超聲波-纖維素酶聯合輔助提取桑葉蛋白質工藝研究

傅海慶，張 瀅

（1.福建農林大學金山學院飲食文化傳承研究中心，福建 福州 350002；2.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002）

桑葉作為“藥食兩用”的桑樹（Morus alba L.）的葉片，因含有豐富的生物活性物質，如黃酮類、生物堿、多糖類、氨基酸和1-脫氧野尻霉素等[1-4]，在治療肺氣失和、清肝瀉火氣、解毒明雙目、降“三高”、抗癌等方面具有很好的功效[4-10]。除此之外，桑葉在蛋白質方面的含量也十分豐富，引起了眾多學者的關注。而植物葉蛋白質是世界上最大的可再生蛋白質資源之一，是植物組織內天然蛋白質的濃縮物，不含膽固醇，是潛在價值高的新型蛋白質資源[11-14]。植物葉蛋白質的提取不僅提高了作物的附加值，還可將農業副產物變廢為寶，最大程度地合理利用資源[15]。植物葉蛋白質營養價值高、來源廣，安全性和適用性高，是一類具有較高的營養價值和保健功能的蛋白質[15-16]。隨著植物葉蛋白質資源的研究開發，其提取物或加工產品將廣泛應用于食品、飼料、醫藥、農藥、化妝品等領域[12]，其最為重要的意義是能有效緩解糧食危機[11，16]。目前，國內外對于植物葉蛋白質的開發研究利用較多的主要是苜蓿葉、黑麥草、煙葉、葉類蔬菜、子粒莧葉、刺槐葉及牧草葉、水生植物等，對桑葉蛋白提取利用較少[17]。桑樹作為一種高蛋白植物[18]，不同桑樹品種其葉片蛋白質含量為13.4~32.8g/100g，平均蛋白質含量為21.5±0.4g/100g[19]；有些桑葉品種甚至比畜禽肉所含的蛋白質量還要高，而大多數植物葉片蛋白質含量只有10%左右[17]；桑葉蛋白中的氨基酸種類較豐富而齊全，必需氨基酸含量較高，特別是其中的降壓物質γ-氨基丁酸含量達到了226 mg/100 g干桑葉，且不含動物性膽固醇，是一種營養價值較高的優質植物蛋白，符合消費者對蛋白食品的要求[17，20-21]。目前，市面上與桑葉相關的產品主要有桑葉粉、桑葉茶、脫水桑葉菜、桑葉面條、桑葉豆腐、桑葉調味醬等一些初加工產品，而以蛋白質為主要成分的深加工產品應用較為少見[22-24]，這可能與桑葉蛋白質的提取工藝技術尚未滿足工業應用需要有關。桑葉蛋白質的主要提取方法有水浸出法[25]、酸堿沉淀法[17]、鹽析法[11，26]、超聲波輔助提取法[17，27-30]、微波輔助提取法[20]、纖維素酶輔助提取法[30-31]、乳酸發酵法[11，26，32]、反膠束法[26]、納米器件輔助法[33]等，其粗蛋白提取得率多為5.0%~10.5%。不同提取方法所依據的原理不同，故各種提取方法具有不同的提取率和優缺點[12]，但現有報道的提取率總體偏低。目前，我國桑葉的原料資源十分充足，不僅桑葉種植粗放、生產成本低廉，而且產量極高[34]，如能提高桑葉蛋白質的提取率，開發成天然保健產品或作為其他食品的原輔料成分，則其應用潛力巨大。綜合應用多種提取原理，在超聲波輔助提取的基礎上，結合纖維素酶法進行提取，以探索桑葉蛋白質的提取方法，形成更好的提取工藝技術，為后續的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

桑葉粉（經超微粉碎工藝而得，含蛋白質20.6%），安徽奧祥堂健康產業有限公司提供；纖維素酶（10 000 U/g），南寧龐博生物工程有限公司提供；氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸等，均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BSA224S型電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司產品；JY92-IIN型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司產品；TGL-16M型臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司產品；KQ-300DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產品；PB-10型pH測定儀，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司產品；XMTE-205型數顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司產品；DHG-9030型電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 超聲波輔助提取桑葉蛋白質的工藝流程

主要工藝流程：桑葉粉→添加NaCl溶液→超聲波處理→水浴浸提→離心得上清液→調節pH值使蛋白質沉淀→離心得沉淀物→干燥→粗蛋白樣品。

在前人研究結果的基礎上，擬定主要操作要點為：稱取5 g的桑葉粉，按料液比1∶20（g∶mL）加入質量分數為0.5%的NaCl溶液，經功率為100 W的超聲處理20 min后，于50℃水浴浸提40 min，以轉速4 000 r/min離心15 min得上清液，調節上清液pH值3.0以沉淀蛋白質，以轉速4 000 r/min離心15 min得到沉淀物，于60℃下熱風干燥沉淀物至恒質量即可得到桑葉粗蛋白[17，27-30]。在研究上述不同工藝因素對蛋白質提取率的影響時，只改變該因素的水平，其他因素水平基本保持不變。

1.3.2 超聲波輔助提取桑葉蛋白質單因素試驗

分別從超聲功率、超聲處理時間、浸提溫度、浸提時間、鹽質量分數、料液比、沉淀時的pH值等方面進行研究，以超聲波輔助法提取桑葉蛋白質的提取率為指標，研究不同因素水平對蛋白質提取率的影響，每個因素水平至少進行3次平行試驗，取其平均值進行分析。

（1）超聲功率對提取桑葉蛋白質提取率的影響。在提取桑葉葉蛋白的工藝流程中，分別設置超聲功率為0，100，200，300，400，500 W，其他工藝參數基本不變（其中料液比為1∶25），研究超聲功率對提取桑葉蛋白質提取率的影響。

（2）超聲時間對提取桑葉蛋白質提取率的影響。在提取桑葉葉蛋白的工藝流程中，分別設置超聲處理時間為0，10，20，30，40 min，其他工藝參數基本不變（其中料液比為1∶25，超聲功率為400 W），研究超聲處理時間對提取桑葉蛋白質提取率的影響。

（3）NaCl質量分數對提取桑葉蛋白質提取率的影響。在提取桑葉蛋白質的工藝流程中，分別設置NaCl溶液的質量分數為0，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%作為浸出溶劑，其他工藝參數基本不變（其中水浴浸提時間為50 min），研究NaCl質量分數對提取桑葉蛋白質提取率的影響。

（4）料液比對提取桑葉蛋白質提取率的影響。在提取桑葉蛋白質的工藝流程中，分別設置料液比為1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35進行提取，其他工藝參數基本不變（其中水浴浸提時間為30 min），研究料液比對提取桑葉蛋白質得率的影響。

（5）水浴浸提溫度對提取桑葉蛋白質提取率的影響。在提取桑葉蛋白質的工藝流程中，分別設置水浴浸提溫度為30，40，50，60，70℃進行試驗，其他工藝參數基本不變（其中水浴浸提時間為60 min），研究水浴浸提溫度對提取桑葉蛋白質提取率的影響。

（6）水浴浸提時間對提取桑葉蛋白質提取率的影響。在提取桑葉蛋白質的工藝流程中，分別設置水浴浸提時間為10，20，30，40，50，60 min，其他工藝參數基本不變，研究水浴浸提時間對提取桑葉蛋白質提取率的影響。

（7）酸沉淀pH值對提取桑葉蛋白質提取率的影響。在提取桑葉蛋白質的工藝流程中，分別設置酸沉淀pH值為1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0進行試驗，其他工藝參數基本不變（其中水浴浸提時間為60 min），研究酸沉淀pH值對提取桑葉蛋白質提取率的影響。

1.3.3 超聲波輔助提取桑葉蛋白質正交試驗

根據單因素試驗結果，篩選出對提取提取率影響較大、最佳水平不確切的水浴浸提溫度、超聲功率、NaCl質量分數、料液比等4個重要因素作為變量，進行正交設計L9（34），進一步優化主要因素水平對桑葉蛋白質提取提取率的影響。

超聲波輔助提取桑葉蛋白質的正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 超聲波輔助提取桑葉蛋白質的正交試驗因素與水平設計

1.3.4 超聲波-纖維素酶聯合輔助提取桑葉蛋白質的工藝流程

桑葉粉→添加NaCl溶液→超聲處理→水浴浸提→離心得上清液→調節沉淀物的pH值→添加纖維素酶分解→離心得上清液→合并2次上清液→調節pH值使蛋白質沉淀→離心得沉淀物→干燥→粗蛋白樣品。

在前述及前人的研究基礎上，擬定主要操作要點為：稱取5 g的桑葉粉，按料液比1∶28（g∶mL）加入質量分數為0.9%的NaCl溶液，經功率為150 W的超聲處理30 min后，于50℃水浴中浸提50 min，以轉速4 000 r/min離心15 min得上清液；調節沉淀物的pH值到5.0，按4%添加纖維素酶，于50℃下酶解40 min，以轉速4 000 r/min離心15 min得上清液；合并2次所得上清液，調節上清液pH值到3.0以沉淀蛋白質，以轉速4 000 r/min離心15 min得到沉淀物，于60℃下熱風干燥沉淀物至恒質量即可得到桑葉粗蛋白[31，35]。在研究上述不同工藝因素對蛋白質提取率的影響時，只改變該因素的水平，其他因素水平基本保持不變。

1.3.5 超聲波-纖維素酶聯合輔助提取桑葉蛋白質的單因素試驗

根據纖維素酶的產品使用說明、酶解特性及其前人的研究基礎，只選擇纖維素酶添加量和纖維素酶酶解時間2個方面作為重要單因素進行研究，各因素水平至少進行3次平行試驗，取其平均值進行分析。

（1）酶添加量對提取桑葉蛋白質提取率的影響。在上述提取桑葉蛋白質的工藝流程中，分別設置纖維素酶的添加量為0，1%，2%，3%，4%，5%進行研究，其他因素水平基本保持不變，以研究酶添加量對提取桑葉蛋白質提取率的影響。

（2）酶分解時間對提取桑葉蛋白質提取率的影響。在上述提取桑葉蛋白質的工藝流程中，分別設置酶解時間為30，40，50，60，70，80 min進行研究，其他因素水平基本保持不變，以研究酶解時間對提取桑葉蛋白質提取率的影響。

1.3.6 超聲波-纖維素酶聯合輔助提取桑葉蛋白質的正交試驗

結合上述單因素試驗結果設計兩因素三水平的正交試驗L9（32），以進一步優化各因素水平。

超聲波-纖維素酶聯合輔助提取桑葉蛋白質的正交試驗因素與水平設計見表2。

表2 超聲波-纖維素酶聯合輔助提取桑葉葉蛋白的正交試驗因素與水平設計

1.3.7 桑葉蛋白質提取率的計算

式中：m1——所用桑葉粉質量，g；

m2——桑葉粗蛋白質質量，g。

1.3.8 數據處理方法

數據的分析及圖表的繪制使用Microsoft Excel 2016、SPSS 17.0等軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 超聲波輔助法單因素試驗結果

2.1.1 不同超聲功率處理對桑葉蛋白質提取率的影響

不同超聲功率對桑葉蛋白質提取率的影響見圖1。

超聲波輔助處理可以粉碎桑葉細胞的細胞壁，有效增加桑葉蛋白質的溶出。但使用不同的超聲功率處理，其效果不同。從圖1可以看出，隨著超聲波功率的增加，桑葉蛋白質提取率總體顯著增加（p＜0.05）；但是當超聲功率超過200 W時，曲線的上升趨于平緩；超聲功率為200~500 W時，得率差異不顯著，這可能是超聲波的空化作用達到一定功率時就足以破壞桑葉的細胞結構，讓蛋白質溶出了，結合考慮節能，故選擇以200 W進行進一步研究。

圖1 不同超聲功率對桑葉蛋白質提取率的影響

2.1.2 不同超聲處理時間對桑葉蛋白質提取率的影響

不同超聲時間對桑葉蛋白質提取率的影響見圖2。

圖2 不同超聲時間對桑葉蛋白質提取率的影響

除了超聲功率之外，超聲處理時間也影響了提取桑葉蛋白質的產量。從圖2可以看出，在超聲功率相同的情況下，桑葉蛋白質的得率隨著超聲處理時間的延長而顯著增加（p＜0.05），使用超聲處理的前30 min曲線的斜率較大，其后趨于平緩，其中20~40 min的提取率差異不顯著，結合大多數同行研究結果考慮，以選擇30 min作為處理時間為宜。

2.1.3 不同NaCl質量分數對提取桑葉蛋白質提取率的影響

不同NaCl質量分數對桑葉蛋白質提取率的影響見圖3。

圖3 不同NaCl質量分數對桑葉蛋白質提取率的影響

蛋白質在一定質量分數范圍的鹽溶液中會呈現“鹽溶”現象，這種現象增加了蛋白質的溶解性[36]。氯化鈉溶液中的氯離子與帶正電荷的蛋白質基團結合，增加了蛋白質分子之間的靜電排斥力，從而提高了蛋白質的溶解性[32]。以不同的NaCl質量分數進行提取試驗。

從圖3可以看出，隨著NaCl質量分數的增加，提取得率顯著增加（p＜0.05），并在質量分數為0.8%時達到最大值。這與幾位學者的研究結果有較大出入，多數選擇0.3%~0.4% NaCl溶液進行提取[17，27-28]，其中原因是否與NaCl質量分數的提高還會導致核酸提取量的增加有關而選擇低質量分數有待進一步研究[28]。將0.8%的NaCl質量分數作為進一步優化研究的因素和水平。

2.1.4 不同料液比對桑葉蛋白質提取率的影響

不同料液比對桑葉蛋白質提取率的影響見圖4。

圖4 不同料液比對桑葉蛋白質提取率的影響

綜合前人研究結果，選擇料液比為1∶15~1∶35時進行提取研究。經方差分析，總體提取率具有顯著性差異（p＜0.05），以料液比1∶20，1∶25為相對的高點，結合大多數同行研究結果考慮，選擇料液比1∶25作為進一步研究的水平。

2.1.5 不同浸提溫度對桑葉蛋白質提取率的影響

不同浸提溫度對桑葉蛋白質提取率的影響見圖5。

圖5 不同浸提溫度對桑葉蛋白質提取率的影響

試驗了不同水浴浸提溫度對桑葉蛋白質提取率的影響。隨著浸提溫度的升高，桑葉蛋白質的得率也顯著升高（p＜0.05），當浸提溫度為50℃時，桑葉蛋白質提取率最高；浸提溫度進一步升高，桑葉蛋白質提取率沒有顯著差異，甚至有些下降趨勢，這可能是蛋白質在高溫下會發生變性溶解等不良變化所致[32]。故選擇50℃作為浸提溫度為宜。但有學者認為在30，40℃時的提取率更高[17，30]；這有待進一步優化研究。

2.1.6 不同浸提時間對桑葉蛋白質提取率的影響

不同浸提時間對桑葉蛋白質提取率的影響見圖6。

圖6 不同浸提時間對桑葉蛋白質提取率的影響

試驗了不同浸提時間對桑葉蛋白質提取率的影響。桑葉蛋白質提取率隨著浸出時間的延長而呈顯著增加趨勢（p＜0.05），但超過50 min后提取率顯著下降，這可能是由于加熱時間過長而發生桑葉蛋白質的凝集現象，提取時與殘渣一起分離造成損失所致。該浸提時間比不少學者研究的要節約不少時間，甚至可節約30 min，故以浸提時間50 min為宜。

2.1.7 不同酸沉淀pH值對提取桑葉蛋白質提取率的影響

不同酸沉淀pH值對提取桑葉蛋白質提取率的影響見圖7。

圖7 不同酸沉淀pH值對提取桑葉蛋白質提取率的影響

不同蛋白質有不同的等電點，需要調節不同的pH值得以沉淀。從圖7可以看出，桑葉蛋白質的沉淀在pH值為2.0~4.0時，能有較高的提取率；經方差分析，總體提取率具有顯著性差異（p＜0.05），而以pH值為2.0時最高，這與部分學者的研究結果一致[17，29]，故以pH值2.0為最適沉淀桑葉蛋白質的酸度。

2.2 超聲波輔助法正交試驗結果

在分析上述單因素試驗結果基礎上，優先篩選出NaCl質量分數、料液比、超聲功率、水浴浸提溫度等4個重要因素或與同行結果出入較大的因素作進一步的正交試驗L9（34），以獲得更優的參數。

超聲波輔助法正交試驗結果見表3。

表3 超聲波輔助法正交試驗結果

從極差法分析來看，各因素影響的大小為A＞C＞B＞D，即NaCl質量分數對桑葉蛋白質的提取率影響最大，其后依次是浸提溫度、料液比和超聲波功率；最佳因素水平應為A3B3C2D1，即以0.9%的NaCl質量分數作為浸提溶劑、料液比1∶28，超聲功率150 W，浸提溫度50℃為最佳參數水平，此時桑葉蛋白質提取率為9.43%。

2.3 超聲波-纖維素酶聯合輔助法單因素試驗結果

2.3.1 纖維素酶添加量對桑葉蛋白質提取率的影響

纖維素酶添加量對桑葉蛋白質提取率的影響見圖8。

圖8 纖維素酶添加量對桑葉蛋白質提取率的影響

纖維素酶能分解植物細胞壁的纖維素而破壞植物細胞壁，可增加植物蛋白質的溶出。試驗了纖維素酶添加量對桑葉蛋白質提取率的影響。從圖8可以看出，隨著酶添加量的增加，桑葉蛋白質的產量逐漸上升，總體提取率具有顯著性差異（p＜0.05）；當酶添加量超過4%時，曲線的上升趨于平緩，從降低成本考慮，以4%的酶添加量為宜。

2.3.2 纖維素酶酶解時間對桑葉蛋白質提取率的影響

酶解時間對桑葉蛋白質提取率的影響見圖9。

圖9 酶解時間對桑葉蛋白質提取率的影響

試驗了纖維素酶酶解時間對桑葉蛋白質提取率的影響。桑葉蛋白質提取率隨著酶解時間的增加，呈先上升后下降的曲線，這可能是由于酶解時間太長、超過50 min時，桑葉蛋白質會發生凝集，在過濾時與殘渣一起被丟棄而造成損失；總體提取得率具有顯著性差異（p＜0.05）。因此，選擇50 min的酶解時間是較合適的。

2.4 超聲波-纖維素酶聯合輔助法的正交試驗結果

根據上述單因素試驗結果進行了正交試驗優化。從極差法分析可知，兩因素影響的大小是E＞F，即纖維素酶添加量對桑葉蛋白質的提取率影響更大；當酶添加量為4.5%時，桑葉蛋白質提取率最高，可得最佳因素水平是E3F3，即纖維素酶添加量為4.5%，酶解時間為55 min時最佳，其蛋白質提取率可達16.06%，比前述只用超聲波輔助提取法的得率（9.43%）提高了70.31%。

超聲波-纖維素酶聯合輔助法正交試驗結果見表4。

表4 超聲波-纖維素酶聯合輔助法正交試驗結果

3 結論

以桑葉粉為原料，分別研究了超聲波輔助提取法和超聲波-纖維素酶聯合輔助提取法提取桑葉蛋白質的工藝，獲得最佳的提取工藝為：稱取5 g的桑葉粉，按料液比1∶28加入質量質量分數為0.9%的NaCl溶液，經功率為150 W的超聲波處理30 min后，于50℃水浴浸提50 min，以轉速4 000 r/min離心得上清液；調節沉淀物的pH值到5.0，按4.5%添加纖維素酶，在50℃下酶解55 min，以轉速4 000 r/min離心得上清液；合并2次所得上清液，調節上清液pH值到2.0以沉淀蛋白質，以轉速4 000 r/min離心得到沉淀物，干燥沉淀物后即可得到桑葉粗蛋白。按此工藝進行桑葉蛋白質的提取，其提取率可達16.06%。

對比同行報道，王桃云等人[25]采用水浸出法，在室溫下，以水為浸提劑，打漿時間3 min，浸提時間4 min，料液比1∶5（g∶mL），浸提劑pH值8.0，絮凝溫度75℃，調節提取液pH值為5.0，8.0，13.0得到沉淀物，在60℃干燥后即得桑葉蛋白質，其提取率為5.17%；喬璐采用0.4%的NaCl水溶液為提取溶劑，料液比為1∶30（g∶mL），400 W超聲處理20 min，在40℃下浸提80 min，于pH值2~3酸沉絮凝，沉淀干燥即得桑葉蛋白，其蛋白質提取率為10.23%[17]；劉苗苗等人[27]研究了在質量分數為0.3%的NaCl，料液比為1∶35（g∶mL），超聲功率為100 W，超聲時間為25 min，浸提時間為55 min時的桑葉蛋白質提取率為6.01%；王芳等人[28]以0.4%的NaCl溶液為提取溶劑，料液比為1∶30，超聲波400 W處理20 min，40℃水浴浸提60 min，其桑葉蛋白質得率為9.93%；殷培峰等人[29]采用料液比1∶20，超聲波400 W處理20 min，50℃水浴提取70 min，pH值2沉淀，以轉速4 000 r/min離心15 min，其桑葉蛋白質提取率為9.52%；朱天明[30]采用經過超微粉碎的桑葉粉為原料（100目），pH值為8.0的磷酸緩沖液為浸提劑，以超聲溫度30℃，超聲功率100 W，料液比為1∶40條件下提取60 min，離心分離得上清液，調節上清液的pH值為4.5，沉淀100 min，離心分離得到沉淀，冷凍干燥沉淀得到桑葉葉蛋白粗提取物，其蛋白質得率為5.7%；朱天明等人[31]還研究了以桑葉粉（未超微粉碎）為原料，pH值為5.0的緩沖液為浸提劑，在最適溫度50℃，料液比1∶38，加纖維素酶（10 000 U/g）量為4%條件下酶解2 h，然后將酶解液調pH值為8，放置60 min過濾，濾液調節pH值為4.5，沉淀100 min后離心得到沉淀，冷凍干燥沉淀得到桑葉葉蛋白粗提取物，其蛋白質提取率為6.5%。而試驗采用超聲波-纖維素酶聯合輔助的浸提方法，其桑葉蛋白質提取率比單獨一種輔助方法或其他方法的要高得多，至少高出56.99%，大大提高了提取得率。這可為同行及本工藝的進一步產業化研究提供參考。