂素等，會刺激植物新陳代謝，促進植物根系生長[5]。此外，還可通過固氮、解磷(將有機磷水解轉化為無機磷酸鹽)[6]、溶磷(將不溶性無機磷轉化為可溶性磷酸鹽)[7]等方式促進植物生長[8-9]。謝安強等[10]從桉樹體內分離篩選到的內生細菌，可提高桉樹的抗逆性與生長量。張現勇等[11]從油菜中分離的菌株yc8，顯著提高了油菜幼苗的鮮重和株高。然而，目前關于從生長良好的歐李根系中分離多功能PGPE的研究還未見報道。

鑒于此，本研究從歐李根系中分離獲得PGPE菌株，并對其固氮、解磷、溶磷、合成植物生長素IAA和耐鹽堿特性進行初步研究，利用分子生物學方法對其進行分類鑒定，以期為后續歐李微生物接種劑(菌肥)研制提供優良菌株，并豐富我國微生物菌種資源庫。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源及處理 歐李樣品來源于寧夏回族自治區銀川市永寧縣，位于寧夏中部，屬于典型的溫帶大陸性氣候，土壤質地為砂土。采集歐李植物根系，裝入無菌自封袋中，標注植物名稱及采集日期，放置于冰盒中，運回實驗室冰箱中4℃保存，進行菌株分離。

1.1.2 供試培養基 LB(luria bertani,LB)固體培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0[12]。

King氏液體培養基：蛋白胨20 g，K2HPO41.15 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，丙三醇15 mL，L-色氨酸0.1 g[13]。

無機磷(National botanical research institute’s phosphate,NBRIP)液體培養基：葡萄糖10 g，Ca3(PO4)25g，MgCl2·6H2O 5g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.2 g，(NH4)2SO40.1 g，總體積1 000 mL，pH 6.8～7.0[14]。

蒙金娜有機磷培養基：MnSO4·4H2O 0.03 g，Fe SO4·7H2O 0.03 g，CaCO35.0 g，葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，卵磷脂0.2 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，酵母膏0.4 g，總體積1 000 mL，pH 7.0～7.5[15]。

NFM (Nitrogen free medium,NFM)培養基：CaCl2·2H2O 0.02 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO40.5 g，NaMoO4·2H2O 0.002 g，NaCl 0.1 g，KOH 5 g，蘋果酸5 g，生物素10 μg，0.5%溴百里酚藍5 mL，瓊脂20 g(固體培養基)或2 g(半固體培養基)，總體積1 000 mL，pH 7.0[16]。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離與純化 采用組織勻漿法[17]，將歐李根系置于自來水下沖洗干凈，用8%次氯酸鈉浸泡3 min，75%乙醇表面消毒30 s，使用無菌蒸餾水清洗3次，去除表面的滅菌劑。滅菌的植物根系用滅菌刀片切成約為1 g的小塊，用高壓滅菌的研磨棒和研磨缽在9 mL的無菌水中研磨至勻漿。將0.1 mL的組織懸浮液涂布于LB平板上。接種平板置于28℃恒溫培養箱培養3～5 d。根據菌落形態與顏色的不同，使用接種環挑取單菌落進行四區劃線，反復純化至單一菌落。分離純化后的菌株懸浮于20%甘油，保存至-80℃冰箱中備用。

1.2.2 內生促生菌促生特性測定 將分離出的7株菌分別進行促生特性測定，固氮酶活性測定：乙炔還原法[18]；解磷、溶磷特性測定：鉬銻抗比色法[19]；合成植物生長素IAA特性測定：Salkowski法[20]。

1.2.3 內生促生菌耐鹽堿特性測定 在LB液體培養基pH 7.0的條件下，將各培養基中的NaCl濃度分別提高5%，培養基中NaCl濃度分別為0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%；在LB液體培養基中NaCl濃度為10 g·L-1的條件下，將培養基中pH值分別提高一個單位，各培養基中pH值分別為7、8、9、10、11、12、13。將分離菌株分別接種至具有不同鹽堿濃度的LB液體培養基中，每株菌3次重復，以不接菌的液體培養基作為空白對照，在30℃，180 r·min-1條件下震蕩培養2 d后，測定培養基在波長600 nm處的吸光度值(OD600 nm)并制作曲線。

1.2.4 分離菌株鑒定 將上述分離出的7株菌在LB平板上活化后，提取細菌總DNA，使用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行16S rRNA基因序列擴增。50 μL反應體系：2×Taq PCR Master Mix 25 μL、DNA模板2 μL、引物各1 μL、ddH2O 21 μL。PCR擴增參數設置：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，重復循環32次；72℃總延伸5 min，將PCR產物進行1%凝膠瓊脂糖電泳檢測，并于-20℃保存待用。16S rRNA基因序列測定由北京奧科鼎盛科技有限公司完成。將測序結果在Ezbiocloud數據庫中比對，并利用MEGA 7.0軟件中CLUSTAL W程序進行同源序列比對，使用鄰近法構建系統發育樹。

1.3 數據分析

采用SPSS 20.0軟件對試驗數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，顯著性水平為P<0.05，并用Origin Lab Origin Pro 8.5和MEGA 7.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 歐李內生促生菌分離菌株促生特性分析

由表1可看出，供試7株內生菌的固氮酶活性分布在50.64～127.40 nmol·h-1·mL-1，以菌株Y3固氮酶活性最高，為127.40 nmol·h-1·mL-1。對分離菌株解磷、溶磷特性的測定中，菌株解有機磷量在1.28～358.90 μg·mL-1，菌株N23和N22均有較強的解磷能力，解磷量分別為358.90 μg·mL-1和342.20 μg·mL-1，其他5株菌解磷量均小于150 μg·mL-1；分離菌株溶無機磷量在6.29～143.61 μg·mL-1，菌株Y2和Y3相較于其他5株菌具有較強溶磷能力,溶磷量均大于100 μg·mL-1。通過對分離菌株解磷、溶磷能力的定量測定分析發現，不同菌株具有不同的解磷、溶磷特性，其中3株分離菌株出現解有機磷量大于溶無機磷量。此外，在合成植物生長素IAA特性測定中，菌株合成IAA量在14.24～70.48 μg·mL-1，以菌株N22合成IAA量最高。

表1 分離菌株促生特性測定結果Table 1 Determination result of the growth-promoting characteristics of isolated strains

2.2 歐李內生促生菌分離菌株耐鹽堿特性分析

分離菌株對不同NaCl濃度的耐受性測定中，菌株Y1、Y2、N22、N23、N1能耐受NaCl最高濃度為10%。菌株Y4、Y3能耐受NaCl最高濃度為30%，說明該兩株菌株具有較廣泛的耐鹽能力。此外菌株Y3、Y4、N1的最適NaCl濃度為5%(圖1)。在10 g·L-1NaCl濃度下，菌株N1、N22堿性(pH值)的耐受范圍為7～10，菌株N23堿性(pH值)的耐受范圍為7～11，其中菌株N1、N22最適生長的堿性(pH值)耐受為8。此外，菌株Y1、Y2、Y3、Y4堿性(pH值)的耐受范圍為7～13，其中菌株Y1、Y2、Y4最適生長的堿性(pH值)耐受為8，而菌株Y3的最適生長的堿性(pH值)耐受為9，該結果表明分離出的7株菌在10 g·L-1NaCl濃度下均具有一定的耐堿能力(圖2)。

圖1 分離菌株對不同NaCl濃度耐受性Fig.1 Tolerance of isolated strains to different NaCl concentrations

圖2 分離菌株對不同堿性程度(pH值)的耐受性Fig.2 Tolerance of isolated strains to different alkaline (pH value)

2.3 歐李內生促生菌分離菌株鑒定

通過對7株分離菌株進行革蘭氏染色，發現Y3、Y4、N1菌株為革蘭氏陽性菌(G+)，其余菌株為革蘭氏陰性菌(G-)。測序結果在Ezbiocloud數據庫進行相似性比對(表2)，并使用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹(圖3)。結果顯示，菌株Y4、Y3確定為芽胞桿菌屬Bacillusp.，菌株N22、N23為猴假單胞菌Pseudomonassimiae，菌株Y1、Y2為無色桿菌Achromobactermarplatensis，N1為耐寒短桿菌Brevibacteriumfrigoritolerans。

圖3 基于分離菌株16S rRNA基因序列構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of the isolated strains

表2 分離菌株16S rRNA基因相似性比對Table 2 Comparison of 16S rRNA gene similarity of isolated strains

3 討論與結論

PGPE是一類具有較強定殖和靶向功能的微生物，相較于土壤和根際微生物，接種后更易進入植物體內，并發揮相關功能[21]。本研究從歐李根系中分離獲得7株內生細菌，包含4個屬，分別為芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、短桿菌屬和無色桿菌屬，其中假單胞菌屬菌株表現出較強的解磷特性。前人研究發現，假單胞菌在植物根系中是一類較為活躍的解磷微生物[22-24]。本試驗中，編號為N23菌株被初步鑒定為Pseudomonassimiae，其解有機磷量最高，為358.90 μg·mL-1，并且該菌株同時兼具固氮、合成植物生長素IAA、耐鹽堿等特性，這在已報道的假單胞菌株中是較為少見的。另外，盡管有2株細菌同屬于P.simiae，且這兩株菌的16S rRNA基因序列與P.simiaeOLi的相似度均達到99.85%，但它們的促生潛力卻具有顯著差異,說明同一種屬的內生細菌的促生潛力存在菌株間的差異，引起菌株間促生潛力的差異與細菌自身代謝能力、外界環境中碳源、氮源及微量元素的種類等諸多因素有關[25]，還需進一步研究。

歐李主要分布于我國北方地區，多山地丘陵或沙漠草原，土壤養分貧瘠，而固氮微生物在為植物提供氮源方面發揮很大作用。本研究測定分離菌株固氮酶活性在50.64～127.40 nmol·h-1·mL-1，芽胞桿菌Y3固氮酶活性最高，為127.40 nmol·h-1·mL-1，與前人報道的芽胞桿菌固氮活性結果一致[26]。吲哚乙酸(IAA)是一種極為重要的生理活性物質，由包含PGPE在內的多種微生物產生[27-28]。本試驗中分離的菌株均能夠分泌植物生長素IAA，如果給宿主植物接種分泌IAA菌株，可擴大根表面積，利于根系從土壤中吸收水分和礦物質[29]，對提高歐李的產量和品質具有積極作用。

在PGPE菌株分離過程中，不僅要分離具有促生作用的菌株，還應篩選具有耐鹽堿特性菌株，這對生產實踐具有重要作用[30]。全球大約20%的耕地和50%的灌區受到鹽堿化的影響[31]，內生菌能夠從植物的多個方面來改善植物組織滲透平衡和離子毒害，從而緩解鹽堿脅迫對植物的傷害，有利于植物在鹽堿地生長[32]。根據Larsen等[33]和Vreeland[34]提出的微生物對鹽堿敏感程度的分類系統，本試驗分離菌株Y3、Y4能夠在NaCl濃度為30%、pH值為13的條件下正常生長，屬于極端嗜鹽嗜堿微生物。推測該株菌與歐李能夠生長在鹽堿環境中有一定關系,可協助植物適應環境，并在鹽堿地生物修復中具有很好的應用潛力。

本研究分離的7株內生菌均具有一定的促生功能(固氮、解磷、溶磷、合成植物生長素IAA)和耐鹽堿特性，解有機磷量最高為342.20 μg·mL-1，溶無機磷量最高為143.61 μg·mL-1，固氮酶活性最高為125.9 nmol·h-1·mL-1；合成植物生長素IAA量最高為70.48 μg·mL-1，耐鹽堿特性較強的菌株可在NaCl濃度為30%，pH值為13的條件下正常生長。7株優良PGPE被鑒定為：Y3、Y4為Bacillussp.，N23、N22為Pseudomonassimiae，N1為Brevibacteriumfrigoritolerans，Y1、Y2為Achromobactermarplatensis。各菌株之間促生潛力存在顯著差異，可為后續復合微生物菌劑(菌肥)研發提供依據。