DNA加合物組的預處理及檢測方法研究進展

李昕冉，孫銅，郭娜，張峻穎，吳春勇*

(1.中國藥科大學藥物質量與安全預警教育部重點實驗室，江蘇 南京 210009；2.中國藥科大學藥物分析教研室，江蘇 南京 211198；3.山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101;4.濟南市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濟南 250102；5.中國藥科大學中藥制劑教研室，江蘇 南京 211198)

近年來，纈沙坦、雷尼替丁和二甲雙胍等已上市藥物中意外發現遺傳毒性雜質引發了人們的極大關注。研究發現，遺傳毒性物質廣泛存在于環境中，譬如汽車尾氣、香煙、燒烤中的4-氨基聯苯[1]、苯并[α]芘[2]等多種多環芳烴、真菌產生的黃曲霉素B1[3]、染料中2-萘胺[1]、馬兜鈴酸[4]和他莫昔芬[5]等。除了外源性暴露，內源性因素如脂質過氧化產生的低分子量醛類也能造成遺傳毒性[6]。

DNA加合物是導致遺傳毒性的重要原因之一。所謂DNA加合物，是指暴露于外源或內源的親電性物質或經代謝激活后具有親電性的物質與DNA親核位點共價結合形成的化合物。若不能及時修復損傷，修飾核苷酸可能會妨礙正常的未修飾核苷酸配對，從而導致堿基的錯配、置換[7]；大體積的修飾物或DNA鏈內交聯可能使DNA鏈扭曲甚至斷裂[8]，干擾DNA復制和RNA轉錄[9]。H-ras原癌基因、p53抑癌基因等重要基因的突變以及突變蛋白引起的表型改變在腫瘤的發展過程中具有重要作用[6，9]。因此，DNA加合物被認為是癌癥的早期生物標志物以及必要不充分條件[10-11]。

1 DNA加合物的形成

許多致癌物都需要代謝激活才能DNA反應形成DNA加合物，譬如苯并[α]芘(B[α]P)[12]、2-萘胺(2-NA)[21]、3-硝基苯并蒽酮(3-NBA)[13]、2-氨基-3,8-二甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(MeIQx)[14]、2-氨基-3甲基咪唑并[4,5-f]喹啉(IQ)[15]等多環芳烴或芳香胺、N-亞硝基二甲胺(NDMA)和N-亞硝基二乙胺(NDEA)等亞硝胺類物質[16]、二氯甲烷和二氯乙烷等烷基鹵化物[17-18]、馬兜鈴酸[19]等。Ⅰ 相和Ⅱ相代謝酶在遺傳毒性物質代謝中的作用是復雜的，體內P450酶的解毒與代謝激活作用并存，代謝平衡影響其遺傳毒性[20]。

相比DNA中其他位點[21-23]，堿基加合物的發生頻率更高[24]。修飾物最常加合在堿基的氮氧原子、嘌呤的C8原子以及嘧啶的C5和C6上[10](見圖1)。由于親核性最高，鳥嘌呤的N7(如黃曲霉素B1的加合物AFB1-N7-Gua)和腺嘌呤的N3是最易被攻擊的位點，且位于DNA雙螺旋大溝中的鳥嘌呤N7比位于小溝的腺嘌呤N3位點更容易形成加合物。多環芳烴、芳香胺等遺傳毒性物質更多加合在嘌呤的C8位[8](如4-氨基聯苯的加合物dG-C8-4-ABP)。乙醛[25]、巴豆醛[26]等醛類物質還可以與鳥嘌呤的N1和環外氮成環(如形成加合物1,N2-propano-dG)。氮芥(nitrogen mustard)形成單加合物后又形成了新的親電中間體(G-NM-G)，可以與蛋白質親核側鏈反應產生DNA-蛋白質交聯[27]或攻擊另一個堿基形成DNA鏈內或鏈間交聯[28-29]。

圖1 常見的DNA反應位點及DNA加合物[5,10,15,25]

2 DNA加合物的分析方法

DNA加合物的發生頻率很低，106～109個核苷中才會產生一個加合物[30]，因此加合物分析極具挑戰性。32P-后標記法曾經是最常使用的檢測方法[31]，1～10 μg DNA可以檢測到1個加合物/1010個堿基[32]。但32P-后標記操作煩瑣，不同加合物的酶解和32P標記效率不同，重現性較差，放射性元素的使用也大大限制了此法的使用[6,32]。免疫分析方法利用抗原抗體的特異性結合，將加合物的定量信息轉化為熒光或放射信號，可對加合物進行原位分析，觀察其在組織或細胞中的分布[33]。免疫分析不需要酶解DNA，操作簡便，結合校正曲線可實現加合物的半定量[33]。但此法所需的樣品量較大，需要有待測加合物對應的特異性抗體，可能存在的交叉免疫反應也會出現高估情況[34-35]。

液質聯用法具有優秀的選擇性以及與32P后標記法相當的靈敏度，加之能提供加合物的結構信息，近來已成為DNA加合物最廣泛使用的檢測方法[6,36]。提取的DNA進行水解，得到2′-脫氧核苷混合物，經液相分離后進入質譜檢測器，由于含有能量較低的糖苷鍵，容易失去2′-脫氧核糖部分(dR)，從而發生-116 Da(高分辨率116.047 3 Da)的中性丟失[37]，利用這一特征可對加合物進行定性定量分析。有的DNA加合物在熱解或中度酸性條件下穩定性較差，堿基易從加合物上脫落，質譜分析還可以對堿基的中性丟失進行掃描[24,38]。

已知DNA加合物的檢測可以根據其分子量、熱穩定性等性質，設計具體的靶向檢測方案。然而，環境中的遺傳毒性物質來源復雜，僅從個別DNA加合物的角度解釋其與特定腫瘤之間的關系可能并不全面，有必要同時檢測多個已知或未知的DNA加合物，篩查潛在的遺傳毒性物質。“組學”能從整體角度研究機體變化，其概念早已運用于基因組學、蛋白組學和代謝組學，也適用于DNA加合物的檢測。Yao等[39]以此法在香煙浸出物孵育的卵泡細胞(follicular cells)中鑒定出4種與苯并[α]芘和4-氨基聯苯有關的DNA加合物。DNA加合物組學可以通過同時檢測多個已知或未知的DNA加合物水平來預測遺傳毒性風險，加深DNA加合物在腫瘤發展進程作用的理解，未來很可能成為比單一加合物更可靠的生物標志物[32]。

3 液質聯用DNA加合物組的研究進展

液質聯用法檢測DNA加合物，首先需要將DNA從待測樣本中提取出來，水解成單核苷，經過富集純化后使用液質聯用法對加合物進行檢測，其中每個步驟都可能影響到分析結果，譬如不同的提取方法影響DNA的純度和得率，在線富集可以減少離線純化加合物的損失，不同溶劑富集加合物效果以及引入的基質效應各有不同，甚至不同品牌的玻璃內襯管也會影響樣品的清潔度和提取回收率[6,40-41]。

3.1 DNA水解 目前直接分析DNA鏈和寡核苷酸上甲基以外的修飾物或其他DNA結構變化還較為困難[8]，研究者可以通過核酸酶、酸或熱等手段將DNA水解為易于分析的小分子，不過水解的同時也丟失了加合物在DNA序列中的位置信息。甲酸或鹽酸配合70～90 ℃的高溫是常用的DNA酸水解方法[42-44]，Tang等[45]將L02細胞和293T細胞用致癌性烷基化試劑1-甲基-1-亞硝基脲(MNU)、甲磺酸甲酯(MMS)和4-甲基亞硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮(NNK)孵育，然后從細胞中提取DNA加入0.1 nmol·L-1的鹽酸，85 ℃酸水解1 h，測得的烷基化核苷加合物的濃度RSD小于15%。然而，高溫和酸性條件有較大的降解風險，相較而言，酶解條件更加溫和，因此更常用于DNA的處理(見表1)。

表1 液質聯用DNA加合物檢測常用的DNA水解酶種類、孵育濃度及時間

磷酸二酯酶可酶解核苷酸之間的磷酸二酯鍵，是DNA水解過程中常用的核酸外切酶。磷酸二酯酶Ⅰ(PDE Ⅰ)的酶解方向為3′到5′，將5′-核苷酸游離出來。磷酸二酯酶Ⅱ(PDE Ⅱ)酶解方向則相反，酶解產物為3′-核苷酸。PDE Ⅰ常與脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)和核酸酶P1(NP1)配合使用，其中DNase I的作用是將長鏈DNA酶解成寡核苷酸，NP1則是酶解寡核苷酸和單鏈DNA[19,24,46]，有些序列的DNA具有磷酸二酯酶抗性，PDE Ⅰ無法完全水解寡核苷酸，加入NP1有助于寡核苷酸完全水解[47]；PDE Ⅱ則常搭配非特異性核酸酶微球菌核酸酶(MN)[2,48-49]；兩種磷酸二酯酶有時也會同時使用[50-51]。為了便于質譜分析，生成的核苷酸還要經過堿性磷酸酶(AP)水解為核苷。

動物來源的DNase Ⅰ較為復雜，研究發現DNase Ⅰ是加合物檢測中引起背景干擾和基質效應的重要因素之一。Guo等[37,41]將PDE Ⅰ 酶解方案中的DNase Ⅰ用量降低或者換成純度更高的重組內切酶Benzonase，發現上述問題得到了很大改善。此外，來自不同品牌的核酸酶也可能影響DNA加合物的檢測，來自Sigma-Aldrich和Merck兩個品牌的PDE Ⅱ 具有不同的脫氧腺苷脫氨酶活性和3′-磷酸酶活性，可能對堿基上含有裸露環外氨基的加合物有不同影響[48]。不論是酸水解還是酶解，應考慮處理過程中DNA加合物的穩定性。為更好保證結果的可靠性，最好有同位素標記的加合物內標進行校正。

3.2 液相色譜條件 十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱在DNA加合物及DNA加合物組學的分析中最為常用[1,4，37，52-53]。此外，Tang等[45]使用酰胺柱分離了14種烷基化修飾核苷和未修飾核苷。Murakami等[30]則使用氨基甲酰基鍵合的親水相互作用色譜(HILIC)柱，將有機相比例提高到90%，從而提高電噴霧離子源(ESI)的離子化效率。

Zhang等[26,36]以巴豆醛或丙烯醛的DNA加合物為對象，比較了液質色譜法中常用的流動相添加劑對DNA加合物質譜響應的影響，發現與甲酸銨、乙酸銨和甲酸相比，流動相中加入碳酸氫銨后的檢測靈敏度最高，推測碳酸氫銨抑制了質譜響應較差的金屬陽離子-DNA加合物的形成，且HCO3-在離子源中降解形成CO2和水，有利于加合物的質子化。Murakami等[30]發現高比例有機溶劑(90%乙腈)的流動相中加入碳酸氫銨，也可以提高乙基加合物和巴豆醛加合物的質譜響應。有研究報道乙腈作為流動相質譜響應高于甲醇[45,54]，但甲醇洗脫能力弱于乙腈，達到相同的保留時間所需的有機相比例更高，有機相的選擇還需針對具體情況進行優化。

ESI電離效率隨著流速降低而提高，將色譜柱內徑減小至毛細管尺寸，流動相流速降低至以nL·min-1為單位(nanoflow)，與特制的微米級甚至納米級離子源(nano-ESI)配合，產生更小的初始液滴，可以提高電離過程中的去溶劑作用，而且更小的液滴包含更少的待測物，減少了待測物電荷之間的聚集和競爭，可以極大提升檢測靈敏度[55]。Xiao等[46]使用Nano-LC-Orbitrap MSn分析了前列腺癌癥患者切除的前列腺中的DNA加合物，采用2.5 μg DNA，定量限為1.3～2.2個加合物/109個核苷。Ma等[56]換用NanoESI離子源，將分析靈敏度在原有方法的基礎上提高了7倍。

3.3 質譜掃描模式 除了靶向檢測待測DNA加合物或利用中性丟失掃描模式(CNL)篩選未知DNA加合物外，還有許多基于中性丟失原理優化和發展而來的質譜掃描模式(圖1)。Kanaly等[57]使用電噴霧串聯質譜的多反應監測模式(MRM)，在m/z228.8 ～ 602.8的范圍內檢測了374個[M+H]+>[M+H-116]+離子對，該模式也稱偽中性丟失模式(Pseudo-CNL)，符合條件的離子結合人工篩選、穩定同位素稀釋以及與對照品比較，確認了吸煙者肺組織中多個氧化加合物的存在。Pseudo-CNL模式需要多次進樣，但其靈敏度優于CNL模式[37]。譬如，在CT-DNA消化前摻入相同量的加合物對照品，采用掃描300個離子對的Pseudo-CNL模式，加合物dG-C8-4-ABP的檢測靈敏度是CNL模式的2.8倍，而加合物dG-C8-PhIP在CNL模式下甚至無法檢出。單個離子掃描時間越多，色譜峰越平滑，背景信號越低，因此需要平衡檢測的離子對數與進樣次數。需要注意的是，僅依靠-116 Da中性丟失的特征不足以確定色譜峰對應成分就是DNA加合物，通過CNL模式和Pseudo-CNL模式發現的DNA加合物仍需進一步進行鑒定。Bessette等[58]率先使用線性離子肼質譜(LIT-MS)對產生116 Da中性丟失的產物離子進行三級掃描(CNL-MS3)，發現此法可以提供更多的結構信息。Balbo等[59]改用Obitrap高分辨質譜，為DNA加合物鑒定提供了更有利的支持。受限于現有儀器掃描速度不足，CNL-MS3模式無法掃描所有離子，數據采集更傾向于豐度較大的離子，導致低豐度加合物的信息丟失。與此相比，數據非依賴型采集模式(DIA)不依賴離子豐度，可以無偏向的收集目標m/z范圍內的所有母離子(Precursor ions)及其MS2光譜。蛋白質組學中的SWATH(Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra)掃描模式將MS2掃描分割成更小的窗口，簡化了復雜的MS2數據處理，同時提高MS2的質量[60]。Guo等[37]借鑒并優化了SWATH掃描模式，將MS掃描分為寬度為30m/z掃描窗口(wide-SIM/MS2)，成功用于DNA加合物組學的檢測，提高了母離子和碎片離子的檢測靈敏度。該掃描方式不僅可以檢測以糖基中性丟失為特征的DNA加合物，還可以在不重新進行數據采集的情況下挖掘丟失堿基或其他質譜碎裂模式的DNA加合物相關信息。

3.4 數據處理 Murray等[52]開發了一種新的檢測算法DFBuilder，結合碎片過濾的開源軟件MZmine，建立了一個篩選和推定DNA加合物的自動化數據分析流程，減少了數據分析的處理時間和難度(見圖2)。Turesky和Villalta實驗室[61]為促進DNA加合物鑒定和數據挖掘，聯合多個合作者建立一個DNA加合物開源數據庫，其中DNA加合物對照品的高分辨質譜圖均來自Q-TOF和Orbitrap這兩個最常用的高分辨質譜平臺，為DNA加合物的檢測和鑒定提供了方便。高分辨質譜儀對于DNA加合物的鑒定具有重要作用，但檢測的高成本限制了它的廣泛使用。Chang等[62]使用組學分析方法中常用到的多變量分析方法-偏最小二乘判別分析法(PLS-DA)，有效排除了QqQ-MS的假陽性結果，更廣泛使用的低分辨質譜結合數據處理，或許能提供與高分辨質譜相當的功能。

A.中性丟失掃描模式(CNL)[39]；B.偽中性丟失掃描模式(Pseudo-CNL)[57]；C.中性丟失觸發三級質譜的掃描方式(CNL-MS3)[58-59]；D.SWATH(Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra)掃描模式[60]；E.廣泛選擇離子監測串聯質譜(wide-SIM/MS2)[37]圖2 DNA加合物檢測中常用的質譜掃描模式[10]

4 總結與展望

近年來新的樣品處理方式、液質聯用儀器和掃描方法、數據處理方式不斷發展，DNA加合物組學技術也在逐漸成為多種DNA加合物同時檢測以及未知加合物篩查的有力工具。DNA加合物的樣品前處理較為煩瑣，水解時間長，修飾核苷需要富集和分離。DNA加合物組數據，特別是從復雜基質中采用數據非依賴模式采集的數據，需要先依據中性丟失等特征進行篩選，再結合碎片離子信息和暴露源等情況，才能判斷該離子是否是DNA加合物以及是否有未知的遺傳毒性物質存在。更加簡便易行的樣品處理標準流程、數據處理工具和通用數據庫還需要進一步開發，遺傳毒性物質與癌癥等疾病之間更深層次的關聯以及DNA損傷修復等問題也需要更深入的研究。