中藥復方調控GRP78、CHOP改善代謝綜合征大鼠內質網應激的實驗研究

黃理安，黃孝靜，羅保平

代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)是以中心性肥胖、脂代謝異常、高尿酸、高血壓為主要特征，胰島素抵抗為共同的病理生理基礎，多種物質代謝異常的一組復雜證候群，是1型糖尿病和心腦血管疾病的代謝性危險因素，但病因和發病機制尚未明確[1]。MS主要臨床表現為肥胖、高血壓、胰島素抵抗等靶器官損傷[2]，這些心血管危險因素聚集表現為對腎臟損害有協同作用[3]，腎臟損傷的臨床表現為腎小球濾過率高，尿清蛋白排泄率增加，腎小管功能改變[4-5]。中醫學認為，腎藏精，精血互生，以養肝木，疏肝理氣；腎精不足，陰虛陽亢，以致肝失疏泄，氣化失司，中焦氣機壅滯，運化失常，加重體內痰濕，導致肥胖及血脂紊亂更甚[6]。因此，MS不僅導致心血管事件發生危險增加，同時損害腎臟，腎臟損害又反之加重MS的心血管并發癥，因此，腎臟損害的早期發現和治療應受到高度重視[7]。

臨床治療MS的原則以逆轉糖代謝異常、脂代謝紊亂、高血壓、胰島素抵抗、降低心血管風險等為主，常用的藥物以西藥居多，但治療時常出現副作用：西布曲明可能導致神經性厭食癥，奧利司他可能導致脂溶性維生素缺失，噻嗪類利尿劑可能誘發胰島素抵抗從而升高血糖及三酰甘油水平，導致電解質紊亂，β受體阻滯劑可能抑制胰島素分泌而誘發糖尿病。由于該病的影響因素較多，使療效難以滿意。中藥復方對MS的防治已廣泛應用于臨床[8]。小檗堿作為常用藥物的主要有效成分，可發揮提高胰島敏感性、降低血糖、改善脂質紊亂的作用[9]。內質網(endoplasmic reticulum，ER)是真核細胞中一種重要的亞細胞器，主要功能為調節蛋白質的合成、折疊、運輸及修飾，當某些錯誤折疊蛋白的積聚引起內質網一系列功能的紊亂，稱為內質網應激，是MS腎損害的重要發病機制之一[10]。葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)、內質網應激蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)參與了這一病理過程[11]，血尿酸(blood uric acid，UA)與MS腎損害密切相關[12]。本研究觀察中藥復方對MS大鼠空腹胰島素(FINS)水平、血脂含量、血UA及腎小管組織GRP78、CHOP表達的影響，以期為臨床診治MS大鼠腎損傷提供理論依據和實驗參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗藥品 中藥復方：黃連15 g，黃芪20 g，地黃10 g，五味子10 g，蒼術15 g，茯苓15 g，麥冬10 g，共95 g，飲片均由江中飲片廠生產，制成粗粉，與適量水煮沸30 min，粗濾，反復3次，濾液合并濃縮至30 mL，稀釋至0.2 g/mL水煎液備用。小檗堿溶液：精密稱取鹽酸小檗堿，以甲醇溶解并稀釋制成0.04 μg/mL標準溶液備用。

1.1.2 實驗動物 2月齡Wistar大鼠80只，飼養于動物中心清潔級動物室，體質量160～180 g，實驗動物使用許可證編號：SYXK(鄂)2017-0067，由湖北中醫藥大學實驗動物倫理委員會同意批準實施。實驗過程嚴格遵循3R原則給予實驗動物人道關懷照顧。

1.1.3 實驗試劑 果糖(Amres-co，美國)；鹽酸小檗堿(北京中新制藥廠，國藥準字H11020962)；鼠抗GRP78多抗(novus，貨號：H00003309-A01)；兔抗CHOP mAb(Sino Biolgical，美國)；山羊抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多抗(Sino Biolgical，美國)。

1.1.4 實驗儀器 小動物無創血壓測量儀購自上海欣軟科技有限公司；AU2700全自動生化分析儀購自日本Olympus公司；SMZ645型光學顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型建立 將80只2月齡Wistar大鼠隨機分為對照組、模型組、中藥組、小檗堿組，每組20只。適應性飼養1周，對照組予以普通飲食及飲用凈化自來水，其余大鼠用10%果糖水代替正常飲水，持續8周。8周后應用兩因素重復測量方差分析，對血脂、血壓及空腹胰島素水平差異有統計學意義的造模大鼠，認為造模成功。用藥劑量根據《藥理實驗方法學》[12]中按“人與動物體表面積折算”，中藥組以中藥復方1.0 g/(kg·d)灌胃，每日1次；小檗堿組以小檗堿100 mg/(kg·d)灌胃，每日1次；對照組及模型組予以等體積生理鹽水灌胃，持續8周。干預8周后測量各組大鼠生化指標、胰島功能、血壓水平。

1.2.2 大鼠尾動脈收縮壓測定 各組大鼠第2周開始于清醒、安靜狀態下，采用無創血壓測量儀，測量清醒狀態下大鼠尾動脈收縮壓。

1.2.3 血清指標檢測 實驗結束后，大鼠禁食12 h，麻醉后腹主動脈取血，采用酶比色法測定血清三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、UA和空腹血糖(FBG)含量；放射免疫法測定血清FINS水平。

1.2.4 樣本收集 斷頸處死各組大鼠，留取血液樣本，取一側腎臟，部分置于10%多聚甲醛中固定，-80 ℃冰箱保存。

1.2.5 腎臟組織病理學檢查 腎臟組織經10%甲醛固定，乙醇脫水，石蠟包埋后，制成3 μm的石蠟切片，進行蘇木精、糖原(PAS)染色，光學顯微鏡下觀察各組腎臟微細結構變化。

1.2.6 實時定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測GRP78、CHOP的mRNA表達水平 取冷凍的腎臟，用預冷的裂解液進行組織勻漿，離心收集上清液，依次加入三氯甲烷及異丙醇進行萃取，萃取后離心得到RNA沉淀，之后用75%乙醇洗滌2次后晾干，加入DEPC水溶解得到RNA溶液，按照反轉錄試劑盒操作方法將其合成為cDNA。依據設計的GRP78、CHOP引物，采用RT-PCR試劑盒及基因特異性引物進行反應，根據反應曲線計算mRNA表達量，以GAPDH為內參，以各條帶光密度與GAPDH條帶的比值作為相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結 果

2.1 各組大鼠生化指標及收縮壓比較 與對照組大鼠比較，模型組大鼠FBG、FINS、TG、TC、收縮壓、BUN及Scr水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，中藥組和小檗堿組生化指標及收縮壓均有不同程度下降，且中藥組下降程度更顯著(P<0.05)。詳見表2。

2.2 各組大鼠腎臟微細結構變化 與對照組比較，模型組大鼠腎小球局灶節段性系膜基質增多，腎小管上皮細胞腫脹，內質網減少；中藥組、小檗堿組大鼠腎組織病理改變均較模型組輕微，其中中藥組大鼠僅見輕度系膜細胞增生和基質增多，腎小管炎性細胞浸潤基本消失；小檗堿組大鼠腎組織病理僅見少量系膜細胞增生。詳見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織形態結構(HE染色，×400)

2.3 各組大鼠腎組織GRP78、CHOP mRNA表達水平比較 模型組GRP78、CHOP mRNA表達高于對照組(P<0.01)；與模型組相比，中藥組和小檗堿組GRP78、CHOP mRNA表達減少(P<0.05)，且中藥組表達少于小檗堿組(P<0.05)。詳見圖2、表3。

圖2 各組大鼠腎組織GRP78、CHOP mRNA表達條帶圖

表3 各組大鼠腎組織GRP78、CHOP mRNA表達水平比較(±s)

3 討 論

有研究顯示，MS作為一種代謝性疾病，其發病率及致死率均逐步升高，威脅我國人民的健康[13]。目前治療MS無標準指南，臨床主要是針對各項危險因素進行有效干預。中醫學以預防腎損害為主，充分體現了未病先防、既病防變的治未病思想和理念。中醫藥治療或改善MS諸癥，取得了一定的療效，相關中藥復方和活性成分的研究和新藥開發取得了一定程度的進展[14]。有研究顯示，從黃連中提取出的小檗堿通過降糖、降脂、糾正代謝紊亂等改善胰島素抵抗，達到防治MS的目的，黃連中的多種復合成分針對MS的多靶點治療優于小檗堿已被證實[15]。有研究通過超高效液相色譜-電噴霧電離-四極桿飛行時間質譜技術探討黃芪湯中的潛在活性成分，鑒定出了17種提示腎病綜合征的生物標志物，同時，篩選出治療腎病綜合征的活性成分，如芬芳因G加氫、粉防己堿、芳膽堿、甘草酸等[16]，中藥復方在治療MS中發揮了重要作用。

本研究結果顯示，中藥復方、小檗堿均能降低MS大鼠FBG、FINS、TG、TC、收縮壓、BUN、UA及Scr水平，其中，中藥組各指標水平降低更顯著；顯微鏡觀察可見中藥組大鼠腎組織病理改變較MS大鼠顯著改善，說明中藥復方對減輕MS大鼠的腎損害有確切的療效。GRP78在緩解內質網應激方面發揮著重要的作用，GRP78表達上調具有內質網應激特異性，可作為內質網應激的標志性因子[17]。早期研究發現，以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)腹腔注射引起正常小鼠腎臟內質網應激，并導致腎臟功能損害，而CHOP mRNA敲除小鼠存在嚴重的腎臟損害[18]。因此，推測腎功能損害與內質網應激引起的CHOP有關，CHOP是介導內質網應激所致細胞損傷的重要轉錄因子[19]。本研究結果顯示，與模型組比較，中藥組、小檗堿組大鼠腎組織GRP78及CHOP mRNA表達均有不同程度減少，其中，中藥組兩種基因表達減弱顯著，接近對照組大鼠。為此提出假說，中藥復方可能通過調節GRP78及CHOP基因的表達而作用于內質網應激反應，以此減輕MS誘導的內質網應激腎臟細胞損傷而發揮作用。分析原因可能與中藥復方的藥理作用有關。詹玫琦等[20]實驗研究顯示，黃連可改善大鼠糖脂代謝紊亂，降低血糖和血脂及內質網應激GRP78、CHOP蛋白的表達。Zhou等[21]研究證實，黃連堿通過抑制內質網應激和氧化應激，減輕內皮功能障礙，改善血管功能，從而減輕細胞損傷。張曉鳳等[22-23]研究發現，黃芪甲苷可降低高糖誘導的GRP78、CHOP高表達，抑制H9c2細胞內質網應激，緩解CHOP介導的細胞過度凋亡，從而改善MS誘導的大鼠腎臟細胞凋亡。藥理研究發現，地黃具有抗氧化、抗凋亡等作用，其有效成分可抑制內質網應激，減少細胞損傷[24-25]。Cheng等[26-27]研究顯示，采用不同濃度的五味子乙素干預后，細胞相對存活率升高，且GRP78、CHOP水平降低，提示五味子乙素通過抑制內質網應激減輕細胞損傷。王清華等[28]研究顯示，蒼術可減輕細胞炎性水腫，降低細胞上清液中炎性細胞介質含量和細胞內GRP78高表達，抑制細胞內質網應激。多項研究顯示，茯苓的有效成分如茯苓多糖、茯苓酸等均可抑制細胞內質網應激，減輕炎癥反應[29-30]。細胞實驗顯示，麥冬皂苷D可降低內質網應激，對細胞發揮保護作用[31]。

中藥復方治療MS所致腎損害，調節GRP78及CHOP基因的表達，有可能成為干預和治療MS的有效措施，為MS腎損害的治療提供新思路和新方法。