UPLC-QTOF-MS 結合主成分分析法考察胡蘆巴鹽制前后的化學成分差異

王祎，劉穎，葉斌斌，鄭彧

(遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600)

胡蘆巴為豆科植物胡蘆巴(Trigonellafoenum-graecumL.)的干燥種子，主要分布于我國寧夏、甘肅、青海、新疆、內蒙古等省區，是我國傳統的藥食兩用植物和香料。《中國藥典》中載有胡蘆巴、鹽胡蘆巴兩個品種。胡蘆巴性溫味苦，歸腎經，溫腎助陽，祛寒止痛，用于腎陽不足。在中醫理論中有“入鹽走腎臟仍仗軟堅”，認為鹽制可以引藥入腎，發揮軟堅散結的作用。胡蘆巴經鹽制后可以增強溫腎陽、逐寒濕的功效[1]。我們課題組在早期研究中證明了鹽胡蘆巴的降脂作用優于胡蘆巴[2]。胡蘆巴的化學成分主要包括胡蘆巴堿、皂苷類、黃酮類、膳食纖維、胡蘆巴油脂、4-羥基異亮氨酸等，這些化學成分已經被報道具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗氧化、抑菌、保肝等多種藥理活性[3]。我們課題組早期基于響應面法優化了鹽胡蘆巴的炮制工藝[4]，并發現胡蘆巴鹽制后，多糖、薯蕷皂苷元、胡蘆巴堿含量升高，4-羥基異亮氨酸含量降低。

中藥的炮制在中國有著悠久的歷史，炮制通過促進中藥中化學成分之間的轉化以及藥效成分的溶出，從而發揮減毒增效的作用[5]。例如，補骨脂經鹽制總黃酮含量呈現上升趨勢，這可能是鹽制過程導致補骨脂種皮破碎，使得其成分更易溶出[6]；知母中的甾體皂苷類成分在鹽制過程中發生轉化[7]。目前，關于胡蘆巴鹽制后化學成分變化的研究較少。因此，本研究使用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法(UPLC-QTOF-MS) 分析胡蘆巴與鹽胡蘆巴中的化學成分，采用主成分分析(PCA)以及偏最小二乘判別分析(PLS-DA)篩選胡蘆巴與鹽胡蘆巴中的差異性成分，利用高分辨質譜提供的精確分子量、二級質譜結合文獻數據鑒定這些差異性成分的結構。探究鹽制對胡蘆巴中化學成分的影響，為闡明胡蘆巴鹽制的機理提供實驗依據。

1 試藥

胡蘆巴購自亳藥千草中藥飲片公司(批號：2008132，產地：安徽蒙城)經王添敏教授鑒定為豆科植物胡蘆巴(Trigonellafoenum-graecumL.)的種子。參照課題組早期優化的鹽制方法制備鹽胡蘆巴[4]，即：100 g 胡蘆巴， 加入含鹽量 2.0 g的鹽水，悶潤4 h，在 160 ℃下烘箱烘制10.0 min。

2 方法

2.1 樣品制備 胡蘆巴和鹽胡蘆巴粉粹，過60目篩，精密稱定后以10倍量甲醇超聲提取30 min，18 000 g離心10 min取上清液(平行6份)進Agilent Technologies 6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS分析。取胡蘆巴和鹽胡蘆巴各樣品等量混合作為QC樣品。

2.2 色譜和質譜條件

2.2.1 色譜條件 Agilent Technologies 6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS，離子源：electrospray ionization(ESI)。色譜柱：C18反相色譜柱(150 mm×3.0 mm，2.7 μm,YMC Co.,Ltd.)。柱溫40 ℃,流速0.3 mL·min-1，進樣量5 μL，流動相：0.5% 乙酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，0～20 min,5%～100% B;20～25 min,100% B。

2.2.2 質譜條件 離子源ESI(+)，毛細管電壓3.5 kV,碰撞電壓75 V，錐孔電壓65 V，霧化氣壓力35 psig，干燥氣流速8 L·min-1，干燥氣溫度350 ℃，掃描范圍m/z100～2 000。

2.3 數據統計分析 將UPLC-QTOF-MS 的結果加載到安捷倫MassHunter工作站軟件上，該軟件可以在分析的每個步驟中可視化原始數據，而不會丟失值。離子強度圖顯示了保留時間、m/z和強度的信息，以及用于進一步分析的質譜圖和色譜圖。將從UPLC-QTOF-MS 獲得的數據轉換為包含m/z、保留時間和離子強度信息的表格。從所有樣品中排除質控樣品中RSD值大于30%的峰，并將剩余峰用于多元統計分析。將Simca-P 12.0軟件應用于PCA和PLS-DA。然后選擇VIP值大于1.5、組間差異P值小于0.05的離子，通過二級質譜(MS2)進行進一步鑒定。

3 結果

3.1 胡蘆巴和鹽胡蘆巴的PCA和PLS-DA分析 胡蘆巴和鹽胡蘆巴在正離子模式下的總離子流圖(TIC)見圖1所示。在胡蘆巴和鹽胡蘆巴TIC圖中9～11 min的離子響應出現差異，提示鹽制使胡蘆巴中的化學成分發生變化。將各樣本的UPLC-QTOF-MS 數據導入XCMS(https://xcmsonline.scripps.edu) 轉換為包含m/z,保留時間和峰響應的表格,將表格導入SIMCA軟件進行PCA和PLS-DA分析。PCA分析結果表明胡蘆巴和鹽胡蘆巴樣本聚集良好。進一步采用PLS-DA篩選胡蘆巴和鹽胡蘆巴中的差異性成分，選擇VIP值大于1.5、組間差異P值小于0.05的成分進行鑒定。

A.胡蘆巴;B.鹽胡蘆巴圖1 胡蘆巴及鹽制品正離子模式下的總離子流圖

3.2 胡蘆巴和鹽胡蘆巴差異性成分鑒定 通過質譜提供的精確分子量以及MS2數據，結合參考文獻，鑒定了胡蘆巴和鹽胡蘆巴中的25個差異性成分的結構。化合物1為胡蘆巴堿[8]，是胡蘆巴中的主要活性成分。胡蘆巴中含有大量黃酮碳苷[9]，盡管本試驗采用正離子模式測定胡蘆巴的化學成分，對于差異性成分中黃酮的鑒定則配合了負離子模式下的靶向二級質譜。黃酮碳苷在負離子模式下易產生[M-H-90]-、[M-H-120]-、[M-H-60]-、[M-H-104]-等碎片，這些碎片信息提示黃酮碳苷中糖的類型.例如,[M-H-120]-和[M-H-90]-提示存在六碳糖苷，[M-H-90]-和[M-H-60]-提示存在五碳糖苷[10-11]。由于質譜不能鑒定糖的種類和連接位置，因此胡蘆巴生、鹽品差異性黃酮類化合物的鑒定參考了文獻中報道的胡蘆巴中含有的黃酮碳苷的名稱以及其在C18柱上的保留時間，糖的結構只鑒定了其類型。基于以上分析化合物2～8被鑒定為黃酮類化合物。化合物2和4在正離子模式和負離子模式下的準分子離子峰分別為m/z595[M+H]+、593[M-H]-，提示其分子式為C27H30O15。MS2給出碎片離子峰m/z503[M-H-90]-、473[M-H-120]-、383[M-H-120-90]-、353[M-H-120-120]-。因此鑒定該兩個化合物為芹菜素-6,8-C-雙六碳糖苷，即vicenin 2或其異構體[9]。 化合物3,5～8在正離子模式和負離子模式下的準分子離子峰分別為m/z565[M+H]+、563[M-H]-，提示其分子式為C27H28O14。MS2給出碎片離子峰m/z503[M-H-60]-、473[M-H-90]-、443[M-H-120]-、383[M-H-120-60]-、353[M-H-120-90]-。因此鑒定該5個化合物為芹菜素-6-C-六碳糖-8-C-五碳糖苷或芹菜素-6-C-五碳糖-8-C-六碳糖苷，即vicenin 3、vicenin 1或其異構體[9]。該7個黃酮碳苷類化合物在鹽胡蘆巴中的響應較高，提示其鹽制后含量升高。

除黃酮碳苷外，胡蘆巴中還含有大量的甾體皂苷，苷元類型包括呋甾烷醇型(原diosgenin,yamogenin,neotigogenin,tigogenin,neogitogenin,gitogenin,smilagenin,sarsasapogenin)及其F環閉環的苷元即螺甾烷醇型/異螺甾烷醇型[12]。其中的呋甾烷醇型甾體皂苷在C22連有羥基，因此在質譜中的準分子離子峰為[M+Na]+同時還會觀察到其C22脫水的離子峰[M+H-H2O]+。在此基礎上162 Da的中性丟失生成碎片m/z[M+H-162]+提示其C26連有葡萄糖。而螺甾烷醇型/異螺甾烷醇型甾體皂苷在質譜中可形成[M+Na]+,[M+H]+的準分子離子峰，在此基礎上的144 Da中性丟失為E環開裂產生[13-14]。甾體皂苷在質譜中主要產生失去糖形成的碎片峰，[M+H-162]+、[M+H-146]+、[M+H-132]+分別提示存在六碳糖、甲基五碳糖和五碳糖。m/z415、m/z271(-C8H16O2,415-144 Da)、m/z253(-H2O,271-18 Da) 的碎片峰提示苷元為原yamogenin和原diosgenin以及yamogenin和diosgenin。m/z417、m/z273(-C8H16O2,417-144 Da)、(-H2O,273-18 Da)提示苷元為原neotigogenin和原tigogenin以及neotigogenin和tigogenin。m/z431、m/z287(-C8H16O2,431-144 Da)、m/z269(-H2O,287-18 Da)、m/z251(-H2O,269-18 Da) 提示苷元為原lilagenin和原yuccagenin以及lilagenin和yuccagenin。m/z433、m/z415(-H2O,433-18 Da)、m/z289(-C8H16O2,415-144 Da)、m/z271(-H2O,289-18 Da)、m/z253(-H2O,271-18 Da) 提示苷元為原neogitogenin和原gitogenin以及neogitogenin和gitogenin。在上述苷元的碎片基礎上生成142 Da中性丟失碎片提示C25和C27之間存在雙鍵[13-14]。此外，在C18柱上25S構型的甾體皂苷先于25R構型的洗脫，中基于這個洗脫規律對甾體皂苷的C25差向異構體進行鑒定[13]。由于質譜不能鑒定糖的結構以及連接位置，因此在進行甾體皂苷的鑒定時僅對糖的類型進行了鑒定，如六碳糖、五碳糖、甲基五碳糖。基于以上分析，共鑒定胡蘆巴生、鹽品中的差異性皂苷15個。其中8個為呋甾烷醇型甾體皂苷，7個在鹽制后響應降低；7個為螺甾烷醇/異螺甾烷醇型甾體皂苷，在鹽制后響應升高。推測胡蘆巴中的呋甾烷醇型甾體皂苷在鹽制過程中失去C26位葡萄糖，隨后發生側鏈環合，生成螺甾烷醇/異螺甾烷醇型甾體皂苷。

4 討論

對胡蘆巴及其鹽制品的化學成分分析結果表明，胡蘆巴經鹽制后化學成分的含量發生變化，但機制不同。黃酮碳苷在鹽制后響應升高、但在生品、鹽品中均存在、并且差異性黃酮類化合物種并無炮制后響應降低的成分，提示黃酮碳苷類成分炮制后響應升高的原因為鹽制使種質疏松、溶出增加。而呋甾烷醇型甾體皂苷結構不穩定，在加熱過程中容易轉化為螺甾烷醇型/異螺甾烷醇型甾體皂苷[15]。因此螺甾烷醇型甾體皂苷在鹽品中響應升高，而呋甾烷醇型甾體皂苷在生品中響應降低。此外，也有文獻報道在胡蘆巴中分離得到呋甾烷醇型甾體皂苷以及螺甾烷醇型/異螺甾烷醇型甾體皂苷[12，16]，表明這一轉化過程既可能發生在炮制過程中，也可能發生在對生品藥材的提取過程中。本試驗采用的樣品為甲醇超聲提取獲得，采用UPLC-QTOF-MS 分析生品樣品中含有多種呋甾烷醇型甾體皂苷，而這些皂苷在鹽制后響應降低，提示在本試驗條件下觀察得到的甾體皂苷含量及種類的變化是由炮制導致的。

表1 胡蘆巴及其鹽制品之間的差異性成分