基于TGF-β1/Smad3信號(hào)通路探討參附注射液對(duì)缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

王 禮，段春梅

缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)又稱為腦梗死，是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，由于腦血管病變組織短暫性供血障礙，引起炎性因子及自由基積累，腦組織缺血、缺氧甚至壞死，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞異常凋亡、發(fā)生梗死[1-2]。IS發(fā)病率和死亡率逐年升高，具有病后恢復(fù)時(shí)間長(zhǎng)、預(yù)后不理想等特點(diǎn)，給社會(huì)和家庭造成沉重負(fù)擔(dān)[3]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一種多功能調(diào)節(jié)肽，參與體內(nèi)生理、生化反應(yīng)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。正常情況下，大腦組織幾乎不表達(dá)TGF-β1，在缺血條件下TGF-β1表達(dá)升高[4]。TGF-β1能促進(jìn)下游Smad3蛋白磷酸化，激活的Smad3進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，從而參與神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[5]。Caruso等[6]研究顯示，應(yīng)用TGF-β1對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，可降低一氧化氮導(dǎo)致的神經(jīng)毒性。Kotlarz等[7]研究顯示，TGF-β1表達(dá)缺失可加重病人腦部組織炎性損傷。參附注射液主要成分為人參皂苷、烏頭類生物堿，可增加血流灌注量，延長(zhǎng)動(dòng)物耐缺氧時(shí)間，具有抗炎、抗內(nèi)毒素及保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用[8]。參附注射液對(duì)腦缺血性損傷的保護(hù)作用已有報(bào)道。杜婷等[9]研究顯示，參附注射液可清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而減輕神經(jīng)功能損傷，降低腦缺血再灌注損傷。鐘升華等[10]研究顯示，參附注射液可促進(jìn)急性腦梗死病人神經(jīng)功能恢復(fù)，降低致殘率。參附注射液是否通過TGF-β1/Smad3信號(hào)通路在IS中發(fā)揮作用研究報(bào)道較少。本研究通過改良Longa線栓法構(gòu)建大鼠永久性中動(dòng)脈栓塞模型，探討參附注射液是否通過TGF-β1/Smad3信號(hào)通路對(duì)IS大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，以期為參附注射液治療IS提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 48只10～12周齡、體質(zhì)量(250±20)g的無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)SD雄性大鼠購(gòu)自北京生物制品研究所有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(京)2020-0031。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫23 ℃，標(biāo)準(zhǔn)濕度60%，12 h/12 h晝夜交替，正常供應(yīng)飼料和飲用水，分籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 參附注射液(雅安三九藥業(yè)有限公司)；TGF-β1蛋白(美國(guó)Selleck公司)；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)(美國(guó)Sigma公司)；TGF-β1、p-Smad3、B細(xì)胞淋巴瘤-2基因(B cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 related X protein，Bax)抗體(美國(guó)CST公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(北京博爾西科技有限公司)；原位末端凋亡檢測(cè)(TUNEL)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；二喹啉甲酸法(BCA)蛋白測(cè)定試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；伊文思藍(lán)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；Thermo酶標(biāo)儀(上海熱電儀器有限公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；組織包埋機(jī)(德國(guó)Leica公司)；腦立體定位儀(美國(guó)Corning公司)；臺(tái)式冰凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；蛋白電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；X71光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；激光散斑成像儀(瑞典PERIMED公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型構(gòu)建與分組 將48只大鼠隨機(jī)分為Sham組、Vehicle組、參附注射液組(40 mg/kg[11])和TGF-β1組(20 mg/kg[12])。采用改良Longa線栓法[13]構(gòu)建Vehicle組、參附注射液組、TGF-β1組大鼠永久性中動(dòng)脈栓塞模型：腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉(3 mL/kg)麻醉，固定于手術(shù)臺(tái)上，消毒后在頸部縱切，剝離其他組織，暴露并游離出右側(cè)3支動(dòng)脈；自頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈分叉處結(jié)扎并剪斷線栓?？p合皮下組織和皮膚。最后對(duì)切口皮膚消毒。Sham組只插入線栓不結(jié)扎，其余操作同Vehicle組。

建模成功的標(biāo)準(zhǔn)[14]：大鼠左側(cè)肢體疼痛遲鈍或消失；倒懸時(shí)左上肢不能完全伸展；行走時(shí)身體向左側(cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈。排除蛛網(wǎng)膜下腔出血和死亡的大鼠。

建模結(jié)束2 h后，參附注射液組和TGF-β1組分別腹腔注射對(duì)應(yīng)劑量的參附注射液和TGF-β1，Sham組和Vehicle組腹腔注射等量生理鹽水，每日固定時(shí)間注射1次，連續(xù)給藥14 d。

1.2.2 各組大鼠一般狀態(tài)及神經(jīng)功能評(píng)分 參照Longa神經(jīng)功能缺損評(píng)分方法[15]，動(dòng)物造模14 d后對(duì)神經(jīng)功能缺損癥狀進(jìn)行評(píng)分并記錄，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分為左前肢不能完全伸展；2分為行走時(shí)身體轉(zhuǎn)向左側(cè)；3分為行走時(shí)身體向左倒下；4分為癱瘓，無(wú)法站立。

1.2.3 激光散斑成像觀察各組大鼠大腦皮層血流變化 完成神經(jīng)功能缺損評(píng)分后，采用0.3%戊巴比妥鈉(3 mL/kg)麻醉大鼠，保持背部固定姿勢(shì)，從頭頂縱切，分離皮膚，剝離頂部骨膜，充分暴露大腦皮質(zhì)。激光散斑成像儀掃描記錄大腦皮質(zhì)血流彩圖，比較大腦皮質(zhì)血流灌注情況。

1.2.4 伊文思藍(lán)染色測(cè)定血腦屏障通透性 完成神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分后，尾靜脈注射4 mL/kg的2%的伊文思藍(lán)溶液，2 h后麻醉大鼠，使用生理鹽水灌注心臟，當(dāng)腦組織其他部位伊文思藍(lán)沖洗時(shí)斷頭取腦。與50%的三氯乙酸1 mL制成勻漿，4 ℃離心20 min，使用酶標(biāo)儀620 nm處檢測(cè)上清液吸光度。同時(shí)測(cè)定已知濃度梯度伊文思藍(lán)的OD值作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品伊文思藍(lán)含量，反映血腦屏障通透性。

1.2.5 TTC染色法測(cè)定大鼠腦梗死體積 采用0.3%戊巴比妥鈉(3 mL/kg)麻醉大鼠后斷頭取腦，將各組腦組織分為10等份，于-20 ℃冰箱待測(cè)，取1份腦組織制成2 mm冠狀切片。將切片浸入2%TTC溶液中，于37 ℃孵育15 min，4%多聚甲醛溶液中固定24 h，使用數(shù)碼相機(jī)等距拍照(正常腦組織呈紅色，梗死腦組織呈蒼白色)。將圖像導(dǎo)入電腦并采用Image-pro plus6.0圖像軟件分析大鼠腦梗死體積。

1.2.6 尼氏染色觀察各組大鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)元損傷 取1份腦組織，常規(guī)固定、石蠟包埋，制成5 μm厚的冠狀切片，按照尼氏染色試劑盒要求進(jìn)行脫蠟、水化、切片、染色、脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡(×400)下選取5個(gè)視野，觀察大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞及尼氏小體損傷情況。

1.2.7 TUNEL法檢測(cè)大鼠腦組織細(xì)胞凋亡 取1份腦組織，制作石蠟切片及常規(guī)脫蠟、梯度乙醇脫水處理，加入蛋白酶K工作液37 ℃作用30 min，浸入3%過氧化氫-甲醇中室溫封閉，加入TUNEL混合液于37 ℃避光反應(yīng)1 h，分別采用梯度乙醇脫水，二甲苯浸泡。最后中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡(×400)下選取5個(gè)視野，觀察染色結(jié)果并拍照。凋亡細(xì)胞染色呈棕黃色，細(xì)胞凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.8 ELISA法檢測(cè)各組大鼠腦組織白細(xì)胞介素-1β(interleukin -1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin -6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平 取1份腦組織，加入細(xì)胞裂解液勻漿，4 ℃、9 000 r/min離心10 min，取上清液，-20 ℃保存待測(cè)。按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

1.2.9 各組大鼠腦組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量 取1份腦組織，加入細(xì)胞裂解液勻漿，4 ℃，9 000 r/min離心10 min，取上清液，-20 ℃保存待測(cè)。采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD活性；硫代巴比妥酸顯色(TBA)檢測(cè)MDA含量。

1.2.10 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)TGF-β1、p-Smad3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平 取1份腦組織，加入細(xì)胞裂解液勻漿進(jìn)行總蛋白提取，使用BCA蛋白試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度，蛋白定量變性后進(jìn)行十二烷基酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，電泳后迅速轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，置入含5%脫脂牛奶TBST溶液中室溫封閉2 h，分別加入對(duì)應(yīng)一抗TGF-β1、p-Smad3、Bcl-2、Bax(1∶2 000)4 ℃過夜。TBST洗滌3次后，加入二抗(1∶10000)室溫孵育2 h，最后避光下加入二氨基聯(lián)苯胺法(DAB)顯色劑顯色，Bio-rad凝膠成像儀記錄蛋白灰度并拍照，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為對(duì)照，對(duì)各組蛋白進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)及神經(jīng)功能評(píng)分比較 Sham組大鼠皮毛光亮順滑、活潑好動(dòng)、飲食飲水正常、體質(zhì)量增加；Vehicle組大鼠皮毛暗淡雜亂、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、經(jīng)常轉(zhuǎn)圈且四肢不協(xié)調(diào)、食欲不良；與Vehicle組比較，參附注射液組和TGF-β1組大鼠癥狀改善，四肢趨于協(xié)調(diào)，飲食飲水增加，體重較Vehicle組增加。與Sham組比較，Vehicle組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分增高(P<0.05)；與Vehicle組比較，參附注射液組和TGF-β1組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分下降(P<0.05)，參附注射液組和TGF-β1組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖1。提示參附注射液和TGF-β1能改善大鼠神經(jīng)功能損傷。

Vehicle組與Sham組比較，＊P<0.05；與Vehicle組比較，#P<0.05。圖1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較

2.2 各組大鼠大腦皮層血流灌注量比較 激光散斑成像結(jié)果顯示，與Sham組比較，Vehicle組大鼠大腦皮層血流灌注量減少(P<0.05)；與Vehicle組比較，參附注射液組和TGF-β1組大鼠大腦皮層血流灌注量增加(P<0.05)；參附注射液組和TGF-β1組大鼠大腦皮層血流灌注量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖2。提示參附注射液和TGF-β1能增加大鼠血流灌注。

Vehicle組與Sham組比較，＊P<0.05；與Vehicle組比較，#P<0.05。圖2 各組大鼠大腦皮層血流灌注量比較

2.3 各組大鼠血腦屏障通透性比較 伊文思藍(lán)染色結(jié)果顯示，與Sham組比較，Vehicle組伊文思藍(lán)含量升高；與Vehicle組比較，參附注射液組和TGF-β1組伊文思藍(lán)含量降低(P<0.05)；參附注射液組和TGF-β1組伊文思藍(lán)含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖3。提示參附注射液和TGF-β1能降低大鼠血腦屏障通透性，改善腦水腫。

Vehicle組與Sham組比較，＊P<0.05；與Vehicle組比較，#P<0.05。圖3 各組大鼠伊文思藍(lán)含量比較

2.4 各組大鼠腦梗死體積比較 TTC染色結(jié)果顯示，Sham組未見白色梗死區(qū)，腦組織染色為均一的紅色；Vehicle組可見大面積白色梗死區(qū)；與Vehicle組比較，參附注射液組和TGF-β1組梗死體積減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；參附注射液組和TGF-β1組梗死體積比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖4。提示參附注射液和TGF-β1能減小大鼠梗死體積。

Vehicle組與Sham組比較，＊P<0.05；與Vehicle組比較，#P<0.05。圖4 各組大鼠腦梗死體積比較(A為TTC染色圖；B為各組梗死體積比較的柱狀圖)

2.5 各組大鼠腦組織神經(jīng)元尼氏小體損傷比較 尼氏染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，胞體及突起正常，尼氏小體數(shù)量豐富，染成深藍(lán)色，胞核結(jié)構(gòu)完整，染成淡藍(lán)色；Vehicle組大鼠神經(jīng)元數(shù)量減少，且排列不規(guī)則，胞體皺縮，胞漿呈中空泡樣變性，尼氏小體數(shù)量減少，染成淡藍(lán)色；參附注射液組和TGF-β1組大鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)趨于完整，且數(shù)量增加，尼氏小體數(shù)量增多，染色較深。詳見圖5。提示參附注射液和TGF-β1能緩解神經(jīng)元損傷。

2.6 各組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡比較 TUNEL染色結(jié)果顯示，與Sham組比較，Vehicle組腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加；與Vehicle組比較，參附注射液組和TGF-β1組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少(P<0.05)；參附注射液組和TGF-β1組神經(jīng)細(xì)胞凋亡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖6。提示參附注射液和TGF-β1能減少大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

圖5 各組大鼠腦組織神經(jīng)元尼氏小體損傷(×400)

Vehicle組與Sham組比較，＊P<0.05；與Vehicle組比較，#P<0.05。圖6 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡比較(×400)(A為TUNEL染色圖；B為各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較的柱狀圖)

2.7 各組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較 ELISA結(jié)果顯示，與Sham組比較，Vehicle組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β和IL-6含量升高(P<0.05)；與Vehicle組比較，參附注射液組和TGF-β1組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β和IL-6含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；參附注射液組和TGF-β1組TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)。詳見圖7。提示參附注射液和TGF-β1能減輕大鼠炎癥反應(yīng)。

Vehicle組與Sham組比較，＊P<0.05；與Vehicle組比較，#P<0.05。圖7 各組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較

2.8 各組大鼠腦組織SOD、MDA含量比較 檢測(cè)結(jié)果顯示，與Sham組比較，Vehicle組大鼠腦組織SOD水平下降，MDA水平升高(P<0.05)；與Vehicle組比較，參附注射液組和TGF-β1組大鼠腦組織SOD水平升高，MDA水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；參附注射液組和TGF-β1組SOD、MDA水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)。詳見圖8。提示參附注射液和TGF-β1能減輕大鼠氧化應(yīng)激損傷。

Vehicle組與Sham組比較，＊P<0.05；與Vehicle組比較，#P<0.05。圖8 各組大鼠腦組織SOD、MDA含量比較(A為SOD表達(dá)柱狀圖；B為MDA表達(dá)柱狀圖)

2.9 各組大鼠腦組織TGF-β1、p-Smad3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平比較 Western Blot結(jié)果顯示，與Sham組比較，Vehicle組大鼠腦組織TGF-β1、p-Smad3、Bax蛋白表達(dá)量升高，Bcl-2蛋白表達(dá)量下降(P<0.05)；與Vehicle組比較，參附注射液組和TGF-β1組大鼠腦組織Bax蛋白表達(dá)量降低，TGF-β1、p-Smad3、Bcl-2蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)；參附注射液組和TGF-β1組各蛋白表達(dá)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖9。提示參附注射液和TGF-β1影響TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，增加Bcl-2/Bax比值。

Vehicle組與Sham組比較，＊P<0.05；與Vehicle組比較，#P<0.05。圖9 各組大鼠腦組織TGF-β1、p-Smad3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平比較(A為TGF-β1、p-Smad3蛋白表達(dá)條帶圖；B為TGF-β1、p-Smad3蛋白表達(dá)柱狀圖；C為Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)條帶圖；D為Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)柱狀圖)

3 討 論

IS是由于腦供血不足引起腦組織局部軟化壞死的腦血管病，多發(fā)于老年人群，臨床表現(xiàn)為頭暈頭痛、肢體偏癱等，甚至導(dǎo)致腦疝、昏迷，嚴(yán)重威脅病人生命健康。有研究表明，腦梗死的發(fā)病機(jī)制與神經(jīng)細(xì)胞能量代謝失衡、炎性因子異常表達(dá)、酸性物質(zhì)毒性作用及神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)[16]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，參附注射液可有效清除氧自由基和過氧化物，抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，用于防護(hù)心腦血管疾病[17]。王麗娟[18]研究顯示，參附注射液佐治老年腦梗死效果顯著，通過抑制機(jī)體C反應(yīng)蛋白、IL-6等炎性因子水平，減輕炎癥反應(yīng)。因此，本研究從行為學(xué)、形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)等方面驗(yàn)證參附注射液對(duì)大鼠IS具有保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，Vehicle組大鼠較Sham組皮毛暗淡雜亂、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、經(jīng)常轉(zhuǎn)圈且四肢不協(xié)調(diào)、食欲不良，表現(xiàn)出神經(jīng)功能缺失癥狀；參附注射液和TGF-β1干預(yù)后，大鼠神經(jīng)缺失癥狀明顯改善，四肢趨于協(xié)調(diào)、飲食飲水增加、體重較Vehicle組明顯增加。表明參附注射液和TGF-β1能改善大鼠神經(jīng)功能障礙。本研究結(jié)果還顯示，參附注射液組和TGF-β1組大鼠大腦皮層血流灌注量較Vehicle組增加，腦梗死體積、細(xì)胞凋亡及損傷減少，血腦屏障恢復(fù)。提示參附注射液和TGF-β1在IS中發(fā)揮著重要的保護(hù)作用。

TGF-β1在神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用。正常生理情況下，TGF-β1表達(dá)量較少，在缺血缺氧環(huán)境中表達(dá)上調(diào)，異常表達(dá)的TGF-β1通過激活下游p-Smad3，將Smad3轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，啟動(dòng)相應(yīng)基因表達(dá)，從而促進(jìn)腦血管生成，保護(hù)神經(jīng)，抵抗凋亡[19]。腦室注射TGF-β1可明顯減輕腦缺血海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元損害[20]。相關(guān)研究表明，TGF-β1/Smad3信號(hào)通路能抑制IS大鼠腦組織細(xì)胞凋亡[21]。本研究中Vehicle組較Sham組TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)增加，說明缺血缺氧環(huán)境刺激其表達(dá)，參附注射液和TGF-β1干預(yù)后，TGF-β1、Smad3表達(dá)較Vehicle組增加，TGF-β1作為對(duì)照藥物，與參附注射液干預(yù)結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推斷參附注射液對(duì)IS的保護(hù)作用可能是通過激活TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，增加TGF-β1、Smad3表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

MDA是氧自由基引起的過氧化代謝產(chǎn)物，與細(xì)胞損傷程度呈正相關(guān)。SOD是抗氧化物酶，可中和活性氧，阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，反映機(jī)體清除氧自由基能力。有研究表明，大鼠腦缺血再灌注后可產(chǎn)生大量氧自由基，MDA含量升高，SOD活性下降[22]。本研究中Vehicle組大鼠MDA含量提高，SOD活性下降，經(jīng)參附注射液和TGF-β1干預(yù)后，MDA含量下降，SOD活性提高，說明參附注射液和TGF-β1可減輕IS大鼠氧化應(yīng)激損傷。IS引起一定程度的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而造成腦組織炎癥損傷。TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子直接參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，可評(píng)估病人病情。肖東芳等[23]研究發(fā)現(xiàn)，血清TNF-α、IL-6水平與IS病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，梗死面積越大，TNF-α、IL-6水平越高。本研究中Vehicle組大鼠TNF-α、IL-6水平升高，經(jīng)過參附注射液和TGF-β1干預(yù)后，TNF-α、IL-6水平降低，提示參附注射液和TGF-β1能減輕IS大鼠炎癥反應(yīng)。

腦缺血損傷后，缺血程度較重時(shí)表現(xiàn)為神經(jīng)元壞死，較輕時(shí)表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡。若能恢復(fù)缺血區(qū)供血，可抑制細(xì)胞凋亡。Bax是促凋亡蛋白，Bax同源二聚體的形成誘導(dǎo)凋亡。Bcl-2是抗凋亡蛋白，通過控制線粒體外膜的通透性阻止凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，Bcl-2和Bax異源二聚體的形成可抑制凋亡。龍艷芳等[24]研究顯示，在中動(dòng)脈栓塞模型大鼠中，Bcl-2/Bax比值越大，細(xì)胞存活率越高，Bcl-2/Bax比值越小，細(xì)胞凋亡率越高。于臘梅等[25]研究顯示，大腦缺血組大鼠Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)減少，參附注射液治療組Bax表達(dá)減少，Bcl-2表達(dá)增加。本研究中Vehicle組大鼠較Sham組Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)減少，經(jīng)參附注射液和TGF-β1干預(yù)后，Bax表達(dá)減少，Bcl-2表達(dá)增加，提示參附注射液和TGF-β1能調(diào)控Bcl-2/Bax比值抑制IS大鼠細(xì)胞凋亡。

綜上所述，參附注射液可改善腦缺血大鼠血流灌注，縮小腦梗死體積，抑制機(jī)體氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，可能通過激活TGF-β1/Smad3信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)IS大鼠神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。但參附注射液是否通過其他信號(hào)通路發(fā)揮作用及參附注射液治療的最佳劑量，仍需進(jìn)一步研究。