鑒定并驗(yàn)證KIF20B對(duì)高級(jí)別漿液性卵巢癌的影響

趙靜 王雅卓 王潤(rùn)芳 李娜 褚兆蘋 韓華 趙源 王蓓 田菲 張媛 張?zhí)N霞

上皮性卵巢癌(EOC)是惡性程度最高的婦科腫瘤之一[1]。大多數(shù)患者早期無(wú)明顯不適，診斷時(shí)已為晚期[2]，這在很大程度上解釋了這種惡性腫瘤預(yù)后差的原因。上皮性卵巢癌是一種包含多種組織學(xué)亞型的異質(zhì)性疾病[2]，但其癌變機(jī)制尚未完全闡明。根據(jù)二元癌變模型理論，卵巢癌包括Ⅰ型和 Ⅱ型兩類[3]。Ⅰ型腫瘤通常是惰性的，以信號(hào)通路相關(guān)基因(KRAS、BRAF、PIK3CA、CTNNB1、ARID1A、PPP2R1A和PTEN)突變?yōu)樘卣鳎ǖ图?jí)別漿液性、黏液性、子宮內(nèi)膜樣癌和透明細(xì)胞癌及Brenner瘤等[3]。與Ⅰ型腫瘤相比，Ⅱ型腫瘤侵襲性強(qiáng)，基因穩(wěn)定性差，常含有p53和BRCA1/2突變，包括高級(jí)別漿液性癌、子宮內(nèi)膜樣癌和未分化癌等[3,4]。其中致死率最高的高級(jí)別漿液性卵巢癌(HGSOC)[5，6]患者雖然對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療(包括減瘤手術(shù)和基于鉑的化療)反應(yīng)良好，但他們之中很多人術(shù)后不久卻因?yàn)槟退幋蟠蠼档土松媛蔥7]。在過(guò)去的十年中，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)療法治療的患者的生存率也僅有微小的改善，因此闡明其分子機(jī)制和發(fā)現(xiàn)新的分子生物標(biāo)志物對(duì)于HGSOC具有非常重要的意義[8]。慶幸的是，生物信息學(xué)技術(shù)的大力發(fā)展使得我們可以利用大數(shù)據(jù)篩選目標(biāo)基因并對(duì)其進(jìn)行探究分析，也為后續(xù)的基礎(chǔ)研究及臨床實(shí)踐提供了重要的理論依據(jù)。在我們的研究中，首先使用R語(yǔ)言分析了來(lái)自Gene Expression Omnibus (GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)中的3個(gè)表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集，以確定HGSOC與正常人類卵巢表面上皮樣本(HOSE)之間的差異基因。并通過(guò)GO[9]、KEGG[10]通路富集分析和PPI網(wǎng)絡(luò)分析，揭示了HGSOC可能相關(guān)的分子機(jī)制，并挖掘出176個(gè)差異基因(DEGs)，在這176個(gè)差異基因中我們使用MCODE插件鑒定出22個(gè)核心基因，在這22個(gè)核心基因中我們發(fā)現(xiàn)KIF20B在HGSOC中顯著高表達(dá)，為了鑒定并驗(yàn)證KIF20B作為卵巢癌生物標(biāo)志物的可行性及對(duì)卵巢癌的影響，我們隨機(jī)對(duì)其進(jìn)行了生存曲線分析，ROC曲線分析及其與免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性分析，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取與差異基因分析 為了探索高級(jí)別漿液性卵巢癌的相關(guān)基因，我們從GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) Affymetrix GPL570平臺(tái)[11]通過(guò)使用R包中GEOquery包下載了3個(gè)微陣列數(shù)據(jù)集(GSE18520[12]， GSE27651[13]， GSE40595[14])。其中，GSE 18520數(shù)據(jù)集包含53個(gè)高級(jí)別漿液性卵巢癌組織樣本(HGSOC,n=53)和10個(gè)正常人類卵巢表面上皮樣本(HOSE,n=10)。GSE27651含有6個(gè)人卵巢表面上皮細(xì)胞(HOSE,n=6)和22個(gè)高級(jí)別漿液性卵巢癌(HGSOC,n=22)。GSE40595包含32個(gè)來(lái)自高級(jí)別漿液性卵巢癌患者(HGSOC,n=32)和6個(gè)正常人類卵巢表面上皮樣本(HOSE,n=6)。使用limma包進(jìn)行差異基因分析，|logFC (fold change)| >2和P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了直觀地顯現(xiàn)差異基因表達(dá)的情況，我們利用R包中的ggplot2對(duì)3個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異基因(DEGs)分析，并使用韋恩圖進(jìn)行可視化。

1.2 功能富集分析 為了進(jìn)一步系統(tǒng)地分析DEGs的功能注釋，我們使用了R中的clusterProfiler包[15]進(jìn)行GO和KEGG分析，并利用org.Hs.eg.db包進(jìn)行基因ID轉(zhuǎn)換，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因鑒定 我們使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù) (http://string-db.org )[16]和Cytoscape (version 3.4.0)[17]繪制了蛋白蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)，并使用Cytoscape中的MCODE插件 (version 1.4.2)分析出互作關(guān)系中最強(qiáng)大的模塊，這些模塊中的基因即為核心基因。MCODE評(píng)分>5, degree cut-off=2, node score cut-off=0.2, Max depth=100, k-score=2差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 核心基因與生存預(yù)后關(guān)系分析 為了深入挖掘與預(yù)后相關(guān)的基因，我們利用Kaplan-Meier Plotter (http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&

cancer = ovar)[18]數(shù)據(jù)庫(kù)分析核心基因表達(dá)與高級(jí)別漿液性卵巢癌患者總生存期(OS)和無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)的關(guān)系，篩選出對(duì)HGSOC生存及預(yù)后有影響的靶標(biāo)基因。

1.5 預(yù)后標(biāo)志物鑒定 為了探究靶標(biāo)基因KIF20B作為卵巢癌生物標(biāo)志物的可行性及預(yù)測(cè)能力，我們使用pROC包[1.17.0.1版本]對(duì)TCGA中的卵巢癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行KIF20B的ROC曲線分析，并使用ggplot 2包[3.3.3版本]進(jìn)行可視化展現(xiàn)。

1.6 靶標(biāo)基因與腫瘤細(xì)胞免疫浸潤(rùn)分析 為了明確靶標(biāo)基因KIF20B是否通過(guò)調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境影響患者預(yù)后，我們使用R中的GSVA包[1.34.0版本]對(duì)靶標(biāo)基因KIF20B進(jìn)行免疫浸潤(rùn)分析，并在TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)中加以驗(yàn)證,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 KIF20B的分子相關(guān)性分析 為了探究與KIF20B密切相關(guān)的分子以探究其作用機(jī)制，我們使用R 的ggplot2[3.3.3版本]對(duì)TCGA數(shù)據(jù)集進(jìn)行KIF20B的分子相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.8 免疫組化驗(yàn)證KIF20B在HGSOC中的表達(dá) 選自河北省人民醫(yī)院2018至2021年行手術(shù)切除并且病理證實(shí)為高級(jí)別漿液性卵巢癌組織及正常卵巢組織所制標(biāo)本蠟塊各20塊。卵巢癌組織均為原發(fā)性腫瘤，正常卵巢組織均為因子宮肌瘤、功能性異常子宮出血、子宮脫垂等良性疾病切除子宮的同時(shí)切除卵巢的病例，病理證實(shí)卵巢組織無(wú)異常。采用SP法進(jìn)行免疫組化染色，DAB顯色后發(fā)現(xiàn)KIF20B定位于胞漿，呈現(xiàn)黃色或棕褐色為陽(yáng)性。顯微鏡下隨機(jī)選10個(gè)高倍鏡視野(×400)結(jié)果判定：按細(xì)胞顯色有無(wú)及深淺計(jì)分：0分為無(wú)色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；按顯色細(xì)胞所占比例計(jì)分：0分<1%，1分1%～10%，2分11%～25%，3分26%～50%，4分51%～75%，5分>75%，二者乘積之和即為該切片積分，>5分認(rèn)為為陽(yáng)性染色，由兩位資深病例學(xué)專家單獨(dú)評(píng)定，并達(dá)成一致意見。

2 結(jié)果

2.1 差異基因鑒定 我們使用GEOquery包識(shí)別出GSE18520中的698個(gè)基因，GSE27651中的568個(gè)基因，GSE40595中的1 012個(gè)基因。其中，GSE18520中高表達(dá)基因404個(gè)，低表達(dá)基因294個(gè);GSE27651中高表達(dá)基因357個(gè)，低表達(dá)基因211個(gè); GSE40595中高表達(dá)基因160個(gè)，低表達(dá)基因852個(gè)。3個(gè)數(shù)據(jù)集的重疊部分包含176個(gè)差異基因，如韋恩圖所示，提示這176個(gè)差異基因可能對(duì)HGSOC具有重要意義，值得深入研究。見圖1。

圖1 韋恩圖

2.2 功能富集分析 我們使用R中的clusterProfiler包對(duì)176個(gè)DEGs進(jìn)行了功能富集分析。DEGs的生物學(xué)過(guò)程(BP)在核染色體分離、核有絲分裂中顯著富集；細(xì)胞組分(CC)的變化主要集中在紡錘體、著絲粒區(qū)；分子功能(MF)主要在糖胺聚糖結(jié)合，肝素及含硫化合物等結(jié)合方面富集。提示這些差異基因主要與細(xì)胞周期及糖代謝等功能相關(guān)。見圖2。

圖2 功能富集分析

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因鑒定 我們使用Cytoscape構(gòu)建DEGs的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)，并找到最強(qiáng)大的模塊從而確定出聯(lián)系最緊密的22個(gè)核心基因。見圖3、4。

圖3 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 核心基因

2.4 核心基因與生存預(yù)后關(guān)系分析 我們利用Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)22個(gè)核心基因進(jìn)行生存分析。我們發(fā)現(xiàn)在HGSOC患者中核心基因KIF20B的高表達(dá)與低表達(dá)患者的PFS和OS差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示該基因的差異表達(dá)對(duì)HGSOC患者預(yù)后有顯著影響。見圖5。

圖5 KIF20B的差異表達(dá)對(duì)HGSOC患者生存預(yù)后的影響

2.5 預(yù)后標(biāo)志物鑒定 我們利用R語(yǔ)言對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中漿液性囊腺癌樣本進(jìn)行KIF20B的ROC曲線分析，曲線下面積AUC為0.875，提示KIF20B對(duì)于卵巢癌患者的預(yù)后具有較好的預(yù)測(cè)性。見圖6。

圖6 TCGA數(shù)據(jù)集中KIF20B的ROC曲線分析圖

2.6 靶標(biāo)基因與腫瘤細(xì)胞免疫浸潤(rùn)分析 腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的分布是判斷患者淋巴結(jié)狀況的重要指標(biāo)。我們使用R中GSVA包對(duì)靶標(biāo)基因KIF20B進(jìn)行免疫分析時(shí)發(fā)現(xiàn)KIF20B高表達(dá)患者的T細(xì)胞富集程度低于低表達(dá)患者(P<0.05)，提示KIF20B可能參與調(diào)節(jié)HGSOC患者免疫浸潤(rùn)從而影響患者的生存預(yù)后。TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)檢索進(jìn)一步顯示卵巢癌患者KIF20B的表達(dá)與B細(xì)胞的浸潤(rùn)程度呈負(fù)相關(guān)，與CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度呈正相關(guān)(P<0.05)。見圖7、8。

圖7 KIF20B差異表達(dá)對(duì)HGSOC患者T細(xì)胞富集程度的影響

圖8 KIF20B的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度的相關(guān)性

2.7 KIF20B的分子相關(guān)性分析 為了探究與KIF20B密切相關(guān)的分子以探究其作用機(jī)制，我們使用R 的ggplot2[3.3.3版本]對(duì)TCGA數(shù)據(jù)集進(jìn)行KIF20B的分子相關(guān)性分析，結(jié)果提示KIF20B與BIRC5及BCL2A1的表達(dá)密切相關(guān)。

2.8 KIF20B在HGSOC患者中呈高表達(dá) 我們對(duì)20塊HGSOC及20塊HOSE組織蠟塊進(jìn)行免疫組化染色后分析發(fā)現(xiàn)在HGSOC患者中KIF20B的陽(yáng)性表達(dá)率(17/20≈85%)顯著高于在HOSE患者中的陽(yáng)性表達(dá)率(1/20≈5%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證符合生信分析數(shù)據(jù)結(jié)果。見圖9。

圖9 KIF20B在HGSOC組織中的免疫組化染色結(jié)果

3 討論

上皮性卵巢癌分為兩型，Ⅰ型腫瘤是低級(jí)別的、生長(zhǎng)緩慢的卵巢腫瘤。而Ⅱ型腫瘤是高級(jí)別的、侵襲性強(qiáng)惡性程度極高的卵巢腫瘤[19]，其中HGSOC在上皮卵巢癌中占>60%，而在卵巢癌死亡病例中占>70%[20，21]，所以確定HGSOC的特異性生物標(biāo)志物和靶標(biāo)基因?qū)τ谔岣呗殉舶┑脑缙跈z測(cè)和預(yù)防率非常重要，并可能為治療晚期卵巢癌提供有利幫助。

在我們的研究中發(fā)現(xiàn)HGSOC和HOSE之間有176個(gè)DEGs。GO的變化主要富集在染色體分離、紡錘體中,之前的已有的研究表明細(xì)胞周期的失調(diào)可能在腫瘤的癌變過(guò)程中發(fā)揮重要作用[22-24]，這與我們的發(fā)現(xiàn)相一致。在挖掘到的22個(gè)核心基因中，我們發(fā)現(xiàn)KIF20B的表達(dá)可以顯著影響卵巢癌患者的生存和預(yù)后。KIF20B是參與有絲分裂磷酸化蛋白的家族成員之一，它是一種緩慢正端定向的驅(qū)動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白，并在G2/M轉(zhuǎn)變時(shí)被磷酸化，它有固定的表達(dá)定位與表達(dá)模式，主要表達(dá)于細(xì)胞核，但我們的免疫組化結(jié)果提示它在卵巢組織中表達(dá)于胞漿。眾多研究提示它可以促進(jìn)膀胱癌、肝癌、結(jié)直腸癌、腎細(xì)胞癌、舌癌和乳腺癌等多種惡性腫瘤的進(jìn)展[25-30]。Chen等[31]的研究發(fā)現(xiàn)，KIF20B 可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖，并可能成為胰腺癌的潛在治療靶點(diǎn)。Alahmad等[32]的研究還發(fā)現(xiàn)KIF20B可能是參與陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿患者免疫缺陷機(jī)制的自身靶標(biāo)抗原。而迄今為止，關(guān)于KIF20B對(duì)于卵巢癌尤其是高級(jí)別漿液性卵巢癌的影響尚不明確。我們的研究發(fā)現(xiàn)KIF20B在HGSOC患者中呈高表達(dá)，低表達(dá)患者的PFS與OS顯著優(yōu)于高表達(dá)患者，提示KIF20B的差異表達(dá)與HGSOC患者預(yù)后密切相關(guān)。ROC曲線分析中AUC>0.75，提示KIF20B對(duì)于卵巢癌預(yù)后具有很好的預(yù)測(cè)性，基于此研究結(jié)果，我們推薦KIF20B作為卵巢癌的生物標(biāo)志物指導(dǎo)預(yù)后，當(dāng)然這也需要后續(xù)的臨床研究加以驗(yàn)證。凋亡抑制因子5(BIRC5)通過(guò)抑制凋亡促進(jìn)多種惡性腫瘤的增殖侵襲，B淋巴細(xì)胞瘤2相關(guān)蛋白1(BCL2A1)與免疫微環(huán)境息息相關(guān)，分子相關(guān)性分析提示KIF20B與這兩個(gè)基因密切相關(guān)，提示KIF20B可能通過(guò)抑制凋亡促進(jìn)卵巢癌的增殖侵襲，并且可能參與調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境。R中GSVA包與TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)KIF20B在卵巢癌中的免疫分析提示，KIF20B在正常卵巢組織及腫瘤組織中免疫浸潤(rùn)程度具有顯著差異，再次提示KIF20B或可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境影響卵巢癌的進(jìn)展，但機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)綜合的生物信息學(xué)分析，篩選出靶標(biāo)基因KIF20B，并發(fā)現(xiàn)其與高級(jí)別漿液性卵巢癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，對(duì)于卵巢癌預(yù)后具有良好的預(yù)測(cè)性，可作為預(yù)測(cè)卵巢癌預(yù)后的生物標(biāo)志物，分子相關(guān)性分析及免疫浸潤(rùn)分析提示其可能通過(guò)抑制凋亡及參與調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境促進(jìn)卵巢癌的增殖侵襲，雖然我們已經(jīng)驗(yàn)證了KIF20B在卵巢癌組織中的表達(dá),但仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)和分析其具體作用機(jī)制。