伊春林下參皂苷超高壓提取技術優化

王丹麗，邢振楠，劉艷杰，馬珂，劉邦

(黑龍江省林業科學院伊春分院，黑龍江伊春153000)

人參(PanaxginsengC．A．Meyer)為傘形目五加科人參屬多年生草本植物[1]，是一種名貴的中藥材，它通體具有較高藥性，最主要的成分是人參皂苷，功效強，常被用于研發生產抗癌癥、改善心律失常、緩解心肌缺血等方面的藥物。目前，研究者們常用的提取方法有煎煮法、浸漬法[2]、回流法、索氏提取法、水解法、泡沫分離法、微波輔助萃取法、超聲輔助提取法、生物提取法等,利用上述技術方法提取皂苷，存在耗時長、提取率不高、不節約能源等缺點[3]。采用超高壓提取林下參皂苷是一種新興有效的提取手段[4]，利用流體靜壓驟減作用于目標物細胞璧，使其膜透化，快速提取目標成份，此方法一般較多用來提取中草藥中熱不穩定成份，因為它不會受到溫度的制約，而且操作反應時間短[5]。試驗進行伊春林下參皂苷的提取，采用超高壓技術，并合理設計優化林下參皂苷的提取工藝[6]。工藝具有可操作性高、用時短，節能環保、綠色無污染等明顯優勢。

1 儀器與材料

超高壓等靜壓機，電子天平，旋轉蒸發器，紫外可見分光光度計，超聲波發生器，恒溫水浴禍，離心機。林下參(產于小興安嶺伊春)，人參皂苷對照品Re，實驗過程中所用試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 人參皂苷的測定

標準曲線的制備：精確稱取人參皂苷Re對照品6.2 mg，取25 mL容量瓶加甲醇定容標準液，精確量取對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于具塞試管中，待溶劑揮干后，繼續每支試管里量取加入5%香草醛-冰醋酸0.2 mL 、HClO40.8 mL，將試管放于于恒溫水浴鍋中，設定溫度60 ℃定時15 min，加入CH3COOH5mL，冷卻[7]。紫外分光光度計設置波長在350～850 nm進行掃描，測定550 nm為最大吸收波長，在此處測A值，得人參皂苷Re質量濃度y (mg/mL)與吸光度值A的回歸方程：Y=0.033A該方程的相關系數r=0.9994[6]。

2.2 樣品處理

林下參干根樣品干燥，破碎機粉碎后過0.425 mm篩，按每40 mL加入1 g干粉的比例加入CHCl3，回流3 h后進行脫脂把溶劑回收，剩下的樣品殘渣揮干溶劑后備用。

2.3 人參皂苷提取

精確稱取林下參干粉末0.5 g，按實驗設計加入溶劑后封口搖勻，在經過高壓處理后，用離心機4000 r/min離心后取上清液，測量吸光度(A)值。

樣品測定：精確量取處理好的樣品0.2 mL,測吸光值A，并計算林下參皂苷提取收率Y(%)。

Y(%)=0.0198×A×(V/V1)×(1/m) ×100

其中：A為吸光度值，V為提取液總體積，V1為檢測時所取溶液體積，m為人參樣品質量。

2.4 單因素試驗及結果

2.4.1 溶劑的選擇。稱取4份處理后的樣品，每份0.5 g，分別加入25 mL的水、水飽和CH3(CH2)3OH、CH3OH、50%CH3CH2OH后封口搖勻，調整壓力為500 MPa，保壓2 min，用離心機4000 r/min離心后取上清液，測量吸光度(A)值，結果見(表1)。

表1 超高壓提取林下參皂苷的不同溶劑選擇

為了高速、高效提取林下參皂苷，選好一種適合的溶劑很重要，這樣可以減少雜質含量，目前常用的提取溶劑有水、正丁醇、甲醇、乙醇等，它們對人參皂苷的溶出率各不相同，所采取的工藝條件也存在一定差異。由于乙醇提取率高、無毒害、方便回收等突出優點，所以選擇乙醇作為超高壓提取林下參皂苷的溶劑。

2.4.2 溶劑體積分數的選擇。首先用50%的乙醇配置出體積分數為10%、20%、30%、70%、90%的溶劑，稱取5份處理后的樣品，每份0.5 g，分別加入25 mL的不同體積分數的溶劑，封口搖勻，調整壓力為500 MPa，保壓2 min，取上清液離心測定A值，結果見(表2)。

表2 超高壓提取林下參皂苷的乙醇體積分數的選擇

在乙醇溶劑體積分數在10%～70%之間時，溶劑體積分數大小與人參皂苷的提取得率成正比。而當溶劑體積分數為90%時，人參皂苷的提取收率有了明顯的降低。

2.4.3 固液比的選擇。用70%乙醇按固液比1∶10、1∶25、1∶50、1∶75、1∶100分別配置溶液，稱取5份處理后的樣品，每份0.5 g，分別加入,封口搖勻，在經過500 MPa高壓、保壓2 min處理后，用離心機4000 r/min離心后取上清液，測量吸光度(A)值，結果見(表3)。

由表3分析，隨著固液比的變化，林下參皂苷的提取率也在發生變化它的得率是逐漸穩步提高的。從實驗角度出發，將固液比范圍選定為為1∶25～1∶75之間，能夠更好的提取有效成分，經濟性也更合理。

表3 超高壓提取林下參皂苷的不同固液比的選擇

2.4.4 壓力的選擇。稱取5份處理后的樣品，每份0.5 g，分別抽取25 mL固液比為1∶100的70%乙醇，封口后搖勻，分別在壓力100、200、300、400、500、600 MPa的壓力處理下，保壓2 min、離心機4000 r/min離心取上清液，測定A值，結果見(表4)。

表4 超高壓提取林下參皂苷的不同壓力得率比較選擇

壓力對超高壓提取林下參皂苷的影響因子很大，從表4可見，壓力在100～500 MPa之間時，提取壓力與提取率呈線性正相關關系，當壓力超過600 MPa時，提取收率緩慢降低。所以，確定最佳壓力范圍100～500 MPa之間。

2.4.5 提取時間的選擇。在林下參皂苷超高壓提取的時間中，所需提取時間也是一個重要因子。在實驗條件一致下，實驗結果見(圖1)。

圖1 不同提取時間對提取收率的影響

通過圖1可以看出，林下參皂苷的提取率和提取時間的長短之間并無明顯正相關線性關系，出現這種現象的原因是提取過程中壓力較高，外部溶劑能夠迅速透過細胞壁進入到細胞里。

2.5 單因素試驗及結果

試驗參照陳瑞戰等[5]的實驗進行了單因素的實驗，結果表明，得到了超高壓提取林下參皂苷的合適溶劑為乙醇、溶劑濃度范圍、提取壓力范圍100～500 MPa、固液比1∶25～1∶75、保壓時間1～2 min。

2.6 正交試驗結果分析

在單因素實驗數據的基礎上，設計L9(34)正交實驗(見表5、表6)。

表5 因素水平表

表6 L9(34)正交試驗設計方案及結果

由表6可以得出，3種因素對人參皂苷提取率的影響依次為A>B>C，即提取壓力對人參皂苷提取率有極顯著影響，而溶劑體積分數和固液比對人參皂苷提取率的影響不明顯。結果表明，三種因素的優化組合為 A3B2C3，即伊春林下參皂苷超高提取技術工藝及條件為提取壓力500 MPa、溶劑體積分數為50%、固液比1∶75、提取時間2 min，在優化條件下，提取林下參皂苷收率最高。經進一步試驗驗證，按優化條件提取人參皂苷，測得提取率高達7.61%。

3 結論

在常溫下使用超高壓提取林下參皂苷是一個新興的提取工藝，能夠很好的減少高熱對皂苷結構的影響。通過優化試驗，在提取壓力達到500 MPa、料液比在1∶75的比例下、溶劑為濃度50%的乙醇時，林下參皂苷的提取得率最高可達到7.61%，林下參皂苷技術優化也為森林食品天然產物有效成分的提取開拓了一種新的工藝。它打破了很多傳統提取手段的瓶頸，具有很多突出的優點，因為在采用超高壓提取皂苷的整個過程中是封閉的，沒有溶劑揮發，能耗低、所以綠色環保，該方法用時短，簡易環保、適合用于人參皂苷的工業化生產，可為目前其他熱門森林食品的天然產物活性成分提取提供參考。