化瘀通絡(luò)中藥對糖尿病腎病大鼠腎臟足細(xì)胞密度的干預(yù)作用*

白璐，陳志強(qiáng)

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院腎內(nèi)科，石家莊 050051；2.河北中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)二科，石家莊 050011）

蛋白尿是糖尿病腎病（DN）主要的臨床表現(xiàn)，亦是腎小球?yàn)V過屏障受損的重要標(biāo)志。腎小球?yàn)V過屏障由內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球基底膜（GBM）及足細(xì)胞組成，其結(jié)構(gòu)和功能的改變是蛋白尿產(chǎn)生的病理生理基礎(chǔ)[1-3]。足細(xì)胞貼附于GBM表面，是一種終末分化的多突狀細(xì)胞，是維持整個腎小球?yàn)V過膜正常通透性的主要成份，其損傷及脫落對于蛋白尿的形成具有重要作用[4]。有研究表明DN患者從尿中丟失的足細(xì)胞數(shù)與患者的尿蛋白量呈正相關(guān)關(guān)系[5-6]，說明足細(xì)胞對GBM的黏附失常造成其脫落，是DN蛋白尿發(fā)生的主要原因之一。α3β1整合素是介導(dǎo)足細(xì)胞與基底膜連接的膜蛋白，主要對足細(xì)胞的黏附功能起作用，使足細(xì)胞黏附于GBM的Ⅳ型膠原、層黏連蛋白和纖維連接蛋白上，其表達(dá)量的改變會使足細(xì)胞與GBM的黏附性下降，出現(xiàn)足細(xì)胞脫落，表明其與足細(xì)胞數(shù)量的丟失及蛋白尿的多少密切相關(guān)[7]。腎母細(xì)胞瘤抑制基因（WT1）是足細(xì)胞特異性標(biāo)志基因，可以標(biāo)記足細(xì)胞核數(shù)量，有研究報道DN足細(xì)胞損傷與WT1在腎臟的表達(dá)量下降有緊密關(guān)系[8]，隨著DN足細(xì)胞損傷脫落的發(fā)展，WT1在腎臟的表達(dá)量也明顯下降。

隨著瘀血阻絡(luò)理論在DN發(fā)病中的重要作用進(jìn)一步被認(rèn)可，化瘀通絡(luò)中藥在治療DN時成為組方中必要的組成部分，前期研究證實(shí)該類中藥治療DN蛋白尿療效確切，能減輕DN大鼠腎臟纖維化、保護(hù)足細(xì)胞、抑制腎臟氧化應(yīng)激、減輕炎癥反應(yīng)[9-12]。此本研究意在探討化瘀通絡(luò)中藥能否通過干預(yù)α3β1整合素的表達(dá)減少足細(xì)胞脫落從而減少蛋白尿，以期為化瘀通絡(luò)中藥在臨床上的推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠40只，清潔級，體質(zhì)量（120±20）g，購買于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK（冀）2018-1-004。

1.2 藥物 化瘀通絡(luò)中藥顆粒劑：丹參（1.8 g/袋，相當(dāng)于飲片 10 g，批號 501306T）、川芎（1.3 g/袋，相當(dāng)于飲片 6 g，批號 412272T）、水蛭（1.5g/袋，相當(dāng)于飲片 3 g，批號 408245T）、地龍（1.0 g/袋，相當(dāng)于飲片 10 g，批號 501153T）、全蝎（1.0 g/袋，相當(dāng)于飲片3 g，批號412299T），廣東一方制藥有限公司惠贈。厄貝沙坦片（0.15g/片，批號 4A293），由賽諾菲（杭州）制藥有限公司生產(chǎn)。

1.3 試劑儀器 鏈脲佐菌素（STZ，Enzo公司，貨號04081408），TRIquick Reagent（北京Solarbio公司，貨號：R1100），F(xiàn)astQuant cDNA第一鏈合成試劑盒（北京天根生化科技有限公司，貨號：KR202）、Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG（美國 invitrogen公司，貨號：11733046），引物（上海生工生物工程公司），腦脊液與尿蛋白測定試劑盒（終點(diǎn)法，北京利德曼生化股份有限公司，貨號：2400134），兔多克隆抗體Integrin α3（ITGA3，武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BA0955），兔多克隆抗體 Integrin β1（ITGB1，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號：bs-0486P），兔多克隆抗體WT1（美國ABclone公司，貨號：A2446）。穩(wěn)豪型血糖儀（強(qiáng)生有限公司），NanoDrop2000C紫外分光光度計(jì)（美國Thermo Scientific公司），Eco實(shí)時定量PCR儀（美國illumina公司），BX63+DP72正置研究級顯微鏡（日本OLYMPUS株式會社），MICROM-340E石蠟切片機(jī)（德國Zeiss公司）。

1.4 造模、分組和給藥 健康雄性SD大鼠40只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。隨機(jī)選取8只大鼠為正常組（C組），給予普通飼料飼養(yǎng)，剩余32只大鼠給予高糖高脂飼料飼養(yǎng)（由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心加工制作），飼養(yǎng)6周后所有大鼠禁食不禁水12 h，按35 mg/kg腹腔注射1%STZ溶液，72 h后尾靜脈取血檢測血糖，血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠（DM）模型復(fù)制成功。共3只大鼠檢測血糖不達(dá)標(biāo)剔除，將成模大鼠隨機(jī)分為模型組（M組）10只，厄貝沙坦組（I組）10只，中藥組（Z組）9只。大鼠成模后給藥干預(yù)，按照人用藥的配伍比例及大鼠與人的體表面積計(jì)算，化瘀通絡(luò)中藥成人口服劑量：丹參15 g，川芎 12 g，地龍 10 g，水蛭 6 g，全蝎 6 g，大鼠每日灌胃給藥劑量為丹參1.41 g/kg，川芎1.12 g/kg，地龍 0.94 g/kg，水蛭 0.56 g/kg，全蝎 0.56 g/kg，厄貝沙坦組以14.12 mg/kg灌胃，連續(xù)給予20周。

1.5 標(biāo)本的收集 大鼠灌胃20周末，代謝籠收集24h尿液并測量尿量，尿液離心半徑8 cm，3 000 r/min離心15 min后取上清液，終點(diǎn)法行24 h尿蛋白定量檢測。所有大鼠禁食8 h以10%水合氯醛0.35 mL/100 g腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，離心后取血清用于血液指標(biāo)檢測，快速分離腎臟，留取腎皮質(zhì)用于腎臟病理、實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、免疫組化（IHC）檢測。

1.6 觀察指標(biāo)及方法

1.6.1 生化指標(biāo)檢測 尿蛋白濃度采用終點(diǎn)法檢測，尿蛋白濃度×24 h尿量得出24 h尿蛋白總量（24 h UTP）。所有大鼠禁食8 h尾靜脈采血檢測空腹血糖（FBG）。采用BECKMAN CX7全自動生化分析儀按試劑盒操作檢測血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）。

1.6.2 光鏡觀察腎臟病理 預(yù)冷的FAA固定液固定腎皮質(zhì)，常規(guī)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（厚度2 μm）、二甲苯脫蠟、乙醇梯度水化后，蘇木精-伊紅染色（HE）、過典酸雪夫氏染色（PAS），封片，顯微鏡下放大400倍采集圖像。

1.6.3 RT-PCR 檢測 ITGA3、ITGB1、WT1 mRNA 的表達(dá) 采用TRIquick提取腎組織總RNA，檢測其濃度及純度，將OD260/OD280比值在1.8～2.0之間的RNA樣品，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將cDNA放于熒光定量PCR儀擴(kuò)增。采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（引物序列見表1），反應(yīng)條件為UDG Incubation 50℃2 min、Polymerase Activation 95 ℃ 10 min、95 ℃ 10 s、60 ℃40 s共40個循環(huán)。融解曲線條件：95℃15 s、55℃15 s、95℃15 s，建立融解曲線檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。數(shù)據(jù)分析采用ΔΔCq法進(jìn)行相對定量，以βactin作為內(nèi)參，正常組設(shè)置為對照組，相對表達(dá)量（Relative Quantification）=2-ΔΔCq；ΔCq=目的基因 Cq平均值-內(nèi)參Cq平均值；ΔΔCq=實(shí)驗(yàn)組ΔCq-對照組ΔCq，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

表1 大鼠基因引物序列Tab.1 Primers for rat genes

1.6.4 IHC 檢測 ITGA3、ITGB1、WT1 蛋白的表達(dá)切取腎組織標(biāo)本用4%中性甲醛固定液固定，經(jīng)梯度脫水后，石蠟包埋，制作4 μm厚石蠟切片，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法（SP）法檢測，常規(guī)石蠟切片脫蠟，微波修復(fù)，切片置于3%H2O2溶液中，PBS沖洗，滴加A液（10%正常山羊血清封閉液），室溫孵育30 min，滴加一抗（ITGA3稀釋比例 1∶100；ITGB1 稀釋比例 1∶200；WT1 稀釋比例1∶200），4℃孵育過夜，沖洗后滴加二抗（B液）37℃孵育30 min，PBS沖洗，滴加C液37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染3 min，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。使用BX63+DP72正置研究級顯微鏡閱片觀察并拍片。

1.6.5 腎小球內(nèi)足細(xì)胞密度的檢測 采用WT1-C末端抗體標(biāo)記足細(xì)胞核，IHC檢測WT1的表達(dá)，計(jì)數(shù)足細(xì)胞數(shù)量。BX63顯微成像系統(tǒng)放大400倍采集圖像，應(yīng)用Cell Sens Dimension軟件采用逐點(diǎn)描繪區(qū)域法測量腎小球面積，計(jì)數(shù)腎小球內(nèi)褐色細(xì)胞核數(shù)量即足細(xì)胞個數(shù)。以足細(xì)胞個數(shù)/腎小球面積，來表示足細(xì)胞密度。

1.6.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，若方差齊，采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；若方差不齊，采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況 C組大鼠毛色光澤，反應(yīng)靈活，活動自然，飲食飲水量及尿量均正常；M組大鼠毛色晦暗，精神萎靡，體重逐漸下降，并出現(xiàn)明顯多飲、多食、多尿的癥狀，造模后第7周，M組死亡1只，第15周末血糖不達(dá)標(biāo)，剔除1只，第16周死亡1只；Z組大鼠于第10周、第14周各死亡1只，第13周血糖不達(dá)標(biāo)，剔除1只；I組于第6、12、17周各死亡1只。

2.2 各組大鼠FBG、Scr、BUN、24 h UTP的比較 與C組比較，造模各組大鼠FBG明顯升高（P＜0.05）；與M組比較，I組及Z組FBG差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與C組比較，M組大鼠Scr、BUN均明顯升高，與M組比較，各干預(yù)組Scr差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），Z 組 BUN 顯著低于 M 組（P＜0.05），I組BUN與M組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與I組比較，Z組BUN明顯降低（P＜0.05）；與C組比較，M組大鼠 24UTP明顯升高（P＞0.05），與 M 組比較，Z組及 I組 24UTP 均明顯下降（P＜0.05），與 I組比較，Z組24UTP明顯下降（P＜0.05）。見表2。

表 2 各組大鼠 FBG、Scr、BUN、24 h UTP 的比較（±s）Tab.2 Comparison of FBG，Scr，BUN，and 24 h UTP in each group of rats（±s）

表 2 各組大鼠 FBG、Scr、BUN、24 h UTP 的比較（±s）Tab.2 Comparison of FBG，Scr，BUN，and 24 h UTP in each group of rats（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與厄貝沙坦組比較，△P＜0.05。

24 h尿蛋白定量（mg/24 h）正常組 4.33±0.51 24.08±4.31 6.89±0.76 6.79±1.38模型組 28.42±3.82* 40.99±9.52*17.76±1.54* 53.04±5.94*厄貝沙坦組 28.78±4.31* 31.73±5.91 16.12±3.02 24.05±2.28#中藥組 29.08±4.18* 32.43±7.87 12.91±3.84#△ 20.65±4.39#△組別 空腹血糖（mmol/L）血肌酐（μmol/L）尿素氮（mmol/L）

2.3 各組大鼠腎組織病理觀察比較 C組大鼠腎組織可見腎小球、腎小管未見明顯異常；M組大鼠腎組織腎小球肥大，基底膜輕度增厚，系膜細(xì)胞和基質(zhì)增多，腎小囊腔變窄；與M組比較，Z、I組病理改變有一定程度減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織光鏡（上圖HE染色、下圖PAS染色）觀察（×400倍）Fig.1 Kidney tissue observed by light microscopy（HE，PAS staining）of rats in each group（×400）

2.4 各組大鼠腎組織中ITGA 3、ITGB1、WT1 mRNA及蛋白表達(dá)的比較 與C組比較，M組ITGA3，ITGB1，WT1 mRNA的表達(dá)均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；與 M 組比較，I、Z 組 ITGA3，ITGB1，WT1 mRNA 的表達(dá)增加（P＜0.05）；與 I組比較，Z 組 ITGB1 mRNA 表達(dá)增加（P＜0.05），ITGA3、WT1 mRNA 無明顯差異（P＞0.05）。見表 3。

表3 各組大鼠腎組織ITGA3、ITGB1、WT1 mRNA的比較（±s）Tab.3 Comparison of ITGA3，ITGB1，and WT1 mRNA in each group of rats（±s）

表3 各組大鼠腎組織ITGA3、ITGB1、WT1 mRNA的比較（±s）Tab.3 Comparison of ITGA3，ITGB1，and WT1 mRNA in each group of rats（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與厄貝沙坦組比較，△P＜0.05。

組別 ITGA3 ITGB1 WT1正常組 1.00±0.14 1.00±0.12 1.00±0.08模型組 0.49±0.10* 0.56±0.07* 0.51±0.07*厄貝沙坦組 0.85±0.18# 0.73±0.10# 0.72±0.11#中藥組 0.95±0.15# 0.88±0.16#△ 0.78±0.08#

ITGA3，ITGB1主要分布于腎小球基底膜和系膜基質(zhì)，少量分布于足細(xì)胞胞質(zhì)中，兩者在C組大鼠腎小球高表達(dá)；與C組相比，ITGA3、ITGB1在M組大鼠腎小球表達(dá)減少；與M組比較，I、Z組兩者表達(dá)增多；WT1是足細(xì)胞的特異性蛋白，表達(dá)在腎小球中且位于足細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)；與C組相比，M組WT1表達(dá)減少；與M組比較，I、Z組WT1表達(dá)增多。見圖2。

圖2 各組大鼠腎組織ITGA3、ITGB1、WT1蛋白的表達(dá)（×400）Fig.2 Expression of ITGA3，ITGB1，and WT1 protein in kidney tissues of rats in each group（×400）

2.5 各組大鼠腎小球內(nèi)足細(xì)胞密度的比較 與C組比較，M組大鼠足細(xì)胞密度顯著減少（P＜0.05）；與M組比較，I、Z組大鼠足細(xì)胞密度明顯增加（P＜0.05）；與I組比較，Z組密度明顯增加（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠腎小球內(nèi)足細(xì)胞密度的比較Fig.3 Comparison of podocyte density in the glomeruli of rats in each group

3 討論

DN是一種慢性漸進(jìn)性疾病，其臨床表現(xiàn)及病理特征隨著病程的延長而逐漸加重，蛋白尿的發(fā)生是DN最明顯的臨床特征，表現(xiàn)為早期微量蛋白尿到臨床期出現(xiàn)大量蛋白尿。腎小球?yàn)V過屏障可有效阻止白蛋白等大分子量物質(zhì)進(jìn)入尿液，其結(jié)構(gòu)和功能的改變是蛋白尿產(chǎn)生重要的病理基礎(chǔ)。足細(xì)胞作為濾過屏障重要的組成部分，覆蓋于GBM的表面，它是腎小球中唯一一種高度終末分化細(xì)胞，不能進(jìn)行正常的細(xì)胞分裂，其一但脫落將不可再生。足細(xì)胞損傷的表現(xiàn)一方面為足細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)異常；另一方面是形態(tài)變化主要包括足細(xì)胞肥大、細(xì)胞足突融合、足細(xì)胞數(shù)量或密度減少、足細(xì)胞凋亡、足細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化等[13-14]。有針對DM患者的1項(xiàng)研究，結(jié)果顯示足細(xì)胞的脫落與DN蛋白尿及腎功能的損害有關(guān)[15]。通過腎活檢分析發(fā)現(xiàn)2型DM患者足細(xì)胞數(shù)明顯低于正常人，且足細(xì)胞密度越小，尿白蛋白的排泄率越大[16]。正常狀態(tài)下，足細(xì)胞通過整合素 α3β1、dystroglycans黏附于 GBM 表面保持其結(jié)構(gòu)和功能的完整性，而發(fā)揮濾過屏障的作用，一但足細(xì)胞損傷整合素α3β1表達(dá)降低，足細(xì)胞對GBM的黏附力降低，則會出現(xiàn)脫落。整合素是異質(zhì)二聚體的穿膜蛋白，由α和β亞基組成，本文主要研究了整合素 α3（ITGA3） 及整合素 β1（ITGB1）在腎臟的表達(dá)水平，兩者均是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附的受體。α3β1整合素是在體內(nèi)腎小球發(fā)育過程中唯一發(fā)揮重要作用的整合素，其由足細(xì)胞分泌并介導(dǎo)足細(xì)胞與GBM的黏附，足細(xì)胞主要通過ITGA3、ITGB1被覆于GBM的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白上，從而維持腎小球?yàn)V過功能的正常[17]。WT1表達(dá)于足細(xì)胞核，是成熟足細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白，其對維持成熟的足細(xì)胞表型可能是必要的[18]，在腎小球中，WT1只在足細(xì)胞核表達(dá)，因此WT1可作為計(jì)數(shù)足細(xì)胞的標(biāo)記物。

DN可累及約40%的DM患者，一旦出現(xiàn)持續(xù)蛋白尿，發(fā)生腎損傷，則病情常不可逆轉(zhuǎn)，直至發(fā)展為終末期腎病。DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其防治目前尚缺乏針對性較強(qiáng)的特效手段。《金匱要略》云：“病人如熱狀，煩滿，口干燥而渴，其脈反無熱，此為陰伏，是瘀血也，當(dāng)下之。”記載了瘀血致消渴的病理機(jī)制。DM病機(jī)在氣陰兩虛，氣虛無力助血運(yùn)行，血行艱澀致瘀；消渴日久不愈，陰津虛耗，津液虧虛，虛火內(nèi)生，內(nèi)熱煎灼陰血而至血瘀；或燥熱之邪煎熬津液，使津虧血稠、血行不暢而致瘀；或病久營衛(wèi)之氣運(yùn)行不暢，經(jīng)絡(luò)失疏而生瘀。因此，隨著DM病程遷延，導(dǎo)致腎絡(luò)瘀阻，引起腎小球毛細(xì)血管團(tuán)結(jié)構(gòu)及功能受損，導(dǎo)致蛋白尿的漏出，由此可見DN病機(jī)重在瘀血阻絡(luò)。據(jù)證立法，依法采方選取了化瘀通絡(luò)中藥進(jìn)行DN干預(yù)，其降低蛋白尿及腎臟保護(hù)作用也得到前期臨床及動物實(shí)驗(yàn)研究的證實(shí)[19-20]。通過多中心隨機(jī)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)化瘀通絡(luò)中藥可有效改善Ⅲ、Ⅳ期DN患者的臨床癥狀，降低尿蛋白，調(diào)節(jié)脂代謝，保護(hù)腎功能，提高患者生活質(zhì)量。通過對DN大鼠的實(shí)驗(yàn)室檢測發(fā)現(xiàn)化瘀通絡(luò)中藥能明顯改善DN大鼠腎臟病理損傷，減少蛋白尿排泄，并且能通過多種信號通路減輕腎臟損傷，改善腎功能。方藥選取丹參、川芎、地龍、水蛭、全蝎進(jìn)行配伍，意在祛逐腎絡(luò)瘀血、改善腎臟循環(huán)、延緩腎臟纖維化、減輕腎臟損傷。現(xiàn)代藥理研究及臨床實(shí)驗(yàn)證明丹參、川芎均具有擴(kuò)血管、改善DN血液高凝高黏狀態(tài)、降低血小板黏性、抑制血小板活化、改善腎臟微循環(huán)的作用[21]。地龍、水蛭、全蝎皆屬蟲類之品，性善走竄，驅(qū)逐腎絡(luò)癥瘕，具有擴(kuò)張毛細(xì)血管、改善血液動力學(xué)、抗血栓、減少腎臟Ⅳ型膠原表達(dá)，減輕腎小球硬化的作用[22-24]。因此本研究就化瘀通絡(luò)中藥能否通過干預(yù)α3β1整合素表達(dá)起到減少足細(xì)胞脫落的目的，從而對DN起到腎臟保護(hù)作用展開探討。

研究結(jié)果顯示，DN大鼠α3β1整合素表達(dá)明顯減少，足細(xì)胞密度減少，表明α3β1整合素介導(dǎo)了足細(xì)胞與GBM的黏附，其表達(dá)與足細(xì)胞密度呈正相關(guān)。通過化瘀通絡(luò)中藥的干預(yù)能一定程度上對α3β1整合素表達(dá)起到良性調(diào)節(jié)作用，上調(diào)其在腎組織的表達(dá)量，減少足細(xì)胞脫落個數(shù)，從而起到足細(xì)胞保護(hù)作用，能夠明顯減少DN大鼠蛋白尿排泄和腎臟病理損傷。由此筆者推測，化瘀通絡(luò)中藥也能通過改善足細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化來達(dá)到腎保護(hù)作用，該作用機(jī)制可能也是化瘀通絡(luò)中藥干預(yù)DN重要的作用靶點(diǎn)之一。