白藜蘆醇通過調控肝臟生物鐘改善CCl4誘導的小鼠肝纖維化*

闕任燁 ，戴彥成 ，李勇 ，周薏

（1.上海中醫藥大學附屬上海市中西醫結合醫院脾胃病科，上海 200082；2.上海中醫藥大學附屬市中醫醫院脾胃病科，上海 200071）

生物鐘是自然界普遍存在的一種生命現象，它是機體一種內源性的調控系統，幾乎存在于地球上所有生物中，是生物為適應環境周期性變化而長期演化出來的周期性變化的生理、生化和行為活動[1]。肝臟是人體重要的代謝器官，也是外周生物鐘系統的重要組成部分，目前有研究表明肝臟生物鐘紊亂可引起肝臟慢性炎癥甚至肝纖維化的發生[2]。白藜蘆醇是中藥虎杖的有效成分之一，其具有顯著保肝、抗肝纖維化作用，但其作用機制尚不完全明確。最新研究發現，白藜蘆醇具有一定的調節生物鐘基因表達的作用[3]，可能是一種生物節律調節藥物。本研究旨在研究生物鐘基因在肝纖維化時的表達變化及白藜蘆醇對生物鐘基因是否具有調節作用。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物 雄性C57BL/6成年小鼠30只，體質量（18～22）g，購自上海市實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（滬）2017-0005，飼養于上海市中醫醫院無特異病原體（SPF）級動物房，恒溫（25±2）℃、恒濕，人工光照12 h、黑暗12 h，自由進食飲水。本動物實驗規程遵循：“實驗動物關愛和使用指南。”

1.2 試劑四氯化碳（CCl4）生產批號：XW05623502，橄欖油購自國藥集團化學試劑有限公司；白藜蘆醇（純度>99%）購自中國食品藥品檢定所（生產批號：20181201）；蘇木素-伊紅染色液（P031IH）購于湖南艾佳生物科技股份有限公司，Masson染色液（G1340）、天狼星紅染色液（G1471）購于北京雷根生物技術有限公司；辣根酶標記山羊抗鼠、兔IgG購自Cell signaling technology公司，α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、I型膠原（COL-1）、Clock、芳香烴受體核轉運樣蛋白 1（Bmal1）、周期基因 1（Per1）、周期基因 2（Per2）、隱花色素 1（Cry1）、隱花色素 2（Cry2）、β-actin抗體購自Abcam公司，電化學發光（ECL）試劑盒購自美國Millipore公司，生產批號：1115702；PCR引物購自上海生工生物工程有限公司，Trizol Reagent購自美國Sigma公司，生產批號：BCBN5665V；PrimeScriptTMRT Reagent Kit購自日本Takara公司，生產批號：AK2301；SYBR?Green Realtime PCR Master Mix購自日本Takara公司，生產批號：AK5005。

1.3 藥物配制 依照CCl4與橄欖油1∶5配制成20%CCl4油劑。白藜蘆醇使用二甲基亞砜溶解配制成60 mg/mL原液，在藥物干預前使用生理鹽水來稀釋至相應濃度[4]。

1.4 儀器 快速研磨儀JXFSTPRP-48（上海凈信實業發展有限公司），RM2016切片機（德國萊卡公司），生物組織攤烤片機YT-6C（亞光醫用電子技術有限公司），防脫載玻片P031IH（湖南艾佳生物科技股份有限公司），鼓風干燥箱DHC-9070A（天津津立儀器設備科技發展有限公司），光學顯微鏡AE41（麥克奧迪實業集團有限公司），AU400型全自動生化分析儀（日本奧林巴斯公司），小型垂直電泳轉印系統（美國Bio-rad公司），ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統（美國Bio-rad公司），Neofuge 15R型臺式高速冷凍離心機（中國Heal force公司），S1000 PCR儀、CFX 96 Touch實時熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.5 實驗方法 取30只雄性C57BL/6小鼠，隨機分為正常組、模型組、白藜蘆醇組，每組10只。模型組及白藜蘆醇組按2.5 mL/kg腹腔注射體積分數為20%CCl4油劑溶液進行造模，每周2次，連續4周，對照組按同等劑量同等頻次給予腹腔注射橄欖油。白藜蘆醇以生理鹽水稀釋呈終濃度為30 mg/kg進行腹腔注射干預，每日1次，連續4周，對照組及模型組給予等量生理鹽水按同等頻次腹腔注射。所有小鼠在造模4周后處死，取血清、肝組織標本。血清標本用蛋白酶抑制劑處理，-20℃中保存備用；肝組織標本用含0.01%DEPC的生理鹽水清洗后保存于-80℃中，部分標本用中性福爾馬林固定12 h后經石蠟包埋，3～5 μm厚連續切片備檢。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 血清肝功能指標測定 使用全自動生化分析儀檢測各組小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）水平。

1.6.2 肝臟病理組織蘇木精-伊紅（HE）染色、馬松（Masson）染色天狼星紅（Sirius Red）染色觀察 取備檢石蠟切片，經脫蠟、水化、染色、分化、透明、封片、鏡檢，分別觀察各組切片肝臟病變嚴重程度，使用Ishak纖維化評分或ImagePro Plus軟件對染色纖維化區域進行半定量分析評價肝纖維化程度。

1.6.3 免疫組織化學檢測 石蠟切片經脫蠟、水化，抗原修復冷卻后，3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶的活性，血清封閉，孵育一抗、孵育二抗，DAB顯色，蘇木素復染、脫水、透明后封片、鏡檢，用ImagePro Plus軟件對肝組織陽性表達面積進行半定量分析[5]。

1.6.4 蛋白質印跡法（Western blot）法檢測 取各組小鼠部分肝組織，裂解后提取蛋白，使用BCA蛋白試劑盒檢測蛋白含量。以SDS-PAGE凝膠（5%濃縮膠，12%分離膠）進行電泳，分離蛋白，通過半干轉法轉移至PVDF膜，PVDF膜經5%的脫脂奶粉搖床上慢搖 2 h 封閉，分別與 Clock、Bmal1、Per1、Per2、Cry1、Cry2、β-actin抗體 4 ℃過夜，室溫孵育二抗2 h，ECL光化學顯色。最后應用Image J分析軟件對掃描條帶進行定量分析，計算各蛋白相對表達量。

1.6.5 實時聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測[5]取小鼠肝組織加入Trizol研磨離心取上清，提取總RNA，Nanodrop2000檢測RNA的純度和濃度，各組取2μg總RNA，按20 μL總反應體積，反轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板分別進行PCR擴增。Clock上游引物5'-GGCAAAATGTCATGAGCACTTA-3'，下游引物 5'-AGCCCTAACTTCTGCATAACTT-3'；Bmal1 上游引物5'-TGCCACCAATCCATACACAGAAGC-3'，下游引物5'-ATCTTCCCTCGGTCACATCCTACG-3'；Per1上游引物5'-CAGCTTTTTATTGAGTCTCGGG-3'，下游引物 5'-CAGTTGATCTGCTGGTAGGAG-3'；Per2上游引物5'-CTTATTCACTGCCCGTGTTTC-3'，下游引物5'-GGAAGGAATAACTGGGTAGCAT-3'；Cry1上游引物5'-GACGCAGCTATTAAGAAACTGG-3'，下游引物 5'-TTTGCTGATGAGAGTCTGGAAT-3'；Cry2上游引物5'-CTATGAGAGACCCCGAATGAAC-3'，下游引物 5'-CCGCTTCACCTTTTTATACAGG-3'；βactin上游引物5'-CTGTATGCCTCTGGTCGTAC-3'，下游引物5'-TGATGTCACGCACGATTTCC-3'。采用三步法進行PCR擴增，反應結束后，得到各樣本Ct值，然后利用2-△△Ct計算各組基因的相對表達量。

1.7 統計學方法 實驗結果采用SPSS 23.0軟件進行數據分析。計量資料符合正態分布且方差齊，采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠血清肝功能指標水平 與對照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST、LDH水平均顯著升高（均P＜0.05），而白藜蘆醇干預后可顯著降低肝纖維化小鼠血清ALT、AST、LDH水平，與模型組相比，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。

表1 各組小鼠血清肝功能指標比較（±s）Tab.1 Comparison of serum liver function indexes of mice in each group(±s)

表1 各組小鼠血清肝功能指標比較（±s）Tab.1 Comparison of serum liver function indexes of mice in each group(±s)

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數 ALT（U/L） AST（U/L） LDH（U/L）對照組 10 41.2± 5.3 28.6± 4.4 289.5± 55.7模型組 10 221.6±42.5* 181.4±34.1* 954.6±147.3*白藜蘆醇組 10 58.9±10.8# 43.7± 8.2# 343.3± 49.0#

2.2 各組小鼠肝組織病理切片及染色結果 HE染色顯示對照組肝細胞形態正常，匯管區無炎癥細胞浸潤，無脂肪浸潤，肝小葉結構完整；CCl4組可見匯管區大量炎性細胞浸潤、有脂肪空泡形成，纖維組織增生，肝小葉結構紊亂、有破壞，被沉積的膠原分割成大量假小葉。Res干預后纖維組織增生明顯減少，肝組織少量炎癥細胞，無明顯脂肪浸潤。見圖1A，表 2。

Masson染色顯示對照組肝組織結構清晰，肝細胞以肝小葉中央靜脈為中心向四周放射狀整齊排列，肝細胞無變性壞死，肝小葉結構清晰，肝小葉間未見明顯纖維組織增生。CCl4組可見匯管區、中央靜脈纖維組織增生明顯，沿匯管區及中央靜脈向外延伸，部分肝細胞脂肪樣變，小葉結構紊亂，纖維條索粗大明顯，互相連接，形成假小葉。Res干預后膠原纖維沉積明顯減輕，細胞脂肪浸潤不明顯。見圖1B，表 2。

Sirius Red染色顯示對照組肝細胞排列整齊，肝小葉清晰可見，未見明顯膠原纖維。CCl4組在中央靜脈壁和匯管區間有明顯的膠原纖維沉積，以匯管區、中央靜脈區為中心向肝實質衍生，沉積的膠原纖維沿增生的小膽管形成間隔，相互連接、包繞、分割，形成假小葉。Res干預后膠原沉積不明顯，僅匯管區血管壁有少量膠原纖維（見圖1C，表2）。

圖1 各組小鼠肝臟病理組織HE、Masson、Sirius Red染色表現（×100）Fig.1 HE，Masson and Sirius Red staining of liver pathological tissues of mice in each group(×100)

表2 各組小鼠病理組織肝纖維化評分及染色陽性面積比較（±s）Tab.2 Comparison of Ishak score and positive staining area of pathological tissue of mice in each group（±s）

表2 各組小鼠病理組織肝纖維化評分及染色陽性面積比較（±s）Tab.2 Comparison of Ishak score and positive staining area of pathological tissue of mice in each group（±s）

注：Ishak 評分.肝纖維化評分；Masson.馬松染色；Sirius Red.天狼性紅染色與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

S i r i u s R e d陰性面積（%）對照組 1 0 0.0±0.0 0.7±0.1 0.4±0.1模型組 1 0 1 2.1±2.4* 1 5.3±2.7* 1 3.9±2.1*白藜蘆醇組 1 0 5.4±0.8# 4.2±1.1# 3.3±0.6#組別 動物數 I s h a k評分（分）M a s s o n陽性面積（%）

2.3 免疫組織化學檢測 免疫組化結果顯示，模型組與對照組比較，肝組織α-SMA、COL-1陽性表達顯著升高 （P＜0.05），Res干預后肝組織 α-SMA、COL-1 陽性表達顯著減少（P＜0.05）。見圖 2，表 3。

表3 各組小鼠免疫組織化學陽性面積比較（±s）Tab.3 Comparison of immunohistochemical positive area of mice in each group(±s)%

表3 各組小鼠免疫組織化學陽性面積比較（±s）Tab.3 Comparison of immunohistochemical positive area of mice in each group(±s)%

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數 α-SMA COL-1對照組 10 2.3±0.4 6.5±1.1模型組 10 11.7±1.8* 35.8±6.6*白藜蘆醇組 10 3.1±0.7# 9.2±1.5#

圖2 各組小鼠肝臟免疫組織化學檢測α-SMA、COL-1表達（×400）Fig.2 Expression of α-SMA and COL-1 in the liver of mice in each group by immunohistochemistry(×400)

2.4 RT-PCR及Western blot檢測 CCl4誘導的肝纖維化小鼠肝組織 Clock、Bmal1、Per1、Per2、Cry1、Cry2 mRNA及蛋白表達較對照組顯著下降（P＜0.05），而 Res干預后可以顯著增加 Clock、Bmal1、Per1、Per2、Cry1、Cry2 mRNA 及蛋白表達（P＜0.05）。見表 4-7，圖 3。

圖3 各組小鼠生物鐘基因蛋白表達條帶Fig.3 Expression bands of circadian clock genes in mice in each group

表4 各組小鼠生物鐘基因Clock、Bmal1、Per1 mRNA表達比較（±s）Tab.4 Comparison of mRNA expressions of clock genes Clock，Bmal1 and Per1 in mice in each group(±s)

表4 各組小鼠生物鐘基因Clock、Bmal1、Per1 mRNA表達比較（±s）Tab.4 Comparison of mRNA expressions of clock genes Clock，Bmal1 and Per1 in mice in each group(±s)

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數 Clock Bmal1 Per1對照組 10 1.00±0.18 1.00±0.24 1.00±0.11模型組 10 0.32±0.07* 0.44±0.12* 0.37±0.06*白藜蘆醇組 10 1.22±0.14# 0.89±0.17# 1.08±0.22#

表5 各組小鼠生物鐘基因Per2、Cry1、Cry2 mRNA表達比較（±s）Tab.5 Comparison of mRNA expression of biological clock genes Per2，Cry1 and Cry2 in mice in each group(±s)

表5 各組小鼠生物鐘基因Per2、Cry1、Cry2 mRNA表達比較（±s）Tab.5 Comparison of mRNA expression of biological clock genes Per2，Cry1 and Cry2 in mice in each group(±s)

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數 Per2 Cry1 Cry2對照組 10 1.00±0.14 1.00±0.09 1.00±0.22模型組 10 0.18±0.03* 0.25±0.04* 0.61±0.08*白藜蘆醇組 10 0.96±0.10# 1.15±0.23# 0.83±0.13#

表6 各組小鼠生物鐘基因Clock、Bmal1、Per1蛋白表達比較（±s）Tab.6 Comparison of protein expressions of clock genes Clock，Bmal1 and Per1 in mice in each group(±s)

表6 各組小鼠生物鐘基因Clock、Bmal1、Per1蛋白表達比較（±s）Tab.6 Comparison of protein expressions of clock genes Clock，Bmal1 and Per1 in mice in each group(±s)

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數 Clock Bmal1 Per1對照組 10 1.00±0.13 1.00±0.16 1.00±0.07模型組 10 0.41±0.08* 0.35±0.08* 0.46±0.10*白藜蘆醇組 10 1.25±0.23# 0.94±0.14# 1.02±0.19#

表7 各組小鼠生物鐘基因Per2、Cry1、Cry2蛋白表達比較（±s）Tab.7 Comparison of protein expression of circadian clock genes Per2，Cry1 and Cry2 in mice in each group(±s)

表7 各組小鼠生物鐘基因Per2、Cry1、Cry2蛋白表達比較（±s）Tab.7 Comparison of protein expression of circadian clock genes Per2，Cry1 and Cry2 in mice in each group(±s)

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數 Per2 Cry1 Cry2對照組 10 1.00±0.21 1.00±0.15 1.00±0.19模型組 10 0.29±0.05* 0.39±0.07* 0.55±0.11*白藜蘆醇組 10 0.96±0.10# 0.84±0.17# 0.93±0.09#

3 討論

生物鐘是自然界普遍存在的一種生命現象，它是機體一種內源性的調控系統，幾乎存在于地球上的所有生物中，是生物為適應環境周期性變化而長期演化出來的周期性變化的生理、生化和行為活動[1]。研究發現人體主控鐘位于下丘腦視交叉上核（SCN）的區域[6]。在外周組織器官中，如肝、腎、胰腺、骨骼肌、心肌等，也都存在各自的外周生物鐘，它們通過生物鐘基因表達變化而控制周期性節律振蕩[7]。目前公認的生物鐘基因有：Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Rev-erbα 等，他們構成若干條轉錄-翻譯反饋回路發揮生理功能。主控與外周生物鐘協調控制內環境穩態、新陳代謝、免疫應答、神經反射、生長發育、衰老死亡等生命活動[8]。

目前研究發現，無論是主控生物鐘亦或是外周生物鐘任何一個環節的失調均可導致疾病的發生發展，例如流行病學研究顯示由于晝夜節律紊亂（主控鐘紊亂）的人群（如時差旅行、輪班工作等），其腫瘤、神經疾病、免疫疾病、內分泌疾病、消化疾病以及心血管疾病等的風險較正常增加[9]。近期發表 于 British Medical Journal，The Journal of the American Mdical assiciation等雜志[10-14]的文獻表明輪班工作會打亂晝夜節律，導致2型糖尿病、高血壓、冠心病等心血管事件的發生風險增高，更有甚者可能提高乳腺癌、結腸癌的發病率。而外周生物鐘紊亂亦會導致相應臟器發生疾病。如近期的一些研究發現通過特定的條件如基因干擾、基因敲除靶向器官生物鐘基因，可引起動物心、肺、腎、胰腺等臟器發生炎癥、損傷，隨著時間的延長，甚至會出現相應臟器的纖維化發生[15-17]。綜上所述，無論是主控鐘的紊亂，亦或是外周生物鐘紊亂都有可能導致某些疾病的發生，而主控鐘與外周生物鐘也可相互影響，共同調節機體的生理病理過程。

肝臟是人體重要的代謝器官，也是外周生物鐘系統的重要組成部分，與其他外周生物鐘一樣，肝臟生物鐘具有高度的自主性（autonomous）和自我穩定性（self-sustained），同時受到SCN中樞的整合與調控[18]。肝臟生物鐘是由輸入通路（input）、中央振蕩器（cen-traloscillator）和輸出通路（output）3 部分組成的。輸入通路將感受到的外界變化信息傳遞給中央振蕩器，在后者整合以后，經輸出通路輸送給肝臟，使之表現出晝夜節律性。其中，中央振蕩器的反饋調節環路是生物鐘基因晝夜節律性表達的主要調節途徑。在分子水平上，它由兩個調節環組成[19]，在第1個調節環（Core Loop）中，轉錄激活因子Bmal1和Clock在細胞質中形成異源二聚體入核，結合在靶基因Per和Cry的啟動子E-box序列上，啟動轉錄。Cry蛋白在胞漿中的積累一旦到達極限，就約束Per蛋白，彼此結合形成穩定的復合物，重新入核結合在Bmal1和Clock的二聚體上，抑制它們的轉錄活性，從而導致細胞中Per和Cry的蛋白合成減少，如此循環，形成生物鐘分子的振蕩表達。第2個調節環（Stablizing Loop）是有關于Bmal1的表達，Bmal1和Clock二聚體能夠與孤兒核激素受體（Rev-erbα）和視黃酸受體相關孤兒受體α（RORα）基因的啟動子E-box結合，Rev-erbα和RORα又能夠競爭性結合在Bmal1啟動子的RRE位點，其中RORα能激活Bmal1的表達，而Rev-erbα則抑制Bmal1的表達。

肝臟生物鐘的紊亂參與了肝炎、脂肪性肝病、肝纖維化、肝硬化以及肝癌等疾病的發生發展。有研究表明，Per1/2、Bmal1基因敲除小鼠所引起的肝臟生物鐘紊亂會出現糖脂代謝異常，肝功能損傷，隨之而來的是肝腫大、膽管增生、慢性肝臟炎癥、肝細胞死亡以及肝纖維化[2]，這一結果提示肝臟生物鐘紊亂可引起肝臟慢性炎癥甚至肝纖維化的發生。另外，有研究者發現在四氯化碳誘導的肝纖維化小鼠模型，及體外培養的肝星狀細胞活化模型中，生物鐘基因 Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2等基因表達中位值及振幅顯著降低[20-21]，這些研究結果提示外源性輸入刺激引起的慢性肝臟炎癥可引起肝臟生物鐘發生紊亂，進而促進疾病的進展。而通過外源性給予生物鐘調節藥物，如使用外源性褪黑素（褪黑素是鐘基因RORα的天然配體，可有效誘導RORα表達升高）干預CCl4構建的肝纖維化小鼠模型，可以干預肝臟生物鐘的基因表達，進而發揮抗纖維化的作用[20]；又如給予外源性Rev-erbα激活劑SR9009亦可通過維持肝臟生物鐘節律平衡改善或逆轉肝纖維化進程[22]。因此，綜合以上文獻結果可以看出肝纖維化進展中存在肝臟生物鐘基因表達的改變，肝臟生物節律發生變化又可進一步促進肝纖維化發生發展，而通過藥物調整生物鐘是一種潛在的治療肝纖維化的新策略。

中醫歷來強調人體生理病理活動和自然界的變化息息相關。中醫理論的“陰陽學說”中，陰陽消長節律從宏觀概括了人體生理節律性變化的規律。“子午流注學說”更是強調天人合一，認為人是自然的一部分，外界環境的變化會影響人內環境的變化，中醫的理念無不體現時間變化影響生物節律。中醫藥是中華文明的偉大寶庫，從豐富的中藥資源中篩選中藥中的有效成分，尋找能夠調控生物節律的藥物，是具有中醫特色的一個重要的研究領域。目前研究發現，一些中藥方劑如加味四逆散、烏龍丹、生慧湯等，中藥單藥如合歡花、刺五加、五味子、黑水纈草等，中藥提取物或單體如β-細辛醚、齊墩果酸、蛇床子素、海參皂苷、白藜蘆醇等均具有調節生物鐘環路中某些基因表達的作用，展現出中醫藥調控生物鐘紊亂的可能性及潛在價值[23]。

最新研究發現中藥虎杖的主要有效成分之一，白藜蘆醇具有調控生物節律的功能。例如白藜蘆醇可通過靶向調控生物鐘基因Bmal1、Cry1抑制丙烯酰胺誘導肝細胞線粒體功能障礙和炎癥反應[24]。另外又有研究發現白藜蘆醇可逆轉棕櫚酸酯對Bmal1-Clock相互作用和時鐘基因表達的抑制作用，糾正肝細胞中晝夜節律的振蕩，發揮保護肝細胞的作用[25]，提示白藜蘆醇可能是一種潛在的生物節律調節藥物。為此，本項目擬在CCl4誘導的肝纖維化小鼠模型中，觀察肝臟生物鐘基因表達變化，并使用白藜蘆醇進行干預，觀察白藜蘆醇的抗肝纖維化作用是否與調節肝臟生物鐘有關。結果表明，較之對照組，模型組小鼠肝功能指標如ALT、AST、LDH等均顯著升高；病理切片HE染色提示模型組匯管區纖維組織增生，肝小葉間膽管明顯增生，部分分割包繞肝小葉使其結構紊亂，Masson染色及天狼星紅染色提示模型組匯管區膠原沉積顯著增多，免疫組化顯示α-SMA、COL-1陽性面積顯著增多；RT-PCR及Western blot結果顯示肝臟生物鐘基因Clock、Bmal1、Per1、Per2、Cry1、Cry2 的 mRNA 及蛋白表達均顯著下降。白藜蘆醇干預后可顯著逆轉上述指標變化。這些結果提示白藜蘆醇的抗肝纖維化作用可能與調控肝臟生物鐘有關。

綜上所述，本文研究結果不僅對白藜蘆醇的保肝抗肝纖維化藥理機制及靶點提出全新的研究方向，更為白藜蘆醇的藥物臨床轉化及為其他生物鐘紊亂相關疾病的治療提出一種新的治療方案，也可為進一步發掘新的具有調節生物鐘紊亂的中藥新藥提供一定的研究思路及方法。另外，對中醫學“子午流注”學術思想的探討奠定了一定的實驗基礎，也符合當今“精準醫療”的趨勢。但下一步仍需研究生物鐘基因表達變化是如何引起或加重肝纖維化以及白藜蘆醇調控肝臟生物鐘的具體效應靶點。