黑色素瘤中SIRT7和自噬相關蛋白的表達相關性及其對放療抵抗的影響

尤 佳，孟冰瑤，梁梟婷，華婉瑜，方 春，陳 潔，周 良，周 蕊

黑色素瘤(melanoma)是來源于黑色素細胞的惡性腫瘤，具有高侵襲性和轉移性，是皮膚癌死亡的主要原因[1-2]。放療是一種重要的腫瘤治療方式，可通過高劑量的紅外能量誘導DNA損傷、脂質和蛋白質分解，促進癌細胞死亡。然而，由于黑色素瘤本身有較強的抗輻射性，目前放療僅用于轉移性黑色素瘤和某些頭頸部黑色素瘤的輔助治療[3]。因此，明確黑色素瘤放療抵抗的機制，將為黑色素瘤的臨床治療提供有力的治療靶點和方案。

Sirtuin家族是一組高度保守的脫乙酰基酶，人類共有7個Sirtuin成員(SIRT1～SIRT7)，可與p53、FOXO、PGC-1a、Ku70等蛋白相互作用，調節應激反應、代謝、衰老、凋亡等重要病理、生理過程，并參與DNA損傷和修復[4]。SIRT7可以通過將蛋白脫乙酰化調節細胞和表觀遺傳穩態，抑制細胞凋亡[5-8]。然而，SIRT7在調節黑色素瘤放療抵抗中的作用并不清楚。本實驗通過檢測黑色素瘤中SIRT7和自噬相關蛋白的表達，探討其對放療抵抗的影響，為黑色素瘤治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞與動物來源人黑色素瘤A375細胞，購自廣州Cellcook生物公司。雄性裸鼠(BALB/C-nu/nu)，4～5周齡，體重10～15 g，購自南方醫科大學動物中心，用于構建體外移植瘤動物模型。

1.2 彗星電泳實驗將0.8%瓊脂糖凝膠置于載玻片上形成下膠，置于4 ℃過夜；按照同樣的方法配制0.9%低熔點的瓊脂糖膠作為上膠；將消化下來的細胞與熔化后冷卻至37 ℃的上膠混合，將細胞懸液和凝膠混合液滴在下膠上，4 ℃靜置4 h；將鋪好凝膠的玻片在20 V、300 mA的條件下避光電泳30 min；電泳結束后將玻片浸泡在中和液中充分中和；加入含EB的碘化丙錠(propidium iodide, PI)染料染色10 min，在熒光顯微鏡下觀察拍照，并用Image J圖像分析軟件進行分析。

1.3 RNA測序及分析將不同處理的黑色素瘤細胞樣本送至廣州瑞寶生物公司進行轉錄組學測序。使用Tophat2將RNA-Seq數據比對到人類基因組上(http://ccb.jhu.edu/software/tophat)；將HTSeq(http://www-huber.embl.de/HTSeq)應用于比對的數據集，明確具有顯著差異表達的基因。使用DAVID 6.8更新差異表達基因的GO分析和KEGG分析(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)。RNA序列數據已上傳GEO數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)。

1.4 Western blot提取細胞總蛋白并用Bradford法檢測蛋白濃度；配制聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離蛋白質；將分離膠上的蛋白轉至PVDF膜，加入3%BSA封閉液室溫封閉1.5 h；按照1 ∶5 000的比例加入TBST稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜；按1 ∶5 000的比例加入TBST稀釋的二抗，37 ℃孵育1.5 h；將PVDF膜條帶正面朝上，平鋪在X光片板上，用顯色液均勻覆蓋PVDF膜條帶后，放入顯影儀中進行曝光，并拍照保留結果。

1.5 異體移植瘤模型建立取體重無統計學差異的小鼠，將各處理的黑色素瘤細胞皮下注入小鼠的左右背部；用游標卡尺測量并記錄腫瘤體積，用公式計算腫瘤體積：V=ab2/2，其中a為腫瘤最長徑，b為垂直方向最大橫徑；當腫瘤體積達到1 500 mm3時，頸椎脫臼法處死小鼠，并取出皮下瘤。

1.6 免疫組化取石蠟切片，置于60～65 ℃恒溫烤箱中30 min烤片；將石蠟組織切片置于二甲苯(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)各10 min，再依次經100%、95%、80%、75%乙醇各3 min，使切片脫蠟至水；在高壓鍋內加入PBS(pH 6.0)，煮沸后加熱3 min對抗原進行高壓熱修復；切片用3%H2O2避光處理15 min后，在玻片上滴加一抗，4 ℃過夜；滴加鼠或兔二抗，室溫孵育40～60 min；每張切片滴加100 μL顯色液，室溫孵育3～5 min，鏡下觀察到明顯棕黃色時用PBS終止反應；將切片進行HE染色，按照蘇木精3 min，流水沖洗5 mim，鹽酸乙醇分化3 s，流水沖洗20 min，梯度乙醇脫水至二甲苯各5 min，切片晾干后封固。免疫組化結果判讀：按照染色深淺，將腫瘤細胞染色強度分為四級，分別是陰性(-)、弱陽性(+)、中等陽性()和強陽性()，以中陽性和強陽性為過表達或高表達。

1.7 統計學分析采用SPSS 17.0或Office Excel軟件進行統計學分析并繪制圖表。對獨立樣本的統計檢驗，采用非配對t檢驗或單因素方差分析檢驗；所有統計檢驗均采用雙尾檢驗和方差齊性檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SIRT抑制劑對黑色素瘤細胞電離輻射(ionizing radiation, IR)敏感性的影響彗星實驗結果顯示：黑色素瘤A357細胞的DNA損傷對IR呈現出劑量依賴性。隨著輻射強度的增強，慧尾DNA占比增加(P<0.001)，提示隨輻劑量增加，細胞DNA損傷越嚴重(圖1A)；由于8.0 Gy IR對黑色素瘤細胞DNA損傷最明顯，所以后續實驗采用8.0 Gy為IR處理劑量。SIRT抑制劑處理下，黑色素瘤細胞對IR的敏感性增加，表現為彗尾DNA占比顯著增加(P<0.001，圖1B)。

圖1 彗星電泳實驗檢測黑色素瘤細胞DNA損傷：A.彗星電泳分析IR對黑色素瘤細胞DNA損傷的劑量效應，柱狀圖顯示黑色素瘤細胞DNA損傷的定量分析；B.彗星電泳分析SIRT抑制劑對黑色素瘤細胞IR敏感性的影響，柱狀圖顯示黑色素瘤細胞DNA損傷的定量分析；**P<0.01,***P<0.001

2.2 干擾SIRT7對黑色素瘤細胞IR敏感性的影響qRT-PCR和Western bolt結果顯示：與對照組(siNC)相比，siRNA干擾片段siSIRT7_01(AGCCATTTGTCCTTGAGGAA)和siSIRT7_02(GAACGGAACTCGGGTTATT)轉染人黑色素瘤細胞A375后，在IR處理和非處理(MOCK)條件下，SIRT7蛋白和mRNA表達水平均明顯減低(P<0.001，圖2A、B)。彗星實驗檢測顯示：隨著輻射強度的增加，彗尾DNA占比增加(P<0.001)，提示細胞的DNA斷裂點增多，損傷越嚴重(圖2C)。

2.3 干擾SIRT7后轉錄組測序分析對干擾SIRT7后顯著上調的基因進行GO富集分析后發現，被富集的GO中排名最靠前的包括：ATF6介導的未折疊蛋白反應、內質網伴侶復合物、錯誤折疊蛋白結合、內質網應激反應、內質網腔、PERK介導的未折疊蛋白反應、Atg8連接酶活性和巨自噬等(P<0.05，表1)。京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路分析表明，包括內質網中的蛋白質加工和自噬調節在內的分子途徑受到顯著影響(P<0.05，表1)。

圖2 干擾SIRT7對黑色素瘤IR敏感性的影響：A.qRT-PCR檢測SIRT7干擾片段效率，**P<0.01，***P<0.001；B.Western blot檢測SIRT7干擾片段效率；C.彗星電泳分析干擾SIRT7對黑色素瘤細胞IR敏感性的影響，柱狀圖顯示黑色素瘤細胞DNA損傷的定量分析

表1 干擾SIRT7后RNAseq結果的GO和KEGG通路分析

2.4 干擾SIRT7后內質網應激及自噬相關蛋白的表達在IR處理和非處理(MOCK)條件下，分別使用兩個干擾片段干擾SIRT7，用Western blot法檢測了內質網應激和自噬相關蛋白的表達。結果顯示：干擾SIRT7后，與siNC相比，內質網應激相關蛋白XBP1和GRP78，自噬相關基因ATG3、ATG12及自噬標志物LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均顯著上調(圖3)。

圖3 干擾SIRT7對內質網應激和自噬相關蛋白表達的影響

2.5 自噬抑制劑對SIRT7介導的黑色素瘤細胞自噬性死亡的影響采用Sytox Green染色黑色素瘤細胞，以識別和計算死亡細胞。在非IR治療條件下，干擾SIRT7增加了死亡細胞數量，而自噬抑制劑3-MA的治療降低了細胞凋亡率(P<0.05，圖4)。IR治療顯著提高了黑色素瘤細胞的凋亡率，而干擾SIRT7則顯著增強這一趨勢。然而，3-MA可以在較大程度上緩解干擾SIRT7誘導的細胞死亡(P<0.05，圖4)。因此，SIRT7缺失促進了黑色素瘤細胞的自噬性細胞死亡。

2.6 SIRT7與內質網應激和自噬相關蛋白表達的相關性免疫組化和Western blot結果顯示：與siNC相比，干擾SIRT7后，MOCK組和IR處理組移植瘤中SIRT7表達降低。免疫組化染色顯示：分別在MOCK和IR處理下敲除SIRT7，與siNC組相比，siSIRT7組XBP1、GRP78、ATG3、ATG12和LC3B表達均顯著上調(圖5A)。其中，siNC組SIRT7為()，XBP1、GRP78、ATG3、ATG12和LC3B均(-)；siSIRT7組SIRT7為(+)或()，XBP1、GRP78、ATG3、ATG12和LC3B為()。Western blot結果也證實：干擾SIRT7后，XBP1、ATG12和LC3B表達顯著上調(圖5B)。以上結果提示，SIRT7可能通過負性調節內質網應激和自噬基因相關基因的表達，保護黑色素瘤細胞，降低其放療敏感性。

3 討論

放療是腫瘤重要的臨床治療方法，但黑色素瘤富含防輻射物質黑色素，是放療抵抗較嚴重的人類腫瘤之一[9]。氧化應激、DNA復制、IR、紫外線輻射以及各種基因和毒素等內外壓力，可增加人體細胞基因組的不穩定以及DNA損傷，最終導致衰老和腫瘤[10]。Sirtuins在調節應激反應等多種生物過程中發揮關鍵作用[11]。本組著重分析了Sirtuin家族成員SIRT7，明確其在黑色素瘤中的生物學功能和黑色素瘤細胞放療抵抗中的作用與機制。SIRT7不僅參與基因組穩定性，DNA修復和線粒體內穩態，還能調節癌基因表達和核糖體發生等[12]。SIRT7能直接與DNA損傷位點結合，并招募下游因子DNA損傷進行修復，以維持基因組穩定性，是復雜的DNA損傷反應系統的重要組成部分[13]。SIRT7還在胃癌和乳腺癌等多種腫瘤中高表達，發揮促進細胞存活并抑制細胞凋亡的作用[6,14]。然而，自噬介導的SIRT7對腫瘤細胞的調控作用較少被探討。在前列腺癌中，SIRT7通過促進雄激素受體信號通路增強雄激素誘導的自噬[15]。在膠質瘤中，長鏈非編碼RNA MEG3通過調控SIRT7和PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導自噬[16]。盡管已有上述研究，但SIRT7在黑色素瘤中的作用尚不清晰。

本組證實SIRT7缺失導致DNA損傷增加。SIRT7可直接參與DNA損傷修復，而其在癌基因表達、線粒體內穩態、核糖體生物發生和內質網應激中也發揮重要作用[17-18]。內質網是一個巨大的膜網絡，是膜蛋白和分泌蛋白重要的組裝車間[19]。缺氧、氧化損傷、葡萄糖剝奪和輻射等內外刺激不僅損害內質網的蛋白質折疊能力，還可以誘導以EIF2α磷酸化為特征的內質網應激和接下來的未折疊蛋白反應[20]。未折疊蛋白反應信號能夠上調伴侶基因表達，并誘導未折疊或錯誤折疊蛋白質的內質網相關降解，減少內質網的負擔。然而，如果內質網應激程度超過“從生存到死亡”的閾值，就會通過誘導相關轉錄因子的表達來激活各種形式的細胞死亡[21]。自噬導致的細胞死亡稱為自噬性細胞死亡，其主要特征是細胞質中出現大量的自噬體和自噬溶酶體，最終細胞被自身的溶酶體消化降解[22]。

圖4 自噬抑制劑3-MA對SIRT7介導的細胞死亡的影響：A.Sytox Green染色顯示死亡細胞；B.柱狀圖顯示凋亡細胞數，*P<0.05

AMOCKIRsiNCsiSIRT7siNCsiSIRT7SIRT7GRP78XBP1ATG3ATG12LC3BB

圖5 在體內干擾SIRT7對內質網應激和自噬的影響：A.免疫組化染色檢測異種移植瘤中SIRT7以及內質網應激和自噬相關蛋白的表達；B.Western blot檢測干擾SIRT7后，SIRT7以及內質網應激和自噬相關蛋白表達

SIRT7與內質網應激之間的關系鮮有報道。在慢性肝病中內質網應激可以誘導SIRT7表達，并與Myc相互作用富集在核糖體基因的啟動子處，通過沉默其表達緩解內質網應激[23]。此時，SIRT7表達是由內質網應激誘導的。本組發現SIRT7缺失可誘導內質網應激的典型標志物XBP1和GRP78的表達，它們作為伴侶來糾正蛋白質折疊，為支持SIRT7作為黑色素瘤細胞內穩態的守護者提供新的證據。SIRT7敲低后轉錄組測序生物信息學分析提示，SIRT7在調節內質網應激介導的自噬中發揮作用。本組通過細胞學實驗證實自噬基因ATG3和ATG12受SIRT7調控。ATG3作為E2樣結合酶介導LC3脂質化，而ATG12是E3連接酶復合物之一，促進基礎性自噬。此外，ATG3還可以與ATG12結合，形成復合物，連接晚期內溶酶體運輸[24]。SIRT7缺失可激活的自噬增加錯誤折疊蛋白結合細胞死亡，屬于自噬性細胞死亡。

綜上，SIRT7可以負性調節內質網應激介導的細胞死亡，以增強黑色素瘤細胞的生存能力。本實驗顯示SIRT7在維持內質網穩態中發揮關鍵作用，內質網穩態有望成為放療或其他應激誘導療法中黑色素瘤治療的新靶點。