兩個遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系分析

姜俊宇 金先富 蘇正仙 蔡昀達(dá) 陳超超 應(yīng)瀟穎 畢曉潔

遺傳性異常纖維蛋白原血癥（congenital dysfibrinogenemia,CD）是一種罕見的常染色體顯性或共顯性遺傳性疾病，發(fā)病率約為1/100萬，臨床表現(xiàn)多樣[1-2]。Undas等[3]發(fā)現(xiàn)，有約20%的CD患者有血栓形成傾向，25%患者有不同程度的出血表現(xiàn)，其余患者無明顯癥狀，僅表現(xiàn)為凝血功能異常。CD患者的出血表型通常為輕型，一般出血輕微且無嚴(yán)重后果，但當(dāng)患者為育齡婦女或發(fā)生嚴(yán)重外傷等情況時應(yīng)引起注意，應(yīng)采取監(jiān)測并及時干預(yù)以避免發(fā)生出血不止的情況[4]。某些Fib變體明顯增加了血栓形成的風(fēng)險，從而導(dǎo)致年輕的CD致病基因攜帶者有很強(qiáng)的陽性家族史和血栓形成事件的發(fā)生[5]。由于CD極為罕見且癥狀多變，臨床上易發(fā)生誤診和漏診。本研究對兩個CD家系的突變基因進(jìn)行擴(kuò)增并測序，分析分子遺傳學(xué)特征和臨床表現(xiàn)的關(guān)系，預(yù)測并鑒定基因突變對Fib結(jié)構(gòu)和功能的影響，初步探討該病的分子發(fā)病機(jī)制，以期提高臨床醫(yī)生對CD的認(rèn)知和診療水平，為CD患者的預(yù)防和治療提供更好的幫助。

1 資料和方法

1.1 患者家系資料 家系1：患者男，52歲，浙江臺州人，突發(fā)言語障礙，不能表達(dá)，經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺州醫(yī)院凝血功能檢查示纖維蛋白原活性（fibrinogen activity,Fa）為0.63 g/L，TT為26.6 s；頭顱CT檢查示“左側(cè)額葉低密度影”，頭顱CT血管成像檢查示“左側(cè)大腦中動脈局部管腔中重度狹窄”，診斷考慮為腦梗死、凝血功能異常。該患者肝腎功能正常，血脂指標(biāo)正常，無明顯出、凝血表現(xiàn)；其姐姐存在相同的實驗室檢測結(jié)果異常，其他家系成員檢測均正常。家系2：患者女，2歲，浙江臺州人，經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺州醫(yī)院健康體檢凝血功能常規(guī)檢查示Fa為0.61 g/L，TT為34.6 s；生化指標(biāo)提示肝腎功能正常，Hb指標(biāo)正常，無明顯出、凝血癥狀，否認(rèn)使用抗凝和降Fib藥物。其父親和祖父存在相同的實驗室檢測結(jié)果異常，其他家系成員檢測均正常。兩個家系的家系圖見圖1。

圖1 遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系圖（a：家系1；b：家系2）

1.2 健康對照組資料 收集200名健康成人和30名健康兒童體檢者凝血常規(guī)檢查結(jié)果作為正常對照，其中成年男性87名、成年女性113名，中位年齡36（20，59）歲；男性兒童14名、女性兒童16名，中位年齡2（1，4）歲。230名受試者均無血栓或出血史，無肝腎功能疾病，所有試驗血樣均在受試者知情同意后采集。

1.3 標(biāo)本處理 采集兩個家系成員足量外周靜脈血，按1∶9體積比加入到0.109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝管中，即刻充分混勻，3 000 r/min離心10 min。取上層抗凝血漿用于凝血功能常規(guī)指標(biāo)檢測，2 h內(nèi)檢測完畢；取下層全血細(xì)胞提取DNA，置于-40℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 凝血指標(biāo)檢測 采用凝固法測定所有標(biāo)本的PT、APTT、TT，采用免疫比濁法測定D-二聚體（D-dimer,D-D）、纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物（fibrinogen and fibrin degradation products,FDPs）水平，采用Clauss法測定Fa水平（法國STAGO STA-R MAX全自動血凝儀），所有檢測步驟均嚴(yán)格遵守試劑（法國STAGO）說明書進(jìn)行；采用PT演算法測定所有標(biāo)本Fib（抗原）水平（日本Sysmex公司CS-5100全自動血凝儀），所有檢測步驟均嚴(yán)格遵守試劑（德國Siemens）說明書進(jìn)行。

1.5 全血DNA提取與序列擴(kuò)增 按照DNA提取試劑盒（上海西塘公司）提取先證者及其家系全血DNA，使用核酸定量分析儀檢測提取的DNA含量和純度。根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]設(shè)計PCR反應(yīng)步驟：反應(yīng)總體積為25.0 μl，其中 PCR MaserMix 12.5 μl，雙蒸水7.5 μl，上、下游引物各1.0 μl，DNA模板3.0 μl。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，56～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；30個循環(huán)后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后送往華大基因公司測序。采用Chromas軟件將測序結(jié)果與美國GenBank所公布的Fib 3個基因FGA、FGB和FGG序列進(jìn)行比對，尋找送檢標(biāo)本的基因突變位點，發(fā)現(xiàn)突變后進(jìn)行反向測序確認(rèn)。

1.6 生物信息學(xué)與蛋白空間構(gòu)型分析 采用Polymorphism Phenotyping v2（蛋白質(zhì)ID:P02679）和 Mutation Taster（蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄本ID:ENST00000404648）生物信息學(xué)在線預(yù)測突變對Fib蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響；采用PyMOL軟件對Fib進(jìn)行空間模型構(gòu)建，分析突變前后Fib蛋白空間結(jié)構(gòu)、氫鍵數(shù)量發(fā)生的改變。

2 結(jié)果

2.1 先證者及其家系成員凝血功能檢測結(jié)果 家系1先證者及其姐姐Fa顯著下降，F(xiàn)ib正常，PT、TT均略高于正常范圍，APTT、D-D、FDPs均在正常范圍內(nèi)；家系2先證者及其父親、祖父Fa顯著下降，F(xiàn)ib稍低于正常值或正常，PT、APTT、TT均略高于正常范圍，D-D、FDPs均在正常范圍內(nèi)。其他家系成員的凝血功能實驗室結(jié)果均為正常。具體凝血功能測定結(jié)果見表1和表2。

表1 家系1先證者及家系成員凝血功能檢測結(jié)果

表2 家系2先證者及家系成員凝血功能檢測結(jié)果

2.2 基因檢測結(jié)果 家系1先證者及其姐姐FGG基因第8外顯子952位發(fā)生G＞A（c.952G＞A）雜合突變，導(dǎo)致292位甘氨酸突變?yōu)樯彼幔℅ly292Ser）。家系2先證者及其父親和祖父FGG基因第8外顯子902位發(fā)生G＞A（c.902G＞A）雜合突變，導(dǎo)致275位精氨酸突變?yōu)榻M氨酸（Arg275His）。測序結(jié)果見圖2（插頁）。

圖2 兩個家系突變和正常FGG基因測序圖（a：家系1先證者及姐姐FGG基因存在c.952G＞A雜合突變，箭頭示突變位點；b：家系1正常基因序列；c：家系2先證者及父親和祖父FGG基因存在c.902G＞A雜合突變，箭頭示突變位點；d：家系2正常基因序列）

2.3 生物信息學(xué)與蛋白空間構(gòu)型分析結(jié)果 生物信息學(xué)預(yù)測后發(fā)現(xiàn)，兩個家系中發(fā)生突變的Polymorphism Phenotyping v2積分均顯示 1.00，“PROBABLY DAMAGING”、MutationTaster積分均為0.999 9，預(yù)測結(jié)果為“disease causing”；兩種軟件均提示Gly292Ser和Arg275His為致病突變。空間構(gòu)型分析發(fā)現(xiàn)，家系1中292位甘氨酸突變?yōu)樯彼幔簧彼崤c周圍氨基酸形成的氫鍵數(shù)量較突變前增加，蛋白結(jié)構(gòu)的空間穩(wěn)定性發(fā)生改變。家系2中275位精氨酸突變?yōu)榻M氨酸，與周圍氨基酸的氫鍵數(shù)量減少，影響所形成的Fib穩(wěn)定性。兩個家系Fib蛋白空間構(gòu)型見圖3（插頁）。

圖3 兩個家系正常和突變Fig蛋白空間構(gòu)型對比圖（a：正常Fig蛋白空間構(gòu)型，γ肽鏈292位Gly與周邊氨基酸及水分子共形成1個氫鍵結(jié)構(gòu)；b：家系1突變蛋白空間構(gòu)型，γ肽鏈292位Gly突變?yōu)镾er，氫鍵形成個數(shù)為4個；c：正常Fig蛋白空間構(gòu)型，γ肽鏈275位Arg與周邊氨基酸及水分子共形成9個氫鍵結(jié)構(gòu)；d：家系2突變蛋白空間構(gòu)型，γ肽鏈275位Arg突變?yōu)镠is，氫鍵形成個數(shù)為4個）

3 討論

Fib是人體血漿中含量最高的凝血因子，由肝細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成并分泌，分子質(zhì)量約為340 kDa。Fib是由3個獨立基因FGA、FGB、FGG分別編碼的3對肽鏈Aα、Bβ和γ通過二硫鍵連接而成的二聚體糖蛋白分子[7-8]。共同凝血途徑中，F(xiàn)ib由凝血酶裂解成可溶性纖維蛋白單體后，在活化凝血十三因子（FⅩⅢa）和鈣離子作用下形成不溶性纖維蛋白單體（fibrin monomer,FM）聚合物，參與人體止血過程[9-10]。CD是指Fib的3個編碼基因中任何一個或者多個基因發(fā)生突變導(dǎo)致人體所合成Fib分子含量和（或）活性異常的一種遺傳性疾病，突變最常發(fā)生于FGG基因，其次是FGA和FGB基因[11-12]，本研究中兩個家系的突變位點均位于FGG基因，可見FGG是該病基因突變的好發(fā)區(qū)。

目前國內(nèi)外尚無統(tǒng)一的CD診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]。周偉杰等[14]認(rèn)為大多數(shù)CD患者無明顯癥狀，少數(shù)可出現(xiàn)輕度出血和（或）血栓形成；凝血功能檢查提示Fa明顯下降，F(xiàn)ib正常或稍低，F(xiàn)a/Fib＜0.70，生化指標(biāo)提示肝腎功能正常，Hb正常；對CD患者家系調(diào)查可知，絕大多數(shù)CD患者為常染色體顯性遺傳[15-16]，具有相同突變的患者及家系成員均存在類似的凝血功能異常檢測結(jié)果；對于可疑的CD患者，研究患者基因突變與出、凝血表現(xiàn)的相關(guān)性，需要進(jìn)行Fib的基因突變檢測。

本研究中，家系1先證者因突發(fā)言語障礙入院，實驗室檢查表現(xiàn)為Fa顯著降低；頭顱影像學(xué)檢查提示腦梗死，患者平時體健，既往無明顯出血或血栓癥狀。對該先證者家系基因測序后發(fā)現(xiàn)其FGG基因存在Gly292Ser錯義突變，Downes等[17]在1名血栓性疾病患者上發(fā)現(xiàn)該突變，國內(nèi)還未有此突變的相關(guān)報道。Clinvar數(shù)據(jù)庫收錄該變異位點為臨床意義未明[Variation ID：627185]，不同生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測均提示Gly292Ser具有致病性。Fib蛋白模型分析發(fā)現(xiàn)，Gly292Ser引起292位甘氨酸與周邊氨基酸的氫鍵個數(shù)增多，使蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性發(fā)生改變。綜合以上分析，在沒有任何明確病因引起該先證者腦梗死的情況下，其突發(fā)疾病可能與Gly292Ser存在一定程度的關(guān)聯(lián)，具體機(jī)制有待后續(xù)進(jìn)一步研究證實。家系2先證者為健康體檢的2歲女童，僅表現(xiàn)為不明原因Fa顯著降低，其父親在后續(xù)調(diào)查中檢測出相同的Fa結(jié)果。基因測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，家系2先證者FGG基因c.902G＞A改變，導(dǎo)致精氨酸被組氨酸替換，即Arg275His；而研究認(rèn)為該突變是一個突變熱點[18-20]，生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測均提示Arg275His錯義突變具有致病性。同時進(jìn)行的Fib蛋白模型分析也證實Arg275His引起275位組氨酸與周邊氨基酸的氫鍵數(shù)量減少，蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性下降。與野生型（γ275Arg）相比，Arg275His導(dǎo)致Fib纖維分支增加，影響凝血酶催化纖維蛋白聚合過程中D-D的相互作用，從而破壞共同凝血途徑中纖維蛋白束和纖維蛋白凝塊的形成[21]。多數(shù)患者FGG基因Arg275His雜合突變可無任何癥狀，少數(shù)可出現(xiàn)出血或血栓等癥狀[6，22]。

CD臨床表現(xiàn)差異巨大，不同突變位點、不同患者均可出現(xiàn)不同的臨床表現(xiàn)。本研究中兩個家系先證者均存在FGG基因突變，但是臨床表現(xiàn)不盡相同。家系1先證者及其姐姐均存在FGG基因c.952G＞A改變，先證者在無任何誘因下突發(fā)腦梗死，治療好轉(zhuǎn)數(shù)月后，再次發(fā)生輕度言語障礙入院，頭顱影像學(xué)提示腦部出現(xiàn)新發(fā)血栓，此突變在國內(nèi)尚屬首次發(fā)現(xiàn)，在國外也鮮有相關(guān)文章對該位點突變展開研究分析，因此具體臨床意義尚未明了。鑒于先證者反復(fù)發(fā)生腦梗死，醫(yī)生建議其長期規(guī)范抗凝治療，同時密切關(guān)注抗凝引起的出血風(fēng)險，必要時補(bǔ)充Fib。值得注意的是，先證者姐姐并沒有類似臨床癥狀，考慮到該家系存在一定血栓風(fēng)險，醫(yī)生做出清淡飲食、定期體檢的臨床建議。家系2先證者及其父親均存在FGG基因c.902G＞A改變，但均無出、凝血病史，醫(yī)生建議不做特殊治療處理，優(yōu)先采取臨床觀察措施，并叮囑先證者及其家屬提高安全意識，避免發(fā)生較大面積創(chuàng)傷等。

綜上所述，CD目前尚無臨床治療指南，突變位點多樣且表現(xiàn)因人而異，因此，在CD的臨床治療中，應(yīng)完善患者Fib的基因分析，更好地評估其表型，根據(jù)其個人史、家族史、基因型等選擇最佳臨床治療方案，給予患者個體化的治療手段[23]。