瑞安市腹瀉患者沙門菌耐藥性和分子分型研究

李娜 周邦瑤 蘇海珍 胡玉琴 葉環環 劉敏芝 李毅

沙門菌可引起人類腸道傳染病和傷寒、副傷寒病癥，亦可使家禽、畜類致病，是一種人畜共患病的病原體。在中國乃至世界各地，非傷寒沙門菌是引起人類食源性疾病、造成重大經濟損失的重要元兇[1-2]。Majowicz等[3]估計，全球每年約有9 380萬例沙門菌感染患者，病死15.5萬例，其中8 030萬病例來源于食源性感染。沙門菌血清型眾多，全球范圍內已經鑒定出的沙門菌血清型多達2 500個[4]。不同血清型沙門菌遺傳表型不同，這為確定感染源及臨床控制感染造成一定難度。本研究收集瑞安市人民醫院2016—2019年從腹瀉患者中分離到的沙門菌，通過血清型鑒定和藥物敏感性分析，了解瑞安市沙門菌的血清型分布和耐藥性的總體概況，為臨床科學用藥提供實驗室參考數據；并利用脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis,PFGE）技術分析沙門菌分子分型，為細菌溯源提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 2016—2019年從瑞安市人民醫院腹瀉患者中分離到沙門菌共134株，其中2株分離自血液，其余132株分離自糞便。

1.2 主要試劑 沙門菌血清誘導瓊脂（批號：295652149）和沙門菌血清套裝（規格：1 ml，60支/盒，批號：K60V-50）購自丹麥SSI公司。藥敏紙片及MH瓊脂（批號：2487022）購自英國OXOID公司。14種藥敏紙片分別為氨芐西林（批號：2858417），阿莫西林/克拉維酸2∶1（批號：2491412），頭孢他啶（批號：2912216），頭孢噻肟（批號：2518697），頭孢吡肟（批號：2836423），亞胺培南（批號：2897217），氨曲南（批號：2518702），萘啶酸（批號：2492578），環丙沙星（批號：2539801），磺胺異惡唑（批號：2984526），甲氧芐啶（批號：2538102），復方新諾明（批號：2518734），四環素（批號：2525329），氯霉素（批號：2506047）。Xba I核酸內切酶（批號：AGZ0057A）購自寶生物工程（大連）有限公司，蛋白酶K（批號：812KA0961）購自上海生工生物工程有限公司。使用法國梅里埃VITEK-2全自動生化鑒定系統，美國Bio-Rad公司CHEF-Mapper?XA脈沖場凝膠電泳儀及Gel XR凝膠成像儀。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定及血清學分型 按照國家標準《食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4-2016）對菌株進行鑒定與血清凝集試驗。依據《White-Kauffmann-Leminor抗原表（第9版）》和《沙門菌屬血清型診斷》確定血清型[4]。

1.3.2 藥物敏感性檢測 采用K-B紙片法，根據美國臨床實驗室標準化協會（clinical and laboratory standards institute,CLSI）藥敏試驗標準 M-100（2019）[5]判定藥敏結果。以氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸2:1、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、亞胺培南、氨曲南、萘啶酸、環丙沙星、磺胺異惡唑、甲氧芐啶、復方新諾明、四環素、氯霉素等14種藥物作為實驗抗菌藥物。以大腸埃希菌ATCC25922為質控菌株。

1.3.3 PFGE分子分型 隨機選取部分菌株，參照國家食源性致病菌病原細菌分子分型監測網絡（PulseNet）中沙門菌PFGE分型的標準操作方法進行。將新鮮菌株懸浮于盛有1 ml細胞懸液的Falcon 2054管，調整細菌密度，使吸光度值為4.0～4.2。取400 μl上述細菌菌懸液于1.5 ml離心管中，加入20 μl蛋白酶K（20 g/L），混勻，加入400 μl SeaKem Gold瓊脂糖混勻，將上述混合物加入加樣孔內，待膠塊凝固后，加入25 μl蛋白酶K（20 g/L）的裂解液裂解細菌2 h。加入45 U XbaⅠ酶，37℃酶切3 h，以布倫登盧普沙門菌菌株H9812作為分子質量標準。脈沖場凝膠電泳條件：6.0 V/cm，2.16～63.8 S，19 h，電泳結束后，用Gel Red染色并用純水脫色。采用凝膠成像儀獲取圖像，并轉換成TIFF圖像格式。用BioNumerics 7.5軟件對PFGE結果進行分析，用非加權配對算術平均法（unweighted pair group average method,UPGMA）進行聚類，構建聚類樹。

1.4 統計學處理 使用SPSS19.0統計軟件。計數資料采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 沙門菌菌株來源的人群分布 134株菌株來源人群中，最小年齡＜1歲，最大年齡為87歲。5歲以下嬰幼兒25人，占18.7%，5～12歲6人，13～20歲7人，21～40歲36人，41～60歲43人，＞60歲17人。男性83人，占61.9%，女性51人。其中0～2歲的嬰幼兒達21人。

2.2 沙門菌血清型分布 134株沙門菌分別分布在B群、C1群、C2群、C3群、D1群、E1群和E4群，共24個血清型，占比最大的是鼠傷寒沙門菌，有52株，占38.8%，腸炎沙門菌31株，占23.1%，倫敦沙門菌13株，占9.7%，見表1。來自0～12歲兒童的菌株有31株，其中鼠傷寒沙門菌21株，占67.7%，腸炎沙門菌2株，占6.5%；來自21～60歲組的菌株有79株，其中鼠傷寒沙門菌19株，占24.1%，腸炎沙門菌25株，占31.6%。隨著年齡增高，鼠傷寒沙門菌的占比呈降低趨勢，＞60歲組中，鼠傷寒沙門菌占比再次升高，見圖1。≤12歲組和＞60歲組中，鼠傷寒沙門菌占比遠高于腸炎沙門菌；在21～60歲中青年組，腸炎沙門菌占比稍高于鼠傷寒沙門菌?！?2歲組和21～60歲組的血清型分布比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表1 134株沙門菌血清型分布情況

圖1 各年齡組血清型占比

表2 134株沙門菌血清型分布情況

2.3 沙門菌藥敏試驗 134株沙門菌對氨芐西林的耐藥率最高，達73.1%；其次為磺胺異惡唑、四環素和萘啶酸，耐藥率分別為62.7%、56.0%和53.0%。復方新諾明的耐藥率為32.8%。對環丙沙星耐藥的菌株有13株，占9.7%，中介菌株有84株，占62.7%，敏感菌株37株，僅占27.6%。沙門菌對阿莫西林/克拉維酸2∶1、頭孢他啶、亞胺培南、氨曲南具有較高的敏感性，耐藥率均＜10.0%。值得注意的是，2016—2019年，沙門菌對環丙沙星的耐藥呈逐年遞增趨勢，如2016年耐藥率為0，2017年為5.6%，2018年為11.5%，至2019年上升為15.8%。多重耐藥菌93株，占69.4%，見表3。

表3 沙門菌對14種抗菌藥物的耐藥率（%）

比較鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌的耐藥性可知，腸炎沙門菌對萘啶酸耐藥率為100%，鼠傷寒沙門菌對萘啶酸耐藥率為48.1%，差異有統計學意義（P＜0.05）。復方新諾明、氯霉素、甲氧芐啶、四環素的耐藥率，鼠傷寒沙門菌高于腸炎沙門菌，差異有統計學意義（P＜0.05）；尤其是對四環素的耐藥率，鼠傷寒沙門菌高達80.8%，而腸炎沙門菌為9.7%。其他9種藥，兩種菌耐藥率差異無統計學意義（P＞0.05）。52株鼠傷沙門菌中，多重耐藥菌株有44株，占84.6%，大多為四環素和氨芐西林耐藥。31株腸炎沙門菌中，多重耐藥菌株有23株，占74.2%，耐藥譜以萘啶酸、氨芐西林、磺胺異惡唑為主，見表4。

表4 鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌耐藥率比較（%）

2.4 PFGE分型結果 隨機選取的40株沙門菌中鼠傷寒沙門菌18株，腸炎沙門菌14株，倫敦沙門菌3株，阿西納沙門菌、山夫登堡沙門菌、利物浦沙門菌、湯卜遜沙門菌、羅森沙門菌各1株。UPGMA聚類顯示大致分為鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、倫敦沙門菌為代表的3個支系，共29種帶型，相似度為63%～100%。其中鼠傷寒沙門菌共16種帶型，腸炎沙門菌共5種帶型，除1株編號為SM167的腸炎沙門菌的帶型與鼠傷寒沙門菌那支相近外，其余13株腸炎沙門菌帶型相似度≥92.7%。3株倫敦沙門菌有3種帶型，見圖2。就菌株耐藥性而言，編號為SM167的腸炎沙門菌對8種抗生素耐藥，其余13株腸炎沙門菌對1～4種抗生素耐藥。聚類在鼠傷寒支系中的阿西納沙門菌、山夫登堡沙門菌和聚類在腸炎支系的利物浦沙門菌，對所有藥物均敏感。編號SM43和SM93，SM44和SM47，具有相同的PFGE帶型，卻表現出不同的耐藥譜。

圖2 40株沙門菌PFGE聚類分析圖譜

3 討論

近幾年研究顯示，沙門菌是中國兒童細菌性腹瀉的主要病原菌[6-7]。2020年全國第七次人口普查結果顯示，瑞安市0～14歲人口占14.52%，15～59歲占69.23%，＞60歲占16.24%。本研究中23.1%的菌株來源人群年齡分布為0～12歲（31人），高于全部人群分布的構成比；其中0～2歲嬰幼兒有21人，占15.7%?？梢妺胗變汉偷妄g兒童是沙門菌的易感人群。相比健康人群攝入大量的非傷寒沙門菌才能引起疾病，一般幼兒和老年人以及慢性疾病患者更易感染，且癥狀嚴重[8]。

本研究分離的沙門菌血清型以鼠傷寒和腸炎沙門菌為主，與上海市和寶雞市的一致[9-10]，而向蓉等[11]和譚南等[12]發現中山市以鼠傷寒沙門菌和斯坦利沙門菌為主，安徽省馬鞍山市以阿貢納沙門菌和腸炎沙門菌為主[13]，均與本研究不同。不同年齡組，沙門菌的血清型構成不同。隨著年齡升高，鼠傷寒沙門菌的占比，呈現降低的趨勢；但在＞60歲組別中，占比又有所回升。本地區12歲以下兒童感染的優勢血清型菌種為鼠傷寒沙門菌，占比高達67.7%，血清型比較單一；21～60歲成年人的感染菌株主要為腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌，其他各血清型共占44.3%，血清型豐富。沙門菌感染是食源性疾病，當人群攝入被沙門菌污染的食品或接觸帶菌動物及其環境，就會引發疾病[14-15]。成年人飲食習慣多樣、飲食結構豐富，與動物接觸機會更多，可能是21～60歲成人組沙門菌血清型豐富的一個重要原因。

本研究發現，鼠傷寒沙門菌對復方新諾明、氯霉素、甲氧芐啶、四環素的耐藥率顯著高于腸炎沙門菌。而對于萘啶酸，31株腸炎沙門菌表現為全部耐藥，顯著高于鼠傷寒沙門菌（48.1%）。提示在研究沙門菌耐藥性時，應注意腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門的菌株數量占比，兩者構成比不同會影響總體耐藥率。一項針對2005—2014年沙門菌耐藥性監測的研究顯示，鼠傷寒沙門菌的耐藥率普遍高于其他血清型[16]；楊翊等[17]研究也顯示，鼠傷寒沙門菌多重耐藥率高于其他血清型，與本研究結果相似。高耐藥株容易在同屬同型菌株之間通過物流、旅游等人口流動發生傳播擴散[18]，提示需加強食品流通環節的監測，控制潛在的食源性爆發。

美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）指出分離自糞便標本的沙門菌，藥敏試驗只需常規試驗氨芐西林、一種氟喹諾酮類和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑并報告[5]。臨床上使用氨芐西林和喹諾酮類治療非傷寒沙門菌感染，可能導致治療失敗。本地區的沙門菌對阿莫西林/克拉維酸2∶1、亞胺培南、氨曲南、頭孢他啶仍具有較高敏感度。CLSI-2019公布的藥敏試驗標準（M-100）指出，除沙門菌屬以外的腸桿菌科細菌對于環丙沙星中介的抑菌圈直徑為22～25 mm，而沙門菌的抑菌圈直徑為21～30 mm[5]。根據這一標準，本研究中多數沙門菌表現對環丙沙星中介。但值得關注的是，2016—2019年，沙門菌對環丙沙星的耐藥率表現逐年上升趨勢。

作為一種成熟且應用極廣的分子分型技術，PFGE通過比較細菌分離株的指紋圖譜，判定菌種間的遺傳親緣關系，被應用到流行病學的溯源研究中。PFGE結果顯示，本地區2016—2019年的鼠傷寒沙門菌在分子水平存在一定程度的分化，而腸炎沙門菌除了1株特殊的分離株之外，其余菌株大多成簇聚類，相似度超過92.7。鼠傷寒沙門菌PFGE條帶相似度很高的菌株，耐藥譜卻存在一定的差異。這可能是因為菌株耐藥基因發生突變的位點并不在Xba I酶切位點上，無法由分型中表現出耐藥性[19]。相比之下，腸炎沙門菌的耐藥譜與PFGE條帶重疊性較高，僅出現耐萘啶酸和氨芐西林的菌株聚類，耐萘啶酸、氨芐西林和磺胺異惡唑的菌株聚類。隨著時間的演變，本地區沙門菌的耐藥情況仍會繼續變化。將全基因組測序方法應用于流行病學溯源調查以及臨床用藥指導。

志謝 感謝上海市疾病預防控制中心許學斌老師在血清凝集實驗和論文寫作等方面給予的指導