2型糖尿病對(duì)患者精子DNA碎片率、AR和MMP的影響研究

張軍榮 徐惠明 唐鋒 奚穎霞

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）是一種多發(fā)病、常見(jiàn)病，流行病學(xué)調(diào)查顯示其患病率逐年上升，嚴(yán)重影響人們的身心健康[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)T2DM的慢性高血糖狀態(tài)會(huì)造成患者多器官功能損害，并且對(duì)生殖功能也可能有潛在的不利影響[3]。隨著男性T2DM患者的增加，潛在的生育風(fēng)險(xiǎn)也越來(lái)越大，故而研究T2DM影響男性生育能力的可能途徑已經(jīng)是迫在眉睫[4-5]。因此，本研究探討T2DM對(duì)患者精子DNA碎片率、精子頂體反應(yīng)（acrosome reaction,AR）率和精子線粒體膜電位（mitochondrial membrane protential,MMP）的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2018年1月至2021年12月浙江省婦幼和生殖保健中心收治的T2DM育齡男性患者50例作為研究對(duì)象（T2DM組），年齡22～40（28.31±4.32）歲；體重57～89（68.74±7.42）kg。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《中國(guó)2型糖尿病防治指南（2017年版）》[6]中T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)，且均為育齡男性；（2）初次發(fā)現(xiàn)、尚未經(jīng)治療；（3）年齡≥20歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴糖尿病并發(fā)癥；（2）伴急性感染、惡性腫瘤等疾病者；（3）嚴(yán)重精神疾病者；（4）伴嚴(yán)重肝、腎、脾、心、肺等嚴(yán)重異常者；（5）伴其他影響精液治療的內(nèi)分泌疾病；（6）存在射精障礙、勃起功能障礙者；（7）遺傳性疾病、泌尿生殖系統(tǒng)異常者。另選取同期本中心健康體檢育齡男性55名作為對(duì)照組，年齡 22～40（28.63±4.27）歲 ；體重 54～85（68.35±6.85）kg。兩組受試者年齡和體重比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 主要試劑 精子DNA碎片染色試劑盒、精子AR檢測(cè)試劑盒、精子MMP檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自青島復(fù)諾生物醫(yī)療有限公司。

1.3 方法

1.3.1 精液標(biāo)本采集 禁欲3～7 d以手淫法收集受試者精液標(biāo)本。

1.3.2 正常形態(tài)精子百分比、精子濃度和前向運(yùn)動(dòng)精子百分比檢測(cè) 精液標(biāo)本完全液化后按《WHO人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第5版進(jìn)行常規(guī)分析，檢測(cè)正常形態(tài)精子百分比、精子濃度和前向運(yùn)動(dòng)精子百分比。

1.3.3 精子DNA碎片率測(cè)定 精液標(biāo)本完全液化后，加入A液調(diào)整精子濃度至（1～2）×106/ml，將待染色精液樣本及染色試劑均放置于冰盒上預(yù)冷5 min。取100 μl準(zhǔn)備好的待檢精液樣本置于15 ml EP管中，加入B液200 μl，混勻，反應(yīng)30 s后加入C液600 μl，立即混勻。將混勻的溶液置于流式細(xì)胞儀上樣管處，使用流式細(xì)胞儀測(cè)定精子DNA碎片率。

1.3.4 精子AR率測(cè)定 精液標(biāo)本完全液化后，在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，根據(jù)精子濃度取20～40萬(wàn)個(gè)精子，加入A液稀釋至1 000 μl，混勻。將待染色精液樣本及試劑盒中的染色試劑放置于金屬浴上37℃預(yù)熱5 min。吸取D液，加入上述A液稀釋混勻的樣本中，混勻3 s。分別取500 μl準(zhǔn)備好的待檢精液樣本置于1.5 ml離心管中，標(biāo)記為檢測(cè)管、對(duì)照管。分別吸取B液5 μl加入檢測(cè)管、C液5 μl加入對(duì)照管，混勻3 s，金屬浴上37℃靜置15 min，使用流式細(xì)胞儀測(cè)定精子AR率。

1.3.5 精子MMP測(cè)定 精液標(biāo)本完全液化后，在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，根據(jù)精子濃度取10～20萬(wàn)個(gè)精子，加入A液稀釋至500 μl，混勻。將待染色精液樣本以及試劑盒中的染色試劑放置于金屬浴上37℃預(yù)熱5 min。將待染色樣本加入1.5 ml離心管中，混勻10 s。吸取B液5 μl，加入上述離心管中，混勻3 s，于37℃金屬浴上靜置10 min，使用流式細(xì)胞儀測(cè)定精子MMP。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0軟件處理。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組正常形態(tài)精子百分比、精子濃度和前向運(yùn)動(dòng)精子百分比比較 T2DM組正常形態(tài)精子百分比、精子濃度和前向運(yùn)動(dòng)精子百分比均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組正常形態(tài)精子百分比、精子濃度和前向運(yùn)動(dòng)精子百分比比較

2.2 兩組精子DNA碎片率、AR率和MMP比較 T2DM組精子DNA碎片率高于對(duì)照組，精子AR率、精子MMP均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩組精子DNA碎片率、AR率和MMP比較（%）

3 討論

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)T2DM可能引起男性生育能力下降[7-10]。精液質(zhì)量是男性生育能力體現(xiàn)的一個(gè)重要指標(biāo)。T2DM導(dǎo)致男性激素水平失常，生精功能障礙間接或直接造成精子相應(yīng)的正常生理過(guò)程受干擾；并且又最直接得造成附睪、睪丸組織正常功能受限，主要包括精子活力下降、精液液化時(shí)間延長(zhǎng)及精子總數(shù)減少，因此會(huì)造成男性生育能力減弱，甚至可能出現(xiàn)不育的情況[11-13]。本研究表明，T2DM組正常形態(tài)精子百分比、精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子百分比均低于對(duì)照組，提示T2DM患者正常形態(tài)精子百分比、精子濃度和前向運(yùn)動(dòng)精子百分比均下降。近年來(lái)，以精子DNA損傷為特征的精子染色體結(jié)構(gòu)異常可能對(duì)男性生育能力具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值[14]。本研究表明，T2DM組精子DNA碎片率高于對(duì)照組，提示T2DM患者精子DNA碎片率明顯增加。精子頂體主要由高爾基體小泡發(fā)育而來(lái)，并且是精子頭部頂端特化的小泡。而AR主要指精子在輸卵管壺腹部與卵子相遇后，導(dǎo)致頂體產(chǎn)生一系列反應(yīng)[15-16]。精子AR率是男性精子受精能力的判斷指標(biāo)[17]。姚佳沛[18]研究表明，與正常人群相比，糖尿病患者（a+b）級(jí)精子減少、精液液化時(shí)間延長(zhǎng)、精液量減少。本研究表明，T2DM組精子AR率低于對(duì)照組，提示T2DM患者精子AR率明顯降低。線粒體是細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的主要部位，故而線粒體DNA、基質(zhì)中的酶最易受到活性氧攻擊的損傷[19]。線粒體正常膜電位依賴于線粒體膜間隙和線粒體基質(zhì)內(nèi)的質(zhì)子泵，當(dāng)線粒體內(nèi)活性氧過(guò)度增加時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致MMP下降[20]。本研究表明，T2DM組精子MMP低于對(duì)照組，提示T2DM患者精子MMP明顯下降。

綜上所述，T2DM患者精子DNA碎片率升高、精子AR率和精子MMP下降，可能影響T2DM患者生育能力，導(dǎo)致生育能力下降。T2DM對(duì)精子DNA碎片率、AR率及MMP的影響機(jī)制仍不明確，筆者團(tuán)隊(duì)將對(duì)此開(kāi)展進(jìn)一步研究。