二代測序技術(shù)檢測臨床FFPE樣本文庫制備中的問題與對策

時(shí)姍姍，張智弘

二代測序(next generation sequencing, NGS)是繼Sanger測序之后的一項(xiàng)革命性進(jìn)步，能夠同時(shí)對上百萬甚至數(shù)十億個(gè)DNA片段進(jìn)行分析。目前NGS已廣泛應(yīng)用于基因突變的臨床檢測，有助于腫瘤患者找到有用的治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)真正意義上的“精準(zhǔn)醫(yī)療”[1]。NGS分為實(shí)驗(yàn)操作和生物信息分析，包括眾多實(shí)驗(yàn)處理和分析環(huán)節(jié)。病理科開展NGS檢測主要采用FFPE樣本。FFPE樣本處理過程中無法避免會(huì)對DNA造成損傷，這增加了NGS技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中的難度。本文總結(jié)了FFPE樣本NGS實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)的常見問題，分析原因并給出相應(yīng)的解決方案，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 防止樣本污染

防止樣本污染是NGS操作中最基本的問題[2]。(1)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物：PCR經(jīng)過數(shù)個(gè)循環(huán)后，產(chǎn)生數(shù)十億個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物。空氣與液體面摩擦?xí)r，會(huì)形成氣溶膠。NGS檢測操作部分包括眾多實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，需要多次開蓋、換液，每一步都存在污染的風(fēng)險(xiǎn)。(2)試劑：反應(yīng)試劑配制過程中，加樣槍、容器、雙蒸水等都存在污染的可能性。(3)標(biāo)本間交叉污染：由于密封不嚴(yán)造成標(biāo)本模板核酸外溢；或在提取過程中核酸模板隨氣溶膠或形成氣溶膠擴(kuò)散，從而導(dǎo)致標(biāo)本間污染[3]。

針對上述問題，可采取以下方法：(1)NGS檢測時(shí)，嚴(yán)格劃分實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)域，將PCR前后的步驟在空間上分開。針對低濃度游離DNA樣本，為避免高濃度組織樣本造成的交叉污染，需設(shè)置cfDNA專用的標(biāo)本制備區(qū)和相應(yīng)的擴(kuò)增區(qū)域。(2)使用濾芯槍頭，以防止移液過程中因加樣槍造成的二次污染。(3)操作時(shí)只開單個(gè)樣本，結(jié)束后立即關(guān)蓋。嚴(yán)禁多樣本同時(shí)開蓋(圖1A)。(4)開蓋前，反應(yīng)液離心，避免劇烈搖動(dòng)反應(yīng)管，以免因操作時(shí)飛濺形成氣溶膠。(5)注意槍頭盒、垃圾桶等擺放位置，并留意加樣槍行駛的路徑(圖1B)。(6)所需試劑均應(yīng)在生物安全柜、裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)內(nèi)配制和分裝。(7)操作器材專區(qū)專用，以降低不同實(shí)驗(yàn)間擴(kuò)增產(chǎn)物交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。(8)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，生物安全柜、超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)及實(shí)驗(yàn)室需用紫外線消毒30 min以上。(9)定期檢測實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，以確保整個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈程度。整個(gè)操作過程中，操作人員應(yīng)嚴(yán)格遵守操作SOP規(guī)程，最大程度地減少可能出現(xiàn)的的污染。

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2 注意DNA的濃度及質(zhì)量

DNA的提取質(zhì)量與后期文庫構(gòu)建、數(shù)據(jù)分析密切相關(guān)。病理科使用的經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋處理的FFPE樣本，存在多種因素干擾并影響DNA質(zhì)量[4](表1)。研究發(fā)現(xiàn)10%中性福爾馬林可以引起DNA片段化損傷，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增時(shí)可以擴(kuò)增的模板量降低；同時(shí)降低PCR擴(kuò)增酶的反應(yīng)效率[5-6]。此外，長期暴露環(huán)境條件下的FFPE樣本可誘導(dǎo)DNA碎片化[7]，從而造成NGS檢測結(jié)果產(chǎn)生偏差[8]。

表1 FFPE樣本對NGS結(jié)果造成的影響因素

樣本的質(zhì)控是靶向測序分析的基石。首先由病理醫(yī)師進(jìn)行病理質(zhì)控，對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行富集(圖2A)。在實(shí)驗(yàn)操作中應(yīng)注意：(1)采用FFPE專用的核酸提取試劑盒，會(huì)對福爾馬林誘導(dǎo)的修飾進(jìn)行部分逆轉(zhuǎn)[9]。(2)在進(jìn)行PCR擴(kuò)增前可以用尿嘧啶-DNA糖基化酶處理，減少因尿嘧啶損傷引入C>T, G>A等突變[8]。(3)FFPE樣本制備及保存過程可能會(huì)產(chǎn)生DNA隨機(jī)突變，造成單核苷酸變體(SNV)或插入/缺失(indels)。該誤差可以通過加深測序深度及變體分析算法糾正[10]。(4)可以使用瓊脂糖或核酸電泳儀對樣本核酸完整性進(jìn)行客觀評價(jià)[11]。(5)針對低質(zhì)量的樣本，建議采取減少核酸打斷時(shí)間及強(qiáng)度，或增加起始投入量來適度彌補(bǔ)文庫豐度，或提高樣本測序深度，擴(kuò)大樣本上機(jī)濃度等方式，以保證最終生成有效的數(shù)據(jù)量。穿刺、活檢等小組織樣本，建議：(1)處理時(shí)直接采取EP管收集，以減少后期刮片造成組織損失(圖2B)；(2)提取DNA時(shí)可適當(dāng)減少溶解液體積，以提高DNA濃度。

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此外，DNA濃度定量的準(zhǔn)確性也至關(guān)重要。NGS過程中需多次對DNA濃度進(jìn)行檢測。紫外吸光度測量不具有選擇性，靈敏度不足，不適用于NGS檢測。因而采用熒光染料法，通過與特異性的靶分子結(jié)合時(shí)發(fā)出特殊熒光信號，可以對核酸進(jìn)行精準(zhǔn)定量[12]。定量操作要注意：(1)當(dāng)樣本中片段長度不均一，會(huì)與染料結(jié)合有差別，從而造成熒光值偏差。(2)熒光染料在不同的溫度下熒光信號強(qiáng)弱有偏差。在低溫時(shí)測出的值偏大，高溫時(shí)測出的值偏小，整體誤差范圍約10%。針對上述問題，在實(shí)際DNA定量過程中建議：(1)DNA定量前，樣本需要完全解凍成液體后，充分振蕩混勻離心后進(jìn)行檢測。(2)每次檢測前都需用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正，重新制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)有條件的實(shí)驗(yàn)室可對樣本采用復(fù)孔方式檢測，以確保定量的準(zhǔn)確性。

3 磁珠的使用

為了保證DNA的質(zhì)量，在NGS檢測過程中，文庫需要多次純化。目前通常采用磁珠純化法，是一種固相載體可逆化固定的分離純化方法。其主要原理為：磁珠微珠表面包裹了一層可發(fā)生離心交換的材料。在不同濃度的聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)中，DNA分子構(gòu)象會(huì)發(fā)生急劇變化，由線狀被壓縮形成卷曲球狀，繼而聚集沉淀，吸附在磁珠的羧基修飾層上。隨PEG分子量、濃度以及鹽濃度的不同，不同長度的DNA可以被選擇性沉淀出來[13]。在整個(gè)體系中，PEG濃度是影響DNA回收的決定性因素。因此，在純化文庫過程中使用磁珠需注意：(1)使用前充分混勻，室溫平衡，這是保證PEG濃度的先決條件。可以通過觀察樣本磁珠混合液的顏色是否一致，確保混合均勻(圖3A)。(2)在純化過程中，采用70%～80%乙醇對磁珠進(jìn)行清洗，需使用新鮮現(xiàn)配乙醇，以防止因揮發(fā)造成乙醇濃度的誤差。(3)在磁珠靜置過程中，需待溶液完全澄清，以免造成樣本DNA損失。(4)在回收洗脫DNA時(shí)，一般根據(jù)磁珠的返光度判斷磁珠的干燥狀態(tài)(圖3B)。殘余量的乙醇會(huì)影響酶的活性從而減少后續(xù)PCR擴(kuò)增的效能。

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NGS檢測是一個(gè)極為復(fù)雜的過程，除了上述這些常見問題，同時(shí)需要確保每個(gè)環(huán)節(jié)的準(zhǔn)確性。運(yùn)用全面質(zhì)量管理的理念，系統(tǒng)地識別并管理各個(gè)繁雜的階段，以保證檢測結(jié)果的真實(shí)性及有效性[14]。