蘆筍皂苷調(diào)控circ_0001361/miR-136對結(jié)腸癌細胞增殖、凋亡的影響

程琳 張剛

結(jié)腸癌已成為一種常見的惡性腫瘤，每年導(dǎo)致大量與癌癥相關(guān)的患者死亡[1]。由于結(jié)腸切除術(shù)、化學(xué)療法和免疫療法等治療方法的改進，結(jié)腸癌患者總體5年相對生存率約為64%[2]。然而，晚期、轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性結(jié)腸癌患者的預(yù)后仍然很差。因此，迫切需要探索結(jié)腸癌進展的其他未知機制，并開發(fā)治療新策略。蘆筍是一種多年生植物，具有顯著抗真菌、抗肝毒性、細胞毒性、抗誘變、抗炎和利尿特性[3]。蘆筍富含多種生物活性植物化學(xué)物質(zhì)，已被用于治療各種慢性炎癥疾病和癌癥[4,5]。根據(jù)報道，從蘆筍中提取的蘆筍皂苷對癌細胞的細胞生長和運動具有潛在的抑制活性[6]。蘆筍提取物對結(jié)腸癌具有良好的細胞毒性作用[7]。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類由上游剪接受體和下游剪接供體組成的環(huán)狀RNA分子，在真核生物中廣泛傳播[8]。最近的研究揭示了circRNA充當微小RNA(MicroRNA，miRNA)海綿與包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種人類惡性腫瘤的發(fā)生和進展相關(guān)[9]。在膀胱癌[10]、肝癌[11]中發(fā)現(xiàn)circ_0001361上調(diào)，它可能作為膀胱癌、肝癌治療的靶點。本研究評估蘆筍皂苷對結(jié)腸癌細胞增殖、凋亡及circ_0001361表達的影響，旨在探討蘆筍皂苷對結(jié)腸癌的抗癌功能與機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 結(jié)腸癌細胞SW1116(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)，si-NC、si-circ_0001361、pcDNA、pcDNA-circ_0001361、miR-136模擬物、模擬物NC(miR-NC)(上海吉瑪)，細胞計數(shù)試劑盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)(日本Dojindo)，兔抗人B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)抗體、B兔抗人cl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗體(美國Abcam)，RIPA裂解緩沖液(江蘇Beyotime)，膜聯(lián)蛋白 V(Annexin V)-FITC凋亡檢測試劑盒(美國Clontech Laboratories)，ECL蛋白質(zhì)印跡檢測試劑(美國GE Healthcare)，pmirGLO載體(美國Promega)，Trizol試劑(北京Solarbio)，特異性逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix(南京Vazyme)，乙醇、甲醇等試劑為國產(chǎn)分析純。蘆筍皂苷：新鮮蘆筍(武漢新辰食品有限公司)于60℃烘干并粉碎成粉末，以1∶15的料液比加入74%乙醇，在50℃下超聲提取54 min，過濾用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，以甲醇定容至100 ml備用[12]。

1.2 細胞培養(yǎng) SW1116細胞在飽和濕潤、5% CO2和37℃條件的培養(yǎng)箱內(nèi)生長，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)。

1.3 實驗分組 將SW1116細胞分為對照組、蘆筍皂苷L、M、H組、si-NC組、si-circ_0001361組、蘆筍皂苷H+pcDNA組、蘆筍皂苷H+pcDNA-circ_0001361組。對照組SW1116細胞未作任何處理，蘆筍皂苷L、M、H組的蘆筍皂苷濃度分別為45、90、180 mg/L[13]，作用時間為48 h。si-NC組、si-circ_0001361組、蘆筍皂苷H+pcDNA組、蘆筍皂苷H+pcDNA-circ_0001361組的SW1116細胞以1×105/孔的密度接種在6孔板中，培養(yǎng)匯合度至60%左右，根據(jù)Lipofectamine 2000試劑操作指示，分別進行si-NC、si-circ_0001361、pcDNA、pcDNA-circ_0001361轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h后，根據(jù)分組將轉(zhuǎn)染基質(zhì)更換為不含或含180 mg/L蘆筍皂苷的新鮮培養(yǎng)基，保持48 h。

1.4 CCK-8法檢測細胞抑制率 將SW1116細胞(1×104個細胞)接種在96孔板中24 h。然后根據(jù)1.3 實驗分組進行處理。向每個孔中加入10 μl CCK-8，持續(xù)2 h。使用酶標儀在每個孔中測定450 nm處的吸光度OD值，以(100%-實驗組OD值)/對照組OD值×100%計算抑制率(%)。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 根據(jù)Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明指示，每組SW1116細胞(2×105個細胞)懸浮在結(jié)合緩沖液中，用Annexin V-FITC(5 μl)和碘化丙錠(propidium iodide，PI)(5 μl)在室溫下黑暗中染色15 min。孵育后，在配備有CellQuest軟件的Becton Dickinson FACScan流式細胞儀(激發(fā)波長為488 nm)中分析細胞。

1.6 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成 將每組SW1116細胞接種在6孔板(500個細胞/孔)中，連續(xù)培養(yǎng)14 d，隨后，細胞用4%多聚甲醛固定并用0.1%結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下克隆數(shù)。

1.7 Western blot檢測Bax、Bcl-2蛋白表達 在含有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液中收集每組SW1116細胞總蛋白質(zhì)。取20 μg蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。用5%牛血清白蛋白封閉后，1∶1 000稀釋的Bax、Bcl-2和GAPDH與膜在4℃下共培養(yǎng)過夜。與羊抗兔二抗在室溫下共培養(yǎng)1 h。通過增強化學(xué)發(fā)光液可視化蛋白印跡。使用Image Lab軟件量化Bax、Bcl-2相對于GAPDH的表達。

1.8 qRT-PCR檢測circ_0001361和miR-136表達 使用Trizol試劑分離每組SW1116細胞RNA后，利用特異性逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。然后，通過SYBR Green PCR Master Mix監(jiān)測RNA水平，并使用2-ΔΔCt方法進行量化。以β-actin或U6作為內(nèi)部對照。引物序列(5’-3’)為：circ_0001361-F CCCACTTGGTGAATGG AGAT，circ_0001361-R GGATTTGGTCGGTCATCATC。

β-actin-F TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC，β-actin-R ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG。miR-136-F ACACTC CAGCTGGGACTCCATTTGTTTT，miR-136-R CCAGTGC AGGGTCCGAGGT，U6-F CTCGCTTCGGCAGCACA，U6-R AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.9 熒光素酶報告基因檢測 miR-136與circ_0001361之間的結(jié)合位點通過軟件Circular RNA Interactome預(yù)測。將含有miR-136預(yù)測或突變結(jié)合位點的circ_0001361序列插入pmirGLO載體，生成circ_0001361野生型(WT)或突變體(MUT)。將circ_0001361(WT/MUT)以及miR-136模擬物或miR-NC共轉(zhuǎn)染SW1116細胞。在Dual-Lucy Assay系統(tǒng)中評估轉(zhuǎn)染48 h后細胞的熒光素酶活性。另將pcDNA-circ_0001361、pcDNA轉(zhuǎn)染SW1116細胞，48 h后以qRT-PCR評估m(xù)iR-136表達。

2 結(jié)果

2.1 蘆筍皂苷對SW1116增殖凋亡的影響 與對照組比較，蘆筍皂苷L組、蘆筍皂苷M組、蘆筍皂苷H組SW1116細胞的抑制率、凋亡率逐漸增加，克隆數(shù)逐漸減少，Bax蛋白表達量遞增，Bcl-2蛋白表達量遞減(P<0.05)，且蘆筍皂苷L組、M組、H組3組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1，表1。

表1 蘆筍皂苷對SW1116增殖凋亡

2.2 蘆筍皂苷對SW1116中circ_0001361和miR-136表達的影響 與對照組比較，蘆筍皂苷L組、蘆筍皂苷M組、蘆筍皂苷H組SW1116細胞的circ_0001361表達量依次降低，miR-136表達量依次升高(P<0.05)，蘆筍皂苷L組、蘆筍皂苷M組、蘆筍皂苷H組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 蘆筍皂苷對SW1116中circ_0001361和miR-136表達

2.3 抑制circ_0001361對SW1116增殖凋亡的影響 抑制circ_0001361后，si-circ_0001361組SW1116細胞中circ_0001361的表達量比si-NC組減少0.77倍左右，細胞抑制率、凋亡率比si-NC組增加，克隆數(shù)、Bcl-2蛋白表達量較si-NC組降低，Bax蛋白表達量較si-NC組升高(均P<0.05)。見表3，圖2。

表3 抑制circ_0001361對SW1116增殖凋亡

圖2 抑制circ_0001361對SW1116凋亡的影響；A 流式細胞圖；B Wester blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達量

2.4 circ_0001361靶向調(diào)控miR-136 在Circular RNA Interactome軟件中預(yù)測到的circ_0001361和miR-136互補序列。circ_0001361(WT)的熒光素酶活性在miR-136組中顯著低于miR-NC組(P<0.05)，circ_0001361(MUT)的熒光素酶活性在miR-136組與miR-NC組中無明顯差別(P=0.512)。si-circ_0001361組SW1116細胞中miR-136表達量為(2.74±0.09)高于si-NC組的(1.00±0.00)(t=58.000，P<0.05)，pcDNA-circ_0001361組miR-136表達量為(0.47±0.05)低于pcDNA組的(1.00±0.00)(t=31.800，P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 circ_0001361和miR-136的互補序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.5 circ_0001361對蘆筍皂苷處理的SW1116增殖凋亡的影響 蘆筍皂苷H+pcDNA-circ_0001361組SW1116細胞中circ_0001361的表達量比蘆筍皂苷H+pcDNA組增加3.45倍左右，細胞抑制率、凋亡率低于蘆筍皂苷H+pcDNA組，克隆數(shù)、Bcl-2蛋白表達量高于蘆筍皂苷H+pcDNA組，Bax蛋白表達量低于蘆筍皂苷H+pcDNA組(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 circ_0001361對蘆筍皂苷處理的SW1116凋亡的影響；A 流式細胞圖；B Wester blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達量

表5 circ_0001361對蘆筍皂苷處理的SW1116增殖凋亡的檢測

3 討論

蘆筍是一種廣受歡迎且健康的蔬菜，富含維生素、礦物質(zhì)、氨基酸和纖維[9]。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，包括蘆筍在內(nèi)的許多膳食天然產(chǎn)品具有抗腫瘤活性[14]。從蘆筍中提取的皂苷類化合物可能是其抗腫瘤特性的主要活性成分[15]。據(jù)報道，蘆筍皂苷在不同的癌細胞系中顯示出細胞生長抑制作用，例如蘆筍皂苷以劑量依賴性方式抑制肝癌HepG2細胞的生長，并通過調(diào)節(jié)HepG2細胞凋亡相關(guān)蛋白(下調(diào)Bcl2、上調(diào)Bax)的表達誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡[16,17]。蘆筍皂苷Asparanin A的給藥抑制了子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞增殖，減少腫瘤生長，并加速細胞凋亡的發(fā)生[18]。此外，蘆筍芽甲醇提取物通過激活TRAIL細胞凋亡途徑減少結(jié)腸癌SW480和SW620的細胞增殖，并最終導(dǎo)致細胞死亡[19]。本研究與前述研究一致，證明蘆筍皂苷可抑制結(jié)腸癌細胞的生長。

研究表明，circ_0001361在膀胱癌組織和細胞系中高水平表達，并且與病理分級和肌肉浸潤呈正相關(guān)，circ_0001361通過靶向miR-491-5p/MMP9軸在膀胱癌侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮致癌作用[20]。在肺腺癌組織和細胞中，circ_0001361上調(diào)；circ_0001361充當miR-525-5p的海綿來上調(diào)下游靶標VMA21水平，驅(qū)動肺腺癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移[21]。但circ_0001361對結(jié)腸癌的影響仍未可知。表明抑制circ_0001361抑制了結(jié)腸癌細胞的增殖及促進凋亡。這表明circ_0001361有助于結(jié)腸癌的腫瘤發(fā)生，這是首次報道circ_0001361在結(jié)腸癌中的致癌作用。Zhang等[22]利用多組學(xué)揭示幾種中樞miRNA，它們可能對抗蘆筍皂苷Asparanin A的抗子宮內(nèi)膜癌活性。本研究檢測到，結(jié)腸癌細胞中circ_0001361表達被蘆筍皂苷抑制，miR-136的表達被蘆筍皂苷促進，表示蘆筍皂苷抗癌活性與circ_0001361/miR-136有關(guān)。miR-136作為一種腫瘤抑制因子在結(jié)腸癌細胞的增殖和侵襲中發(fā)揮負調(diào)節(jié)作用[23,24]。此外，miR-136充當circ_0109046[25]、circ_0000043[26]在子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌細胞生長中發(fā)揮功能的重要靶點。本研究中，circ_0001361靶向miR-136，并負調(diào)控miR-136的表達。此外，pcDNA-circ_0001361可以逆轉(zhuǎn)蘆筍皂苷對結(jié)腸癌細胞增殖和凋亡的影響。這些表明，蘆筍皂苷通過下調(diào)circ_0001361并靶向負調(diào)控miR-136，從而實現(xiàn)其對抗結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的功能。

綜上所述，蘆筍皂苷可以通過下調(diào)circ_0001361并靶向miR-136，抑制結(jié)腸癌細胞增殖和誘導(dǎo)凋亡。蘆筍皂苷可能成為預(yù)防和治療結(jié)腸癌的有效藥物。