秦艽對腦缺血再灌注損傷大鼠RAS/RAF通路及神經功能障礙的影響

張華軍，刁正文，杜春富，李秋霖

缺血性腦卒中又稱為腦梗死，是臨床心腦血管科的一種常見疾病，是由于血管堵塞引起腦部供血不足，進而腦組織局部出現壞死的疾病，該病發病急，病情進展迅速，致死率、致殘率較高，若治療不及時，易造成偏癱等，甚至導致死亡[1-2]。炎癥反應在腦梗死病情進展中發揮著重要作用，抑制炎癥可減輕腦缺血再灌注后腦損傷[3]，是治療缺血性腦卒中的有效手段。秦艽是一種傳統中藥，具有清除自由基、抗炎、抗氧化的藥理作用，可提高肝臟抗氧化應激水平，抑制肝臟炎癥，對脂肪肝及痛風性關節炎大鼠均有較好的治療效果[4-5]。大鼠肉瘤(RAS)/加速纖維肉瘤(RAF)通路在體內氧化應激、炎癥反應、DNA損傷等病理過程中發揮著重要的調控作用，激活RAS/RAF信號通路，可增強下游細胞外調節蛋白激酶(ERK)磷酸化水平，引發炎癥，造成肝細胞損傷[6-7]，通過下調RAS表達，抑制炎癥緩解腦缺血再灌注損傷[8]，由此可知RAS/RAF信號通路可能是治療缺血性腦卒中的靶點。本研究觀察秦艽對腦缺血再灌注損傷大鼠RAS/RAF通路及神經功能障礙的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SD大鼠購自廣州中醫藥大學動物實驗中心[SCXK(滬)2020-0002]，雄性，體質量180～220 g，清潔級，在溫度23～25 ℃，濕度50%～60%的動物房中飼養。

1.1.2 實驗試劑及儀器 秦艽(貨號DYQ8080)由上海恒斐生物科技有限公司提供；尼莫地平(貨號D14202003034)由山東新華制藥股份有限公司提供；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)(貨號298964)由Amresco公司提供；大鼠白細胞介素(IL)-6酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒(貨號EK0412)由上海彩佑實業有限公司提供；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(ab245880)、大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒(貨號ab100785)、RIPA裂解液(貨號ab288006)、二喹啉甲酸法(BCA)蛋白檢測試劑盒Ⅱ(貨號ab287853)、兔源RAS一抗(貨號ab52939)、兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗(貨號ab181602)、兔源RAF一抗(貨號ab137435)、兔源p-RAF一抗(貨號ab173539)、兔源ERK1/2一抗(貨號ab32537)、兔源p-ERK1/2一抗(貨號ab192591)、羊抗兔二抗(貨號ab150077)，由美國Abcam公司提供；十二烷基酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒(貨號P1200)、TBST緩沖液(貨號T1081)，由北京索萊寶公司提供。酶標儀(型號XElx800)購自美國Perkin Elmer公司；光學顯微鏡(型號SMZ745)購自日本尼康公司；切片機(型號CM3050S)購自德國Leica公司；小型蛋白電泳儀(型號1659001)、轉膜儀(型號Trans-Blot Turbo)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 腦缺血再灌注大鼠模型制備及分組 參照文獻[9]制備腦缺血再灌注大鼠模型：取65只SD大鼠，向腹腔內注入45 mg/kg的2.5%戊巴比妥鈉溶液，待大鼠深度麻醉后脫去頸部毛發，75%乙醇消毒后逐層剪開頸部皮膚與肌肉，找到右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)及頸內動脈(ICA)，游離后將CCA與ECA近心端結扎，同時夾閉ICA，于ECA近分叉處剪一個小切口后插入直徑0.24 mm的栓線，放開ICA，繼續插入拴線直到大腦中動脈起始處，將拴線尾端暴露于外后，逐層縫合，缺血2 h后，抽出栓線，再灌注48 h，大鼠模型制備完成。待大鼠蘇醒后進行神經功能缺損評分，參照Longa分級標準[10]：0分為大鼠神經功能無缺損；1分為大鼠對側前爪不能伸展完全；2分為大鼠行走時向對側轉圈；3分為大鼠行走時向對側傾倒；4分為大鼠不能自發行走，意識喪失；5分為大鼠死亡。神經功能缺損評分1～3分為大鼠模型制備成功，共60只，隨機分為模型組、尼莫地平組、秦艽低劑量組、秦艽中劑量組、秦艽高劑量組，每組12只；取12只正常SD大鼠切開頸部游離CCA、ECA、ICA，但不插栓線，作為假手術組。

秦艽生藥材經粉碎后以95%乙醇溶液(比例為1∶9)浸泡24 h，置于冷凝回流裝置中，加熱回流3 h，過濾后采用旋轉蒸發儀將濾液中的乙醇完全蒸發，即得到秦艽提取物浸膏，參照文獻[11]劑量作為人鼠劑量換算后給藥：秦艽提取物溶解于蒸餾水中分別制成質量分數為0.1 g/mL、0.4 g/mL、0.8 g/mL的藥液，秦艽各劑量組大鼠每日以10 mL/kg劑量灌胃，將尼莫地平[12]配制為濃度1 mg/mL溶液，尼莫地平組大鼠灌胃10 mL/kg尼莫地平溶液，假手術組與模型組大鼠灌胃10 mL/kg生理鹽水。每組每日治療1次，持續7 d。

1.2.2 大鼠神經功能缺損、腦梗死面積測量及標本收集 各組大鼠末次給藥后24 h，參照Longa分級法進行神經功能缺損評分。使用5 mL注射器刺入各組大鼠尾靜脈取血2 mL，靜置后，以3 000 r/min，4 ℃離心15 min，收集上清液，儲存于-80 ℃備用。各組分別取6只大鼠斷頭處死，取出大腦，沿冠狀切面切成5片，厚度大致相同，以2%的TTC染液浸沒切片染色(室溫，避光，30 min)，蒸餾水漂洗后固定(4%多聚甲醛，4 ℃，過夜)，采集切片圖像后采用Image pro軟件計算腦梗死面積，腦梗死面積(%)=全腦梗死面積/全腦片面積×100%。各組剩余的6只大鼠斷頭處死后分離腦組織，剪取約1.5 g置于RIPA裂解液(含有蛋白酶抑制劑)中，使用勻漿機制備勻漿液，以3 000 r/min，4 ℃，離心20 min，取上清液，采用BCA法測定各組樣品中總蛋白濃度，具體操作參照BCA試劑盒說明書進行，儲存于-80 ℃備用。

1.2.3 大鼠海馬組織蘇木精-伊紅(HE)染色 剩余腦組織，固定(4%多聚甲醛，4 ℃，過夜)、脫水(80%、90%、95%、100%乙醇依次孵育)，采用二甲苯孵育透明，以熱石蠟包埋成塊后固定在切片機中進行病理切片，二甲苯孵育脫蠟、100%、95%、90%、80%梯度乙醇水化，參照HE試劑盒說明書進行HE染色后漂洗、脫水、透明、封片，采用光學顯微鏡觀察海馬神經元形態。

1.2.4 大鼠腦組織IL-6、TNF-α水平檢測 取出1.2.2中的腦組織蛋白樣品液，冰水浴中緩慢解凍后采用ELISA試劑盒檢測IL-6、TNF-α水平，參照說明書操作。

1.2.5 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測大鼠腦組織RAS/RAF通路相關蛋白表達 將1.2.4中剩余的各組蛋白樣品液根據1.2.2將濃度調至相同后，取20 μL，采用電泳分離蛋白，之后通過濕轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，室溫孵育5%脫脂奶粉溶液2 h，兔源GAPDH、RAS、RAF、p-RAF、ERK1/2、p-ERK1/2一抗4℃孵育過夜，稀釋比例分別為1∶2 000、1∶2 000、1∶5 000、1∶2 000、1∶5 000、1∶2 000，TBST漂洗3次后以羊抗兔二抗室溫孵育2 h，稀釋比例為1∶2 000，TBST漂洗3次后化學發光法顯色，以Quantity One軟件分析量化各組蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 秦艽提取物對大鼠神經功能的影響 模型組與假手術組比較，大鼠神經功能缺損評分升高，差異有統計學意義(P<0.05)。秦艽各劑量組、尼莫地平組較模型組大鼠神經功能缺損評分降低，且秦艽各劑量組呈劑量依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)；秦艽高劑量組與尼莫地平組大鼠神經功能缺損評分比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組神經功能缺損評分比較(±s) 單位：分

2.2 秦艽提取物對大鼠腦梗死的影響 與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死面積增加，差異有統計學意義(P<0.05)。秦艽各劑量組、尼莫地平組較模型組大鼠腦梗死面積減小，且秦艽各劑量組呈劑量依賴性，差異均有統計學意義(P<0.05)；秦艽高劑量組與尼莫地平組大鼠腦梗死面積比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖1、表2。

圖1 各組大鼠腦組織TTC染色結果

表2 各組大鼠腦梗死面積比較(±s) 單位：%

2.3 秦艽提取物對大鼠海馬神經元的影響 假手術組大鼠海馬神經元無病理損傷。模型組大鼠海馬神經元皺縮壞死、分布散亂、數量減少，呈嚴重的病理損傷；秦艽各劑量組、尼莫地平組較模型組大鼠海馬神經元病理損傷減輕，且病理損傷程度隨著秦艽劑量增加而減輕；秦艽高劑量組與尼莫地平組海馬神經元病理損傷程度無明顯差異。詳見圖2。

圖2 各組大鼠腦組織海馬神經元ca1區HE染色圖(×200)

2.4 秦艽提取物對大鼠腦組織TNF-α、IL-6含量的影響 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織TNF-α、IL-6含量升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。秦艽各劑量組、尼莫地平組較模型組大鼠腦組織TNF-α、IL-6含量降低，且秦艽各劑量組呈劑量依賴性，差異均有統計學意義(P<0.05)；秦艽高劑量組與尼莫地平組腦組織TNF-α、IL-6含量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠腦組織TNF-α、IL-6含量比較(±s，n=12) 單位：pg/g

2.5 秦艽提取物對大鼠腦組織RAS/RAF通路相關蛋白表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織RAS/RAF通路相關蛋白RAS表達水平、p-RAF/RAF、p-ERK1/2/ERK1/2升高，差異有統計學意義(P<0.05)。秦艽各劑量組、尼莫地平組較模型組大鼠腦組織RAS表達水平、p-RAF/RAF、p-ERK1/2/ERK1/2水平降低，且秦艽各劑量組呈劑量依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)；秦艽高劑量組與尼莫地平組大鼠腦組織RAS表達水平、p-RAF/RAF、p-ERK1/2/ERK1/2水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖3、表4。

圖3 各組大鼠腦組織RAS/RAF通路相關蛋白條帶圖(A為假手術組；B為模型組；C為秦艽低劑量組；D為秦艽中劑量組；E為秦艽高劑量組；F為尼莫地平組)

3 討 論

近年來，腦卒中發病率呈升高趨勢，治療窗口期短，預后差，多數病人喪失活動及語言功能，引發偏癱等神經功能障礙，極大影響病人的身心健康，造成沉重的經濟負擔[13]。腦卒中病人血栓形成后，腦組織缺血缺氧及血液再灌注促使TNF-α、IL-6等促炎因子大量合成，誘發炎癥，致使神經細胞壞死、凋亡，是造成腦卒中病人腦損傷及神經功能障礙的主要致病機制[14]。本研究以大腦中動脈線栓法建立腦缺血再灌注模型，結果顯示，相較于假手術組，造模大鼠海馬神經元數量減少，分布散亂且皺縮壞死，表現為嚴重的病理損傷，且神經功能缺損評分、腦梗死面積、腦組織IL-6、TNF-α水平均升高，表明造模大鼠腦內促炎因子大量合成分泌，引發神經炎癥，致使海馬神經細胞凋亡，損傷大鼠神經功能，提示腦缺血再灌注模型建立成功。

中醫學稱腦卒中為中風，機體正氣虧虛、外風入侵、耗傷正氣、筋脈阻滯不通是發病機制。秦艽有祛風除濕、舒筋活血的功效，可減少機體自由基，降低氧化應激水平，抑制炎癥，改善風濕關節炎癥狀，并對腦卒中后上肢痙攣性癱瘓具有較好的療效[15-17]，但具體的作用機制尚未明確。RAS/RAF是機體調控炎癥反應的重要通路，RAS蛋白在細胞外信號刺激下，可磷酸化激活RAF，進而促使ERK磷酸化，引起炎性因子合成分泌增加，誘發炎癥，降低RAS表達，減弱RAF、ERK磷酸化水平，抑制星形膠質細胞激活和炎癥發生發展，進而減少神經細胞凋亡，改善神經功能缺損，緩解腦損傷[18-20]，因而推測秦艽改善腦卒中后腦損傷及神經功能障礙的作用機制可能是下調RAS/RAF信號。

本研究采用秦艽提取物處理腦缺血再灌注模型大鼠，結果顯示，相較于模型組，秦艽各劑量組大鼠神經功能缺損評分、腦梗死面積、腦組織IL-6和TNF-α水平、RAS/RAF通路相關蛋白RAS表達水平、p-RAF/RAF、p-ERK1/2/ERK1/2均降低，海馬神經元病理損傷均減輕，且秦艽各劑量組呈劑量依賴性，表明秦艽提取物可下調RAS/RAF信號表達，減少促炎因子合成，抑制炎性反應，減小腦缺血再灌注大鼠腦梗死面積，減輕海馬神經元損傷，修復神經功能障礙。

綜上所述，秦艽提取物可抑制腦缺血再灌注后大腦炎癥反應，減輕海馬神經細胞損傷，改善大鼠神經功能障礙，抑制RAS/RAF信號通路傳導可能是其作用機制。本研究為秦艽應用于腦卒中的臨床治療提供了實驗依據，但未深入探討藥理機制，未采用RAS/RAF通路抑制劑和激活劑進行對照驗證，今后需進一步深入研究。