基于網絡藥理學和分子對接方法探討絡石藤治療類風濕關節炎的作用機制

李成蹊，關智宇，蔣太平，劉志倫，劉昭明

(1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550000；2.貴州中醫藥大學第一附屬醫院骨科，貴州 貴陽 550001)

現代醫學認為，類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以侵襲性關節滑膜炎為主要癥狀的自身免疫系統疾病，其具體病因未明[1]。特征為身體多關節的對稱性、侵蝕性炎癥，臨床表現有關節晨僵、腫脹、疼痛及功能障礙等癥狀(最常見于手、足小關節)，實驗室檢查可見血清類風濕因子陽性。如未得到恰當治療，可能造成患者永久性骨質破壞并最終出現殘疾，甚至累及臟器和神經系統而危及生命[2]。目前臨床常見的治療RA藥物的主要局限性在于單一的靶向作用，這使得它們雖然可在短期內改善患者的臨床癥狀，但長期的治療效果往往欠佳，且存在的不良反應和較大的經濟負擔使得很多患者不能維持用藥。故而探尋并利用長效、低毒、價廉的中草藥對RA患者進行治療，一直是近些年來臨床研究的一個熱點。

RA屬中醫“痹癥”“尪痹”范疇。中醫理論認為痹癥是由于體虛之人受到風、寒、濕、熱等邪氣侵襲，進而使經絡閉阻，氣血運行不暢，所謂“不通則痛”“不榮則痛”，最終導致肢體肌肉廢用，關節紅腫熱痛、變形等癥狀的一種疾病。在長期的臨床實踐過程中，我國古代醫家對此病有了較為系統的認知，在許多中醫典籍中都有對類似病癥的總結。《黃帝內經》最早提出了風、寒、濕三種外邪相合而致痹癥，《素問·痹論》[3]曰：“風寒濕三氣雜至合而為痹也”；對風濕的認知發展至宋代，有《太平圣惠方》云：“風濕腰痛，連腿膝，頑痹不能運動”，《太平惠民和劑局方》[4]又載：“體虛，風邪入血，肌膚頑痹”，都強調了體虛是痹病之根本原因，此后風濕之邪從外侵犯而成痹證。從古至今中醫對RA的治法也以祛風勝濕，通絡止痛為主?！吨袊幍洹穂5]記載絡石藤為夾竹桃科植物絡石[Trachelospermumjasminoides(Lindl.)Lem.]的干燥帶葉藤莖。味苦，性微寒。歸心、肝、腎經。有祛風通絡，涼血消腫的功效。中醫常將其用于風濕痹癥、腰痹筋攣、紅腫熱痛、跌撲損傷等治療?！侗静菥V目》[6]有載：“絡石，氣味平和，其功主筋骨關節風熱癰腫”。通過長期的臨床實踐，人們發現在古今眾多經方運用過程中，絡石藤往往可有效延緩各種關節炎癥的發展，改善患者臨床癥狀。但由于中草藥的成分混雜、機制不明等原因，其類似“黑箱理論”的運作形式在多種臨床疾病治療過程中的作用依然受到質疑。本文旨在運用現代化的網絡藥理學和分子對接方法，分析絡石藤所含的主要活性物質基礎及其可能的作用機制，為明確絡石藤對于RA的治療效果提供數據支持與理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要軟件與數據庫 Cytoscape 3.8.0、R語言、perl document、ChemBio3D Ultra、PyMOL、AutoDockTools、Vina、中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)、GeneCards基因數據庫、在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)、PubChem數據庫、Uniprot蛋白質數據庫、STRING蛋白互作關系數據庫、PubChem有機小分子生物活性數據庫、RCSB蛋白質數據庫(PDB)。

1.2 絡石藤活性成分及作用靶點的篩選 在TCMSP中，以“絡石藤”為檢索詞，獲取絡石藤已知的藥物成分，將口服生物利用度大于等于30%(OB≥30%)，化合物類藥性大于等于0.18(DL≥0.18)設定為篩選標準，得到絡石藤所含化合物中活性度較高的成分，之后利用數據庫進一步搜索這些成分所作用的靶點基因，再將藥物所有的作用靶點導入UniProt數據庫進行比對、去重后，獲得絡石藤可作用的靶點基因名稱。

1.3 類風濕關節炎靶點的篩選 在GeneCards、OMIM兩種數據庫中同時檢索關鍵詞“rheumatoid arthritis”，將檢索物種設定為“homo sapiens(人類)”，得到較為全面的RA疾病人源靶點基因。

1.4 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡的構建 得到絡石藤活性成分作用靶點與RA潛在靶點基因后，運行perl document程序獲取“藥物-疾病”交集靶點，再利用R語言將交集靶點輸出為Venn圖，運用Cytoscape 3.8.0軟件將絡石藤及其活性成分、RA及其靶點基因之間的作用關系進行可視化分析。

1.5 靶蛋白互作網絡(PPI)的構建 檢索STRING數據庫，導入“藥物-疾病”交集靶點，生成蛋白互作網絡(PPI)后，將網絡圖保存為TSV格式的數據文件后導入到Cytoscape 3.8.0中進行篩選，得到絡石藤活性成分作用的核心靶點基因。

1.6 分子對接 首先使用PubChem數據庫搜索核心靶點對應的活性成分，導入ChemBio3D Ultra軟件繪制活性成分的3D結構，得到小分子配體文件。之后從RCSB蛋白質數據庫(PDB)下載核心靶點的三維結構，用PyMOL軟件刪除配體并除水，得到蛋白受體文件。將二者導入AutoDockTools進行加氫修飾，設定搜索范圍和評分參數，形成活性口袋。最后利用Vina軟件進行分子對接。

1.7 GO富集分析與KEGG通路富集分析 下載Bioconductor程序包并利用R語言運行，對之前獲取的“藥物-疾病”交集靶點進行GO富集分析和KEGG通路分析，將閾值設定為P<0.05以提高分析準確性，將分析結果按照涉及的靶點數目從高到低進行排列，選取GO富集分析中生物過程(BP)、細胞組成(CC)和分子功能(MF)的前10 個條目及KEGG通路富集的前20 個信號通路，進一步探討絡石藤治療RA的生物學過程及其作用的信號通路。

2 結果

2.1 絡石藤活性成分及作用靶點 通過TCMSP數據庫共檢索出絡石藤25 個已知化學成分，再將OB≥30%和DL≥0.18設置為篩選條件，最終得到9 個活性度較高的化合物，可推測為絡石藤活性成分(見表1)。將活性成分導入TCMSP數據庫，獲取每個活性成分所作用的靶點基因，為避免不同活性成分存在重復的作用靶點，故將全部靶點基因利用UniProt數據庫進行比對、去重，獲得90 個絡石藤治療RA的潛在靶基因名稱。

表1 絡石藤活性成分

2.2 類風濕關節炎靶點的篩選 在GeneCards數據庫、OMIM數據庫中檢索關鍵詞“rheumatoid arthritis”，物種設定為“homo sapiens”，得到RA的人源靶點基因4 427 個，結合絡石藤治療RA的潛在靶點，運行perl document取“藥物-疾病”交集靶點，利用R語言輸出為Venn圖，發現67 個絡石藤作用靶點與類風濕關節炎重合的靶點基因。

2.3 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡構建 將藥物活性成分和疾病交集靶點導入Cystoscope 3.8.0軟件，得到“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡圖(見圖1)。網絡圖中共包含158 個節點，其中六邊形代表藥物，矩形代表藥物活性成分，橢圓形代表靶點，菱形代表疾病，連接線表示兩個元素之間存在相互關系。根據網絡中絡石藤活性成分與疾病靶點連接度的多少篩選出排名前四的有效活性分子，分別為木犀草素、伊博格堿、谷甾醇、豆甾醇，各有8 個以上的靶點基因與這些成分發生作用，推測是絡石藤在RA治療中起主要作用的活性成分，體現了中藥多靶點的特性。

2.4 靶蛋白互作網絡(PPI)的構建 檢索STRING數據庫，將范圍設為“Multiple proteins”，物種設為“Homo sapiens”，導入“藥物-疾病”交集靶點，初步生成蛋白互作網絡(PPI)后，調整“minimum required interaction score”為0.9并隱藏游離靶點，其余參數為默認值，繪制更明晰的蛋白互作關系(見圖2)，節點之間連線越粗代表互作關系越密切。將互作網絡保存為TSV格式的數據文件，導入到Cytoscape 3.8.0中對靶蛋白作用程度進行打分，篩選兩次后得到6 個蛋白互作網絡核心基因(見圖3)，分別為RB1、MAPK1、AKT1、JUN、IL-6、RELA，確定為絡石藤活性成分作用的核心靶點。

圖1 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡

圖2 蛋白互作網絡(PPI)

圖3 蛋白互作網絡核心基因篩選

2.5 分子對接 將篩選出的6 個核心靶點與絡石藤活性成分進行分子對接驗證，其結果見表2，可見木犀草素是與6 個核心靶點對接的活性成分，運用PyMOL軟件輸出對接模式圖(見圖4)。分子對接的結合能(affinity)越小，表示配體與受體結合的越牢固。對接結果顯示，絡石藤活性成分與RA核心靶點的結合能介于-7.7 kcal·mol-1與-9.8 kcal·mol-1之間(低于-5.0 kcal·mol-1)，表明活性成分與核心靶點具有較好的結合活性，預測結果比較可靠。

表2 活性成分與核心靶點對接結果

圖4 絡石藤活性成分與RA核心靶點對接模式

2.6 GO富集分析與KEGG通路富集分析 將篩選出的67 個“藥物-疾病”交集靶點進行GO富集分析與KEGG通路富集分析，制作富集圖形。本次GO富集分析共顯示1 888個生物過程(BP)、84 個細胞組成(CC)、91 個分子功能(MF)，各取其中前10 個條目進行可視化分析(見圖5)。交集靶點基因在BP富集過程中主要表現在對生物堿的反應(response to alkaloid)、肌肉細胞增殖(muscle cell proliferation)、細胞對化學應激的反應(cellular response to chemical stress)、調節平滑肌細胞增殖(regulation of smooth muscle cell proliferation)、對金屬離子的反應(response to metal ion)、腺體發育(gland development)、對氧化應激的反應(response to oxidative stress)、對類固醇激素的反應(response to steroid hormone)、對活性氧的反應(response to reactive oxygen species)等生物過程；在CC富集過程中主要表現為突觸后膜(postsynaptic membrane)、突觸膜(synaptic membrane)、突觸前膜(presynaptic membrane)、細胞膜筏(membrane raft)、細胞膜微區(membrane microdomain)、細胞膜區(membrane region)等細胞組成；在MF富集過程中主要表現在兒茶酚胺結合(catecholamine binding)、G蛋白偶聯的胺受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)、藥物結合(drug binding)、神經遞質受體活性(neurotransmitter receptor activity)、肽結合(peptide binding)等分子功能。

圖5 絡石藤治療RA的GO富集分析

本次KEGG通路富集分析顯示了125 條通路，取前20 個條目進行可視化分析(見圖6)。交集靶點主要富集于PI3K-Akt信號通路、多種癌癥相關通路、人巨細胞病毒感染、乙型肝炎、HIF-1信號通路、IL-17 信號通路、TNF信號通路等，多為癌癥、感染、炎癥和免疫相關通路。

圖6 絡石藤治療RA的KEGG通路富集分析

3 討論

經過TCMSP數據庫篩選后，本次研究共得到絡石藤中9 個藥動學特征良好的化合物作為潛在活性成分，通過“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡圖反映出其中木犀草素、伊博格堿、谷甾醇、豆甾醇4個成分可能為發揮RA治療作用的關鍵成分。木犀草素是一種天然黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫調節等藥理作用。Aziz等[7]通過體內及體外實驗證實了木犀草素具有較好的抗炎作用，其主要通過NF-κB、MAPK通路發揮作用。徐強等[8]認為木犀草素可以通過下調基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的表達，防止軟骨降解，促進新合成的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的積累，并抑制滑膜成纖維細胞增殖，最終緩解關節部位的炎癥反應。部分關于急性痛風性關節炎模型大鼠的實驗也證實了木犀草素緩解試驗模型足踝關節腫脹的作用，是通過下調IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α等的水平達到的[9]。谷甾醇是植物甾醇的重要組成成分，其作用于多種慢性疾病，具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤等作用[10]。Liao等[11]發現β-谷甾醇可以通過抑制表皮細胞、巨噬細胞中炎癥小體NLRP3的激活，來抑制CAS1的產生及MAPK信號通路的活化，從而顯著減少細胞中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8生成以起到抗炎作用。曾莉萍等[12]發現β-谷甾醇可使成骨細胞護骨素與破骨細胞分化因子的比值增高，發揮雌激素樣作用，促進卵巢顆粒細胞分泌雌二醇，從而與骨膜上的雌激素受體結合，促進成骨作用以及抑制破骨作用來調節女性骨代謝的平衡。關于豆甾醇及伊博格堿的相關文獻報道較少，豆甾醇的作用主要涉及抗癌方面，而伊博格堿主要用于阻斷某些藥物或毒品的依賴性，本文不做詳細討論。故推測木犀草素和谷甾醇為絡石藤抗RA的關鍵活性成分。

而分子對接的結果也表明，在通過PPI網絡篩選出的核心靶點基因RB1、MAPK1、AKT1、JUN、IL-6、RELA中，絡石藤活性成分木犀草素與核心靶點具有較好的結合活性，進一步證實了絡石藤藥物成分可以與受體穩定結合并發揮治療RA的作用，為絡石藤作用于核心靶點以干預RA病情提供了更多數據支持。

在篩選出的核心靶點基因中，又以MAPK1、AKT1、JUN三個基因的自由度最高。MAPK(基質金屬蛋白酶)信號通路是經典的炎性反應通路，有研究表明，對膠原誘導的關節炎大鼠給予MAPK信號轉導通路抑制劑后，與未給信號通路抑制劑的對照組相比，給藥組在抑制滑膜炎癥、骨質破壞和關節軟骨破壞的方面有顯著效果[1]。說明該信號通路對炎癥、增生和骨破壞這三大RA病理過程均起到重要的調節作用。AKT1可通過磷酸化其下游底物來促進細胞生長、代謝、凋亡等重要的細胞生物學過程[13]。JUN(轉錄因子AP-1)主要由C-Fos家族和C-jun家族結合形成的二聚體構成，JUN位于多條信號通路的下游，主要調控炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-1、IL-6、IL-17等)和金屬蛋白酶(MMPs)等的釋放，參與細胞增殖、分化、凋亡，影響機體的免疫和炎性反應[2]。

GO富集分析結果表明，絡石藤對RA的治療過程包括了金屬離子、蛋白質等多種物質的參與，涉及細胞器、細胞膜細胞，可影響肌肉細胞增殖、藥物結合、神經遞質受體活性、肽結合，對各種有機環狀化合物反應、對生物堿反應、對非生物刺激反應、對類固醇激素反應和對含氧化合物等反應的一個復雜的過程。KEGG通路富集分析可歸納靶基因作用于疾病時所途徑的信號通路，便于更加清稀、明確地總結藥物發揮治療作用的過程。IL-17在RA患者病理活檢中均可檢測到，且研究表明IL-17是通過PI3K-Akt途徑刺激RA-FLS分泌IL-6、IL-8及血管內皮細胞生長因子受體(VEGFR)[14-15]。而更多研究還發現，PI3K-Akt可以通過影響FLS的增殖與凋亡干預RA滑膜炎癥，進行對TNF-α誘導B淋巴細胞誘導成熟蛋白1(Blimp 1)表達的調控干預RA骨破壞 ，其參與了RA進展的全部過程[16]。有研究表明[2]，RA成纖維樣細胞異常增生，并展現出了類癌細胞特點，RA纖維樣滑膜細胞異常增生可能與癌癥相關通路有關聯，絡石藤對多種癌癥相關通路的調控也可能對RA發揮治療作用。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學與分子對接方法，搜集到絡石藤9種活性成分及可能作用的90 個潛在靶點，4 427個RA疾病的相關靶點，其中包括“藥物-疾病”交集靶點67個，構建關于這些靶點基因的蛋白互作網絡(PPI)，發現絡石藤可能是通過作用于RB1、MAPK1、AKT1、JUN、IL-6、RELA等靶點發揮對RA的治療作用，分子對接顯示，其中發揮主要治療作用的活性成分為木犀草素。通過對核心靶進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，絡石藤可能通過調控PI3K-Akt信號通路、癌癥相關通路、細胞凋亡通路、IL-17信號通路等通路，發揮抑制炎癥反應、調節免疫功能及調控細胞凋亡等作用來治療類風濕關節炎。這些結果通過數據證明了絡石藤治療RA的有效性，體現了中草藥治療特定疾病可以發揮多種要素協同作用的特點，也說明網絡藥理學和分子對接方法運用于中醫藥研究的科學性和有效性。同時，本研究尚存在需要改進之處，如檢索的數據庫種類較少，所獲取的信息可能不完全，獲取的小分子配體及核心靶點數量有限，無法更加全面地揭示中草藥的藥理作用；作者查閱、引用的文獻及憑借網絡數據構建的框架、列表、繪圖中存在對當前研究熱點的傾向性，可能一定程度上影響到本次研究的結果，故得出的結論仍需進一步以實驗為基礎加以驗證，以更加準確地揭示中藥絡石藤治療RA的具體作用機制。