豬流行性腹瀉活疫苗與滅活疫苗免疫仔豬抗體反應(yīng)的評(píng)估

杜久斌 唐慧芬 潘曉梅 趙曉英 廖 勇 劉強(qiáng)德 孫彥軍 賀 筍

（天康生物制藥有限公司，新疆烏魯木齊 830001）

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）是豬的一種高致病性接觸性傳染病，屬于冠狀病毒，1971年首次在英國(guó)被發(fā)現(xiàn)，隨后比利時(shí)、荷蘭、德國(guó)、瑞士、法國(guó)、匈牙利和保加利亞等國(guó)均有該病的報(bào)道，我國(guó)從80年代證明有豬流行性腹瀉病的發(fā)生。到2000年，該病已在我國(guó)全面流行，特別是從2010年起，我國(guó)出現(xiàn)新的高致病性PEDV毒株[1]，導(dǎo)致我國(guó)免疫豬群中再度發(fā)病，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的危害[2-4]，對(duì)PED的預(yù)防和防控應(yīng)以疫苗接種為主，國(guó)內(nèi)外的研究者在PED疫苗研究方面已做了大量工作[5,6]，但目前為止，還沒(méi)有研制出特別有效的疫苗可以控制PED疾病的發(fā)生。目前市面上以PED細(xì)胞滅活疫苗和PED細(xì)胞弱毒活疫苗為主來(lái)預(yù)防PEDV[7]。在臨床上使用PED滅活疫苗免疫2次后，母豬血清和乳汁中所產(chǎn)生的中和抗體、IgA和IgG水平，高于2針活疫苗免疫和1針活疫苗加1針滅活疫苗的免疫效果[8]。

有效的PED疫苗免疫豬只后能產(chǎn)生較高的中和抗體，保護(hù)豬只免受PED病毒的感染[9]。由于臨床受野毒感染的影響，不能客觀(guān)評(píng)價(jià)活疫苗和滅活疫苗所產(chǎn)生的抗體水平[10]。因此，在本研究中，選擇未感染過(guò)PEDV的仔豬免疫商品化PED細(xì)胞活疫苗和滅活疫苗，綜合評(píng)價(jià)不同疫苗免疫仔豬后血清的抗體反應(yīng)情況。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

豬流行性腹瀉病毒：豬流行性腹瀉病毒（XJ-DB2株）代次F14代，病毒含量106.0 TCID50/mL，批號(hào)：20150917。

細(xì)胞：Vero細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，由天康生物制藥公司保管、傳代。

疫苗：PED細(xì)胞活疫苗、滅活疫苗均為市售疫苗。

試劑盒：豬流行性腹瀉IgA抗體檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自愛(ài)德士公司，批號(hào)：21028；豬流行性腹瀉IgG抗體檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自Biovet Inc公司，批號(hào)：230204。

試驗(yàn)動(dòng)物：選用PED抗原、抗體陰性妊娠母豬所產(chǎn)1月齡仔豬。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)分組及免疫

篩選產(chǎn)前15 d左右妊娠母豬運(yùn)輸至試驗(yàn)動(dòng)物舍，隔離飼養(yǎng)。母豬分娩后仔豬母乳喂養(yǎng)至1月齡，將仔豬分成3組，每組5頭。第Ⅰ組免疫活疫苗，10頭份/頭，免疫1次；第Ⅱ組免疫滅活疫苗，2 mL/頭，首次免疫完間隔14日加強(qiáng)免疫1次；第Ⅲ組為空白對(duì)照組，不做免疫。試驗(yàn)動(dòng)物分組及免疫情況見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及免疫

1.2.2 樣品采集

試驗(yàn)豬只于首免時(shí)、一免后14日和一免后28日分別采集血清，用于抗體水平檢測(cè)。

1.2.3 抗體檢測(cè)

將待檢血清、陽(yáng)性血清和陰性對(duì)照血清56℃水浴滅活30 min。用MEM（含10 μg/mL胰酶）對(duì)滅活后的待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照血清在96孔U型板內(nèi)進(jìn)行2倍（1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32…1∶256稀釋?zhuān)┫盗邢♂尅Ｃ總€(gè)稀釋度4孔，每孔100 μL。用MEM（含10 μg/mL胰酶）將檢驗(yàn)病毒稀釋成病毒含量為200 TCID50/0.1 mL的病毒液。將稀釋好的病毒液按每孔100 μL加到含有血清的96孔U型板中，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)中和1 h。取培養(yǎng)24～48 h的96孔培養(yǎng)板細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，將中和1 h的病毒與血清的混合物轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板相應(yīng)的孔內(nèi)，每孔100 μL，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀(guān)察5日，用Spearman Karber法計(jì)算血清中和抗體效價(jià)。按抗體檢測(cè)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行IgA、IgG抗體檢測(cè)。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 中和抗體結(jié)果

3組試驗(yàn)豬免疫前血清中和抗體效價(jià)均不高于1∶2，免疫后14日，活疫苗抗體效價(jià)在1∶10左右，滅活疫苗抗體效價(jià)在1∶25左右；免疫后28日，活疫苗抗體效價(jià)在1∶8左右，滅活疫苗抗體效價(jià)在1∶180左右。具體結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同疫苗免疫豬只后的中和抗體檢查

2.2 IgA抗體結(jié)果

3組試驗(yàn)豬免疫前和免疫后血清IgA抗體水平均為陰性，無(wú)論是活疫苗免疫組還是滅活疫苗免疫組，血清IgA抗體水平均無(wú)升高。具體結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同疫苗免疫豬只后IgA抗體檢測(cè)結(jié)果

2.3 IgG抗體結(jié)果

活疫苗免疫組和空白對(duì)照組免疫前后IgG抗體均為陰性；滅活疫苗免疫組免疫后14日IgG抗體S/P值在2.3左右，免疫后28日S/P值在3.0左右。具體結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同疫苗免疫豬只后IgG抗體檢測(cè)結(jié)果

3 討論

對(duì)于主要在腸道上皮細(xì)胞中復(fù)制的腸病毒，局部產(chǎn)生的病毒特異性IgA抗體是黏膜表面初級(jí)適應(yīng)性防御的最重要功能[11,12]。血清中IgG抗體反應(yīng)很少參與預(yù)防大多數(shù)腸道病毒感染[11]。血清或黏膜IgA抗體水平已被用來(lái)預(yù)測(cè)疫苗的效力和個(gè)體或畜群對(duì)腸道傳染病如輪狀病毒感染的免疫狀態(tài)。因此，PEDV血清IgA抗體檢測(cè)廣泛用于評(píng)估感染和疫苗對(duì)PEDV的免疫效果[13,14]。

本試驗(yàn)通過(guò)未感染過(guò)PEDV的豬只肌肉注射PED滅活疫苗和PED活疫苗，對(duì)產(chǎn)生的IgA、IgG和中和抗體進(jìn)了綜合評(píng)估。結(jié)果顯示，活疫苗免疫豬只不能產(chǎn)生I-gA抗體，而IgA主要由黏膜系統(tǒng)產(chǎn)生，說(shuō)明肌肉注射PED活疫苗不能使PED疫苗弱毒進(jìn)入腸道的腸壁纖毛上皮細(xì)胞增殖，從而不能誘導(dǎo)豬腸壁黏膜產(chǎn)生IgA抗體。

試驗(yàn)前，篩選臨床上PED抗原、抗體陰性豬進(jìn)行PED滅活疫苗免疫試驗(yàn)，免疫后豬只產(chǎn)生了較高的IgA抗體、IgG抗體和中和抗體水平。分析原因可能是臨床陰性豬只之前感染過(guò)PED野毒，感染后的B細(xì)胞免疫反應(yīng)，有全身性和黏膜性PEDV IgA抗體反應(yīng)，在腸系膜淋巴結(jié)和回腸中有PEDV IgA抗體記憶的B細(xì)胞[15]。這時(shí)使用滅活疫苗免疫，就能夠再次激活I(lǐng)gA。這也是本次試驗(yàn)選用臨床PED抗原、抗體陰性母豬，在試驗(yàn)動(dòng)物房生產(chǎn)，使用生產(chǎn)的仔豬進(jìn)行的原因。

4 結(jié)論

豬流行性腹瀉活疫苗和滅活疫苗肌肉接種未感染過(guò)PEDV的豬只均不能產(chǎn)生IgA抗體。

豬流行性腹瀉活疫苗肌肉接種未感染過(guò)PEDV的豬只不能產(chǎn)生IgG抗體，可以產(chǎn)生較低水平的中和抗體。

豬流行性腹瀉滅活疫苗肌肉接種未感染過(guò)PEDV的陰豬只，能產(chǎn)生高水平的中和抗體和高水平的IgG抗體。

從以上結(jié)論可以看出，肌肉接種未感染過(guò)PEDV的豬只，PED滅活疫苗所產(chǎn)生的抗體反應(yīng)高于接種活疫苗所產(chǎn)生的抗體，從所產(chǎn)生的抗體水平來(lái)看，滅活疫苗的效力高于活疫苗所產(chǎn)生的效力。