花生芽白藜蘆醇大孔樹脂純化工藝及抑菌功效

王 娜，寧燦燦，趙 崢，李軍偉，王 凡，任紅濤，詹 軻，余秋穎,4

花生芽白藜蘆醇大孔樹脂純化工藝及抑菌功效

王 娜1,2,3,4，寧燦燦1,3，趙 崢1,3，李軍偉1,3，王 凡1,3，任紅濤1,3，詹 軻1,3，余秋穎1,3,4※

（1. 河南農業大學食品科學技術學院，鄭州 450002；2. 河南農業大學動物醫學院，鄭州 450002；3. 鄭州市營養與健康食品重點實驗室，鄭州 450002；4. 河南農業大學動物免疫學國際聯合研究中心，鄭州 450002）

為分離純化花生芽中具有潛在抑菌活性的白藜蘆醇化合物及研究其抑菌功效，提高花生的綜合利用價值。該研究通過靜態吸附-解吸試驗，從16種不同型號大孔樹脂中確定白藜蘆醇較佳純化樹脂，并對其動態吸附-解吸條件優化，采用倍比稀釋法、抑菌生長曲線及細胞膜通透性變化評價純化物對鼠傷寒沙門氏菌的抑制作用。結果表明：LSA-40大孔樹脂為花生芽白藜蘆醇較佳純化樹脂，其吸附條件為：上樣濃度120.00g/mL，速率1.00 mL/min，pH值4.2，上樣量8.00 mL/g；解吸條件為：80%乙醇溶液，pH值6.6，流速1.00 mL/min，白藜蘆醇純度可達84.0%；利用紫外光譜、傅里葉紅外光譜、超高效液相色譜串聯質譜對純化后樣品進行鑒定分析，發現純化物中主要成分為白藜蘆醇及其衍生物；純化物對鼠傷寒沙門氏菌抑制作用結果表明其最小抑菌濃度為250g/mL，在此濃度下可顯著增加細胞膜通透性（<0.01），破壞細胞壁完整性，造成胞內蛋白質嚴重泄露，最終導致鼠傷寒沙門氏菌死亡。該研究可為花生資源綜合深度利用及天然抑菌劑的開發提供一定理論參考。

吸附；抑菌；花生芽；白藜蘆醇；LSA-40大孔樹脂；質譜鑒定

0 引 言

花生芽是花生萌發后產生的一種食療兼備的食品，也叫長壽芽，其具有生產工藝簡便、口感獨特及營養豐富等特點，因此深受大眾青睞[1]。經研究發現，花生在發芽過程中蛋白質降解為肽和氨基酸，其生物利用率顯著增加，脂肪含量迅速降低，維生素、鉀、鎂等礦物質含量全面提高，營養因子得到改善，特別是具有重要生物活性功能的多酚類物質白藜蘆醇含量會大幅提升[2]。白藜蘆醇化學名為3,4',5-芪三酚，是一種“植物抗毒素”，近年來，國內外很多學者對白藜蘆醇的生物學功能進行了研究，結果表明其具有抗炎、抗過敏、抗氧化、調節糖脂代謝、抑制脂肪沉積、預防心血管疾病以及延緩衰老等多種作用[3-8]。

據不完全統計，全世界每年約有9 380萬人感染沙門氏菌，其中15.5萬人死亡，在中國，70%～80%的食源性細菌暴發都是由沙門氏菌引起的[9]。引起感染癥的沙門氏菌血清型主要有鼠傷寒沙門氏菌（，.）、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌等10多個血清型，其中鼠傷寒是最常見的血清型之一[10-11]。白藜蘆醇作為一種幾乎無毒副作用且具有廣泛來源的天然植物活性物質，具有許多抑菌類藥物不具備的優點。近年來，國內外已有大量研究發現白藜蘆醇具有廣譜抑菌活性，如Marino等[12]通過試驗發現白藜蘆醇對金黃色葡萄球菌感染引發的角膜炎具有抑制作用；李峰等[13]研究表明白藜蘆醇對核桃細菌性黑斑病菌具有一定的抑制作用；Duan等[14]研究發現白藜蘆醇通過下調sae RS減少金黃色葡萄球菌-溶血素的產生，從而達到一定的抑制作用。目前人們關于花生芽白藜蘆醇對鼠傷寒沙門氏菌的研究報道較少。因此本試驗通過花生芽白藜蘆醇純化工藝研究，并在對純化物進行傅里葉紅外（Fourier-Transform Infrared，FTIR）、超高效液相色譜串聯質譜（Ultra-Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，UPLC-QTOF- MS/MS）鑒定分析的基礎上，通過觀察分析白藜蘆醇作用于鼠傷寒沙門氏菌標準株后，其對菌株的抑制作用，以期為白藜蘆醇在養殖業、食品行業和醫藥行業中[15]的合理開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮花生芽，實驗室培養；白藜蘆醇標準品純度≥ 98%、LB培養基、瓊脂粉，北京索萊寶科技有限公司；AB-8、S-8、LX-68、H103、HPD500、LS-303、X-5、ADS-8、HPD450A、LSA-7、LSA-10、LSA-12、LSA-21、LSA-30、LSA-33、LSA-40大孔樹脂，鄭州和成新材料科技有限公司；二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）、BCA蛋白濃度測定試劑盒，蘭杰柯科技有限公司；硫酸卡那霉素，合肥中龍神力動物藥業有限公司；鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028），美國菌種保藏中心；所有分離用有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SCIIIIDM型微波光波超聲波萃取儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；ME99-2A型自動液相色譜分離層析儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；LGJ-10D型冷凍干燥機，北京四環科學儀器廠有限公司；Tensor II型傅立葉變換紅外光譜儀，美國BRUKER公司；1290型超高效液相色譜儀、6550型質譜儀、色譜柱waters BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7m），美國Agilent公司。

1.3 大孔吸附樹脂的預處理

參照巫永華等[16]的方法將樹脂進行活化處理，備用。

1.4 白藜蘆醇的標準曲線及曲線方程

參照馬密霞等[17]的方法。以吸光度對濃度繪制標準曲線，得回歸方程為=0.1443-0.008，其中R=0.999 6，從而計算白藜蘆醇含量。

1.5 試驗方法

1.5.1 花生芽白藜蘆醇的提取

采取本實驗室的方法[18]進行白藜蘆醇粗提液的制備。

1.5.2 乙酸乙酯萃取

將上述方法所得粗提液離心，棄沉淀，使用微孔濾膜（孔徑=0.45m）過濾除雜，其次采取陳瓊玲等[19]的方法進行初步純化。

1.5.3 大孔樹脂靜態吸附-解吸動力學曲線

參照楊希娟等[20]方法，并稍作修改。準確稱取預處理后樹脂2.0 g置于100 mL三角瓶中，加入白藜蘆醇質量濃度為141.43g/mL的花生芽提取液20 mL，于溫度25 ℃、120 r/min的水浴搖床中振蕩吸附，每隔30 min取樣一次，以吸附時間為1軸，吸附量為1軸，測定樣液中白藜蘆醇含量，繪制吸附動力學曲線圖。將錐形瓶中吸附飽和的樹脂用蒸餾水沖洗至液體澄清、無渾濁狀態，其次加入20 mL 70%乙醇溶液，于25℃、120 r/min的水浴搖床中，每隔一定時間取樣一次，以解吸時間為2軸，解吸量為2軸，測定樣液中白藜蘆醇含量，繪制解吸動力學曲線圖。

式中為大孔樹脂的吸附率，%；為大孔樹脂解吸率，%；0為吸附前樣品溶液白藜蘆醇的質量濃度，g/mL；1為吸附后樣品溶液白藜蘆醇的質量濃度，g/mL；1為樣液體積，mL；2為解吸液中白藜蘆醇質量濃度，g/mL；2為解吸液體積，mL。

1.5.4 大孔樹脂動態吸附-解吸條件的優化

參考劉樹興等[21]的方法進行優化。將處理好的樹脂濕法裝柱，考察料液濃度、上柱速率、粗提液pH值、上樣量對大孔樹脂吸附效果的影響；吸附完成后考察解吸劑濃度、解吸劑pH值、解吸流速、解吸劑體積對大孔樹脂解吸效果的影響。

1.5.5 產品純度定性定量分析及組分鑒定

1）紫外光譜掃描

準確稱取一定量的白藜蘆醇純化物凍干粉和標準品，用甲醇溶液將其配制成8.0g/mL的樣液及標液。以甲醇作為空白對照，在190～700 nm范圍內進行紫外光譜掃描[22]。

2）傅里葉紅外光譜掃描檢測

利用傅里葉紅外光譜儀進行分析。在衰減全反射模式（Attenuated Total Refraction，ATR）下，稱取一定量的白藜蘆醇凍干粉和標準品，對其特征吸收峰進行表征。波數范圍為400～4 000 cm-1。

3）超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-QTOF-MS/MS）檢測

色譜條件：色譜柱為waters BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7m）；流動相A：5 mmol乙酸銨水溶液；流動相B：甲醇溶液。梯度洗脫程序為：0～25 min：55%～40%A、45%～60%B；25～30 min：40%～55%A、60%～45%B；30～40 min：55%A、45%B。進樣量5L，流速為 0.3 mL/min；質譜掃描范圍：一級50～1 000 m/z，鞘流氣溫度350℃，鞘流氣流量12 L/min，ESI-模式，電壓3 200 V。

1.6 花生芽白藜蘆醇抑菌功效研究

1.6.1 最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）測定

參考杜貝貝[23]、郭文瑤[24]的方法測定.的MIC，同時以硫酸卡那霉素藥物培養基為陽性對照，以含2%DMSO培養基為陰性對照，通過酶標儀測定600 nm菌液的吸光度，以無菌生長孔所對應的白藜蘆醇純化物濃度為最小抑菌濃度[25]。

1.6.2 生長曲線的測定

參考朱亞珠等[26]的方法并稍作修改，繪制白藜蘆醇對.的生長曲線。

1.6.3 細菌通透性測定

參考Wang等[27]的試驗方法，收集菌體上清液，將上清液用0.22m濾膜過濾，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒的方法測定不同處理條件下菌體細胞外的蛋白質含量。

1.7 數據分析

所有試驗均重復3次，使用Excel 2019對數據進行初步處理，采用SPSS 16.0軟件進行單因素差異性分析，使用Origin 8.5、GrapHPad Prism8軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂對白藜蘆醇靜態吸附-解吸的影響

不同大孔樹脂因其極性和比表面積不同，故會表現出不同的吸附和解吸性能。16種大孔樹脂吸附和解吸性能如表1所示，LSA-40樹脂吸附率與解吸率均高于其他型號樹脂，且LSA-40樹脂為弱極性，由于多酚類化合物的分子中含有多個酚羥基結構，其分子的極性不高，所以弱極性的樹脂吸附效果較好。因此，選用LSA-40樹脂作為分離純化白藜蘆醇的較佳樹脂。

表1 不同型號樹脂對白藜蘆醇吸附解吸性能

2.2 LSA-40大孔樹脂的靜態吸附-解吸動力學曲線

由圖1a可知，在吸附前110 min內，樹脂對白藜蘆醇的吸附量隨時間的延長呈線性增加趨勢，在110 min時，吸附速率逐漸平穩，表明此時樹脂已接近吸附平衡，故選用110 min為較佳吸附平衡時間。由圖1b可知，90 min時，LSA-40樹脂對花生芽白藜蘆醇的解吸率達到飽和，其后隨著解吸時間的延長解吸率趨于平衡。由此確定較佳解吸時間為90 min。

圖1 LSA-40大孔樹脂的靜態吸附和解吸動力學曲線

2.3 LSA-40樹脂對白藜蘆醇動態吸附-解吸影響因素研究

2.3.1 上樣料液濃度、速率、pH值和液質比對吸附效果的影響

由圖2a可知，在白藜蘆醇總量相同的情況下，吸附率與上柱濃度呈拋物線關系，濃度在120g/mL時吸附率達最高，因此，選擇上柱濃度120g/mL為最佳。由圖 2b可知，上樣速率越小，則樹脂對白藜蘆醇的吸附容量就越大，但所耗時會增加。當速率超過1.0 mL/min后，吸附率下降較快，綜合考慮吸附率及效率可選擇流速1.0 mL/min。劉樹興等[21]對虎杖中白藜蘆醇的純化研究也得出了相同結果。由圖2c發現，隨著pH值的增加，白藜蘆醇吸附率呈先增加后降低的趨勢，在pH=4.2時，吸附率達到峰值，因此確定上柱液的pH值為4.2。根據圖 2d可以看出，當上樣量與樹脂質量比例為8時吸附效果最好，上樣量的比例再增大，則超過樹脂飽和吸附量，吸附率反而下降，故選擇上樣量為樹脂質量的8倍為較佳。

注：同一指標不同字母代表差異顯著（P<0.05），下同。

2.3.2 乙醇濃度、pH值和流速對解吸效果的影響

由圖3a可知，隨著乙醇濃度增大，解吸率逐漸增高，因考慮到隨著乙醇濃度增加，洗脫液中其他脂溶性雜質溶出增加，并且當濃度上升到80%時，再增大乙醇濃度，解吸率無顯著差異（>0.05），故選用80%的乙醇作為解吸劑。由圖3b可知，解吸液在pH值為7.6時解吸效果最好，因白藜蘆醇在堿性溶液中不穩定，且在自然狀態下pH值為6.6，與pH值7.6時解吸率無顯著差異（>0.05），故選用pH值為6.6解吸液進行洗脫更有利于其穩定性。由圖3c可知，解吸率隨流速增大而減小，且流速越大，溶劑與樹脂的作用時間越短，使有效成分不能充分解吸。但隨著流速的增大，生產效率會提高。綜合考慮選擇流速1.0 mL/min較為合適。

2.3.3 花生芽白藜蘆醇解吸曲線研究

根據已知確定的吸附條件以選取10 g樹脂為例，上樣充分吸附后，以解吸條件進行解吸操作，流出液每8 mL單獨收集于刻度試管中，并測定每份解吸液的白藜蘆醇濃度，以解吸液體積為橫坐標，白藜蘆醇濃度為縱坐標，繪制解吸曲線。由圖4可以看到，解吸初始，白藜蘆醇洗脫較少，但很快，在10～80 mL的洗脫液中，解吸了大部分的有效成分，隨著乙醇的繼續洗脫，剩余少量的白藜蘆醇也逐漸被解吸下來，考慮到提高純化效率，故選用解吸液體積80 mL，其與樹脂質量比為8 mL/g作為較佳洗脫量。

a. 乙醇濃度對解吸率的影響a. Effects of ethanol concentration on desorption rateb. pH值對解吸率的影響b. Effects of pH on desorption ratec. 流速對解吸率的影響c. Effects of flow rate on desorption rate

圖4 白藜蘆醇解吸曲線

2.4 純化后白藜蘆醇的分析及鑒定

2.4.1 紫外全波長掃描分析

由圖5可知，將分離純化所得出的白藜蘆醇用甲醇溶解，對比白藜蘆醇標品與純化后樣品紫外全波長掃描圖，發現樣品與標準品吸收峰基本一致，說明該提取物屬于白藜蘆醇類物質。參考紀秀鳳等文獻的方法[28]，通過計算，樣品白藜蘆醇純度可達84.0%。

圖5 花生芽白藜蘆醇純化物紫外可見光譜掃描圖

2.4.2 FTIR掃描分析

花生芽白藜蘆醇純化物的傅里葉紅外光譜結果如圖 6所示，可知該純化產物與標準品特征吸收峰之間無明顯差異，主要吸收峰有：3 336、1 607、1 513、1 461、1 144、1 061、964、831、670、515 cm-1。3 336 cm-1處吸收峰是由于分子結構中羥基的伸縮振動形成的；在1 607、1 513、1 461 cm-1處有吸收峰主要是由于苯環內的C=C和C-C間耦合而成的伸縮振動作用導致；在1 061、964、831 cm-1處有強吸收峰是因兩酚環間的反式-C=C-的伸縮振動引起；在670 cm-1處有特征吸收峰是由于兩酚環間順式-C=C-的伸縮振動所導致。以上說明花生芽白藜蘆醇結構中有酚羥基、苯環、-C=C-等特征基團，此結果與孫磊磊[29]和李小妹等[30]文獻研究報道相一致。

圖6 花生芽白藜蘆醇純化物紅外光譜圖分析

2.4.3 UPLC-QTOF-MS/MS鑒定分析

通過超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-QTOF- MS/MS），結合準分子離子[M-H]-(m/z)和相對應的碎片離子信息，對花生芽白藜蘆醇純化物組成進行分析。圖7為負離子模式下得到的總離子流圖，對譜峰的多級碎片進行解析，共鑒別了8個化學成分，主要包含白藜蘆醇和原花青素兩種物質。白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物，順式白藜蘆醇對光不穩定，故自然界中大多以反式白藜蘆醇存在，其衍生物主要包括氧化白藜蘆醇和白藜蘆醇苷，根據其聚合程度分為白藜蘆醇二聚體、四聚體等[31]；原花青素是由黃烷-3-醇結構單元組成的多酚類物質，單體主要包括兒茶素（Catechin，Cat）、表兒茶素（Epicatechin，EC）、表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin Gallate，ECG）及表沒食子兒茶素沒食子酸（Epigallocatechin Gallate，EGCG）等[32-33]，根據單體間化學鍵結合位置不同可以將其分為A型原花青素和B型原花青素，而花生中以A型原花青素為主，且A型更穩定性、生物利用度更高。

注：1-8號含義見表2。

純化物主要成分組成，匯總結果具體見表2。

表2 已知化合物的鑒定分析結果

化合物1和2的分子離子[M-H]-m/z為863，其結構為A型原花青素三聚體。Monagas等[34]發現其碎片離子包括m/z 711、m/z 575、m/z 451、m/z 411和m/z 289。其中m/z 711是在T-unit位置發生逆狄爾斯-阿爾德（Retro- Diels-Alder，RDA ）和雜環裂解（Heterocyclic Ring Fission，HRF）斷裂產生的離子，m/z 575是分子離子黃烷醇間連接鍵的斷裂量子力學（Quantum Mechanics，QM）發生在T-unit連接鍵位置時形成的，m/z 451和m/z 411是M-unit上發生HRF裂解產生，m/z 289是分子離子黃烷醇間連接鍵的斷裂（QM）發生在M-unit連接鍵位置時形成的。通過表2碎片離子信息與上述參考文獻描述相符，確定其為A型原花青素三聚體。

化合物3的分子離子[M-H]-m/z為575，其結構為A型原花青素二聚體。紀秀鳳[35]研究發現其碎片離子包括m/z 289、m/z 285。m/z 289和m/z 285是由于QM碎裂失去B-unit和T-unit中性碎片所形成的。通過表2碎片離子信息與上述參考文獻一致，確定其為A型原花青素二聚體。

化合物4的分子離子[M-H]-m/z為243，其結構為氧化白藜蘆醇。對于氧化白藜蘆醇通過丟失碎片C2H2O、2C2H2O形成產物離子m/z 201、m/z 159。通過表2碎片離子信息與楊陽[36]文獻結果一致，因此確定為氧化白藜蘆醇。

化合物5的分子離子[M-H]-m/z為227，其結構為白藜蘆醇。在負離子模式下掃描，并通過碰撞誘導解離（Collision-Induced Dissociation，CID）產生一系列特征碎片離子m/z 185、m/z 159、m/z 143。通過表2碎片離子信息與吳泳錫等[37]文獻描述相符，確定其為白藜蘆醇。

化合物6的分子離子[M-H]-m/z為441，其結構為表兒茶素沒食子酸酯。在負離子模式下對母離子進行碰撞誘導解離，獲得二次特征碎片離子m/z 288、m/z 169。通過表2碎片離子信息與馮峰等[38]參考文獻描述相符，確定其為表兒茶素沒食子酸酯。

化合物7的分子離子[M-H]-m/z為451，其結構為白藜蘆醇二聚體。通過丟失碎片H2O、C2H2O、C7H6O形成產物離子m/z 435、m/z 409、m/z 305。準分子離子峰[M-H]-失去碎片C2H2O形成產物離子m/z 409是其間苯二酚失去C2H2O所致。通過表2碎片離子信息與宇嘉[31]參考文獻描述相符，確定其為白藜蘆醇二聚體。

化合物8的分子離子[M-H]-m/z為389，其結構為白藜蘆醇苷。通過表2得到的主要碎片離子m/z 185、m/z 143，與白黎蘆醇苷母離子裂解丟失一個取代葡萄糖基(-C6H10O5)生成的苷元，白藜蘆醇負離子的m/z 185相符，并與董靜等[39]文獻方法對白藜蘆醇苷的分析結果一致，因此確定m/z為389的化合物為白藜蘆醇苷。

2.5 花生芽白藜蘆醇對鼠傷寒沙門氏菌抑菌功效評價

2.5.1 花生芽白藜蘆醇對鼠傷寒沙門氏菌最小抑菌濃度的研究

由圖8可知，白藜蘆醇純化物濃度在250g/mL（含白藜蘆醇為210g/mL）時能夠顯著抑制.的生長（<0.01），因此白藜蘆醇純化物對.的最小抑菌濃度（MIC）為250g/mL，與紅豆皮多酚提取物MIC[40]（2 500g/mL）相比具有顯著優勢；隨著白藜蘆醇純化物濃度增加，抑制活性越強，在500g/mL時，基本能夠完全抑制.生長；在低于MIC濃度時，白藜蘆醇純化物均不能有效抑制.的生長。

2.5.2 花生芽白藜蘆醇純化物對鼠傷寒沙門氏菌生長曲線影響的研究

細菌在適宜條件下的生長曲線大致呈“S”型，一般會經歷延滯期、對數期、穩定期。由圖9可知，白藜蘆醇純化物濃度為62.5、125、250g/mL 3個試驗組的生長曲線表現出不同程度的抑制效果。62.5g/mL組約在5 h后呈指數形式增長，約16 h后到達穩定期；125g/mL組約在7 h后呈指數形式增長，約18 h后到達穩定期，說明在62.5、125g/mL濃度處理條件下白藜蘆醇破壞了.生長周期，導致其延滯期延長及對數生長期生長速度降低，且白藜蘆醇濃度越高，抑制作用越明顯250g/mL組約在18 h后才表現出微小的生長趨勢，且整體生長速度緩慢，延滯期相比陰性對照組明顯延長，說明濃度為250g/mL的白藜蘆醇溶液幾乎完全破壞了細菌的正常細胞分裂及生長周期，.的正常生長受到嚴重破壞。綜上，62.5和125g/mL處理組抑制作用表現為延長遲緩期并降低其生長速度，當白藜蘆醇純化物濃度為250g/mL時，顯著抑制.的生長。

注：“*”表示組間存在顯著性差異（P<0.05），“**”表示組間存在極顯著差異（P<0.01），圖10同。

2.5.3 花生芽白藜蘆醇對鼠傷寒沙門氏菌蛋白質泄露的研究

蛋白質對于細胞的生長發育、生長代謝、各種生理功能的發揮具有重要作用。當細胞膜受到損傷時，其通透性會增加，從而使胞內大量內容物外泄，嚴重影響細胞的正常生長。因此，可以通過測定培養基中的蛋白質含量來判斷細胞是否遭到破壞。如圖10所示，白藜蘆醇純化物濃度62.5g/mL組與空白對照組沒有顯著性差異（>0.05），說明該濃度下菌體蛋白質泄露不明顯。當濃度增至125、250g/mL時，細胞遭到嚴重破壞，其內容物溢出，導致培養液中的蛋白質含量增加，與空白對照組相比有極顯著差異（<0.01），即白藜蘆醇濃度越大蛋白質泄露程度越深，細胞膜和細胞壁破損越嚴重。由此表明，花生芽白藜蘆醇對.有明顯抑制作用。

圖9 鼠傷寒沙門氏菌在不同濃度白藜蘆醇純化物處理下的生長曲線

圖10 花生芽白藜蘆醇對鼠傷寒沙門氏菌蛋白質泄露的影響

3 結 論

本文通過靜態吸附-解吸試驗比較了AB-8、 S-8、LX-68、H103、X-5、LSA-40等16種大孔樹脂對花生芽白藜蘆醇提取物的分離純化效果，從中篩選出LSA-40為較佳吸附樹脂類型，該樹脂對花生芽白藜蘆醇具有較好的吸附和解吸性能，且價格便宜，易操作。通過動態吸附-解吸條件優化，得到適宜吸附條件為上樣濃度120.00g/mL，上樣速率1.00 mL/min，pH值為4.2，上樣量8.00 mL/g；解吸條件為80%乙醇溶液，pH值6.6，流速1.00 mL/min。經紫外光譜分析，LSA-40大孔樹脂在較優工藝條件下分離純化的花生芽白藜蘆醇其純度可達84.0%；利用傅里葉紅外光譜、超高效液相色譜串聯質譜鑒定分析表明純化物中主要含有白藜蘆醇低聚體及部分原花青素低聚體。通過測定白藜蘆醇純化物對.的最小抑菌濃度得出最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）為250g/mL，此外，通過繪制生長曲線及細胞內容物蛋白質含量變化得出白藜蘆醇純化物處理后的.，其延滯期延長、對數期生長速度降低，細胞壁完整性遭到破壞，細胞膜通透性增加，最終導致菌體無法正常生長，表明經LSA-40樹脂純化后的花生白藜蘆醇具有較高的活性。該研究可為花生資源深度利用和白藜蘆醇生物活性的構效分析及其在功能性食品、藥品、化妝品和無抗養殖等領域的利用提供一定的科學依據。

[1] 王娜，李娜，余秋穎，等. 花生芽菜發芽過程中營養物質變化規律研究[J]. 花生學報，2021，50(3)：61-67，79.

Wang Na, Li Na, Yu Qiuying, et al. Study on the change of nutrients during the germination process of peanut sprouts[J]. Acta Peanuts, 2021, 50(3): 61-67, 79. (in Chinese with English abstract)

[2] 張茜，鄭雅瑩，李妍，等. 高壓靜電場預處理對花生芽活性物質及抗氧化能力的影響[J]. 食品科學，2019，40(17)：190-195.

Zhang Qian, Zheng Yaying, Li Yan, et al. Effect of high-voltage electrostatic field pretreatment on active substances and antioxidant capacity of peanut sprouts[J]. Food Science, 2019, 40(17): 190-195. (in Chinese with English abstract)

[3] 于梅，秦敬波，劉竹青，等. 花生芽中白藜蘆醇粗提物對香腸中4種腐敗菌的抑菌活性[J]. 中國食品學報，2018，18(12)：203-209.

Yu Mei, Qin Jingbo, Liu Zhuqing, et al. Bacteriostatic activity of resveratrol crude extract in peanut buds against four spoilage bacteria in sausage[J]. Chinese Journal of Food Science, 2018, 18(12): 203-209. (in Chinese with English abstract)

[4] 劉連紅，陳飛，管永祥，等. 楓香擬莖點霉B3生物轉化花生廢棄物合成白藜蘆醇[J]. 食品科學，2020，41(6)：170-178.

Liu Lianhong, Chen Fei, Guan Yongxiang, et al. Synthesis of Resveratrol from Peanut Wastes by Biotransformation of Phomopsis liquidambari B3[J]. Food Science, 2020, 41(6): 170-178. (in Chinese with English abstract)

[5] 吳文英，李文娟，李露，等. 白藜蘆醇對多柔比星引起的心臟毒性保護作用研究進展[J]. 食品科學，2021，42(5)：271-277.

Wu Wenying, Li Wenjuan, Li Lu, et al. Research progress on the cardiotoxic protective effect of resveratrol on doxorubicin[J]. Food Science, 2021, 42(5): 271-277. (in Chinese with English abstract)

[6] Singh A K, Vinayak M. Anti–nociceptive effect of resveratrol during inflammatory hyperalgesia via differential regulation of pro–inflammatory mediators[J]. Phytotherapy Research, 2016, 30(7): 1164–1171.

[7] Biasutto L, Mattarei A, Azzolini M, et al. Resveratrol derivatives as a pharmacological tool[J]. Annals of the New York Academy of Sciences,2017,1403(1): 27–37.

[8] Singh A P, Singh R, Verma S S, et al. Health benefits of resveratrol: Evidence from clinical studies[J]. Medicinal Research Reviews, 2019, 39(5): 1851–1891.

[9] 吳上. 食品加工理化因子對鼠傷寒沙門氏菌耐藥性的影響及相關機制研究[D]. 無錫：江南大學，2021.

Wu Shang. Effect of Physical and Chemical Factors of Food Processing on Resistance ofand Related Mechanisms[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2021. (in Chinese with English abstract)

[10] Mezal E H, Stefanova R, Khan A A. Isolation and molecular characterization of Salmonella enterica serovar Javiana from food, environmental and clinical samples[J]. International Journal of Food Microbiology, 2013, 164(1): 113-118.

[11] Zhao S, Mcdermott P F, Friedman S, et al. Characterization of antimicrobial-resistant Salmonella isolated from imported foods[J]. Journal of Food Protection, 2006, 69(3): 500-507.

[12] Marino A, Santoro G, Spataro F, et al. Resveratrol role in Staphylococcus aureus-induced corneal inflammation[J]. Pathogens and Disease, 2013, 68(2): 61-64.

[13] 李峰，陳雯雯，鄧江麗，等. 白藜蘆醇對核桃細菌性黑斑病菌的抑制作用[J]. 生物技術通報，2021，37(6)：58-65.

Li Feng, Chen Wenwen, Deng Jiangli, et al. Inhibition of resveratrol on walnut bacterial black spot fungus[J]. Bulletin of Biotechnology, 2021, 37(6): 58-65. (in Chinese with English abstract)

[14] Duan J J, Li M L, Hao Z H, et al. Subinhibitory concentrations of resveratrol reduce alpha-hemolysin production in Staphylococcus aureus isolates by downregulating saeRS[J]. Emerging Microbes & Infections, 2018, 7(1): 136.

[15] 李琳，余安玲，吳軼，等. 改性果膠與白藜蘆醇的相互作用機制及抗氧化能力[J]. 華南理工大學學報（自然科學版），2021，49(9)：1-10.

Li Lin, Yu Anling, Wu Yi, et al. Interaction mechanism and antioxidant capacity of modified pectin and resveratrol[J]. Journal of South China University of Technology (Natural Science Edition), 2021, 49(9): 1-10. (in Chinese with English abstract)

[16] 巫永華，張建萍，趙節昌，等. 大孔樹脂純化黃精多酚及其抗氧化性與組成分析[J]. 農業工程學報，2020，36(1)：318-326.

Wu Yonghua, Zhang Jianping, Zhao Jiechang, et al. Antioxidantion and composition analysis of purified polygonatum sibiricum polyphenols using macroporous resin[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(1): 318-326. (in Chinese with English abstract)

[17] 馬密霞，秦寧，閔清，等. 微波超聲波聯用萃取白藜蘆醇及其苷的HPLC測定[J]. 化工學報，2019，70(S1)：124-129.

Ma Mixia, Qin Ning, Min Qing, et al. HPLC determination of resveratrol and its glycosides by microwave ultrasonic extraction[J]. CIESC Journal, 2019, 70(S1): 124-129. (in Chinese with English abstract)

[18] 王娜，寧燦燦，張雙雙，等. 不同產地及品種花生紅衣白藜蘆醇的差異化分析[J].花生學報, 2022, 51(1):86-92.

Wang Na, Ning Cancan, Zhang Shuangshuang, et al. Differentiation analysis of resveratrol in red coat of peanuts from different origins and varieties[J]. Journal of Peanut Science, 2022, 51(1):86-92. (in Chinese with English abstract)

[19] 陳瓊玲，劉紅芝，劉麗，等. 大孔樹脂-硅膠柱層析法純化花生根中白藜蘆醇[J]. 中國食品學報，2014，14(6)：127-132.

Chen Qiongling, Liu Hongzhi, Liu Li, et al. Resveratrol purified in peanut root by macroporous resin-silicone column chromatography[J]. Chinese Journal of Food Science, 2014, 14(6): 127-132. (in Chinese with English abstract)

[20] 楊希娟，黨斌，張杰，等. 黑青稞麩皮結合態酚類物質大孔樹脂分離純化工藝優化[J]. 農業工程學報，2018，34(21)：295-303.

Yang Xijuan, Dang Bin, Zhang Jie, et al. Process optimization on separation and purification of bound polyphenol in black highland barley bran by macroporous resin[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2018, 34(21): 295-303. (in Chinese with English abstract)

[21] 劉樹興，程麗英，高連周，等. 大孔吸附樹脂法分離純化白藜蘆醇的研究[J]. 食品科學，2005, 26(9)：247-251.

Liu Shuxing, Cheng Liying, Gao Lianzhou, et al. Separation and purification of resveratrol by macroporous adsorption resin method[J]. Food Science, 2005, 26(9): 247-251. (in Chinese with English abstract)

[22] Fu C, Yang X, Lai S, et al. Structure, antioxidant and α-amylase inhibitory activities of longan pericarp proanthocyanidins[J]. Journal of Functional Foods, 2015, 14(3): 23-32.

[23] 杜貝貝. 紅蓼活性化合物槲皮素結構優化初探及對馬鈴薯環腐病菌的抑菌作用研究[D]. 太原：山西大學，2021.

Du Beibei. A Preliminary Study on the Structural Optimization of Quercetin, An Active Compound of Red Indigo, and Its Bacteriostatic Effect on Potato Cyclic Rot Bacteria[D]. Taiyuan: Shanxi University, 2021. (in Chinese with English abstract)

[24] 郭文瑤. 綠原酸對食源性致病菌的抑菌作用及機理研究[D]. 西安：陜西科技大學，2021.

Guo Wenyao. Study on the Bacteriostatic Effect and Mechanism of Chlorogenic Acid on Foodborne Pathogenic Bacteria[D]. Xi'an: Shaanxi University of Science and Technology, 2021. (in Chinese with English abstract)

[25] Valentina V E, Simona N, Fabrizio B, et al. In vitro antimicrobial activity of essential oils against salmonella enterica serotypes enteritidis and typhimurium strains isolated from poultry[J]. Molecules, 2019, 24(5): 900.

[26] 朱亞珠，夏率博，陳琳，等. 一株貝萊斯芽孢桿菌的生長特性及抑菌活性研究[J]. 食品科學技術學報，2022，40(1)：85-92.

Zhu Yazhu, Xia Lvbo, Chen Lin, et al. Growth characteristics and bacteriostatic activity of a strain of Bacillus Velez[J]. Journal of Food Science and Technology, 2022, 40(1): 85-92. (in Chinese with English abstract)

[27] Wang L, Zhao X Q, Xia X J, et al. Inhibitory effects of antimicrobial peptide JH-3 on salmonella enterica serovar typhimurium strain CVCC541 infection-induced inflammatory cytokine release and apoptosis in RAW264.7 cells[J]. Molecules, 2019, 24(3): 596.

[28] 紀秀鳳，蘆宇，劉海春，等. 大孔樹脂-聚酰胺分離純化紅樹莓籽低聚原花青素及其體外模擬胃、腸消化[J]. 中國食品學報，2020，20(6)：173-180.

Ji Xiufeng, Lu Yu, Liu Haichun, et al. Macroporous resin-polyamide separation and purification of red raspberry seed oligomeric proanthocyanidins and their in vitro simulated stomach and intestinal digestion[J]. Chinese Food Science, 2020, 20(6): 173-180. (in Chinese with English abstract)

[29] 孫磊磊. 新疆赤霞珠葡萄葉白藜蘆醇的提取純化及其應用研究[D]. 烏魯木齊：新疆大學，2015.

Sun Leilei. Extraction and Purification of Resveratrol in Xinjiang Cabernet Sauvignon Grape Leaf and Its Application[D]. Urumqi: Xinjiang University, 2015. (in Chinese with English abstract)

[30] 李小妹，李娜，黃開勝，等. 白藜蘆醇低聚體類似物的光譜特征、生源與生物活性[J]. 藥學學報，2002(1)：69-74.

Li Xiaomei, Li Na, Huang Kaisheng, et al. Spectral characteristics, biogenesis and biological activity of resveratrol oligomer analogues[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2002(1): 69-74. (in Chinese with English abstract)

[31] 宇嘉. 白藜蘆醇及其二聚體淬滅單線態氧機制的研究[D]. 西安：陜西師范大學，2019.

Yu Jia. Study on the Mechanism of Resveratrol and Its Dimer Quenching Singlet Oxygen[D]. Xi'an: Shaanxi Normal University, 2019. (in Chinese with English abstract)

[32] 蘇晨露，艾連中，吳艷，等. 羅望子種皮原花青素系統的非酶褐變動力學和食品配方因素影響[J]. 食品科學，2022，43(5)：26-38.

Su Chenlu, Ai Lianzhong, Wu Yan, et al. Effects of non-enzymatic browning kinetics and food formulation factors on tamarind seed coat proanthocyanidin system[J]. Food Science, 2022, 43(5): 26-38. (in Chinese with English abstract)

[33] Silva J M D, Darmon N, Mitjavila S, et al. Oxygen free radical scavenger capacity in aqueous models of different procyanidins from grape seeds[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 39(9): 1549-1552.

[34] Monagas M, Garrido I, Lebrón-Aguilar R, et al. Almond (Prunus dulcis (Mill. ) D. A. Webb) skins as a potential source of bioactive polyphenols[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(21): 8498-8507.

[35] 紀秀鳳. 紅樹莓籽中低聚原花青素純化鑒定及其微膠囊化研究[D]. 錦州：渤海大學，2019.

Ji Xiufeng. Purification and Identification of Oligomeric Proanthocyanidins in Red Raspberry Seeds and Its Microencapsulation[D]. Jinzhou: Bohai University, 2019. (in Chinese with English abstract)

[36] 楊陽. 白藜蘆醇抗膀胱癌活性、代謝特征及其構效關系的體外研究[D]. 大連：大連醫科大學，2019.

Yang Yang. In Vitro Study on the Activity, Metabolic Characteristics and Structure-activity Relationship of Resveratrol Anti-bladder Cancer[D]. Dalian: Dalian Medical University, 2019. (in Chinese with English abstract)

[37] 吳泳錫，張美玉，王一竹，等. 基于GC-MS和LC-MS的人參冰酒成分分析[J]. 質譜學報，2022，43(2)：189-200.

Wu Yongxi, Zhang Meiyu, Wang Yizhu, et al. Composition analysis of ginseng ice wine based on GC-MS and LC-MS[J]. Journal of Mass Spectrometry, 2022, 43(2): 189-200. (in Chinese with English abstract)

[38] 馮峰，程甲，粟有志，等. 高效液相色譜-串聯質譜法檢測紅葡萄酒中功效成分[J]. 色譜，2017，35(2)：178-184.

Feng Feng, Cheng Jia, Su Youzhi, et al. Determination of functional ingredients in red wine by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chromatography, 2017, 35(2): 178-184. (in Chinese with English abstract)

[39] 董靜，王弘，萬樂人，等. 高效液相色譜/電噴霧-離子阱-飛行時間質譜分析鑒定中藥虎杖中的主要化學成分[J]. 色譜，2009，27(4)：425-430.

Dong Jing, Wang Hong, Wan Leren, et al. Identification of major chemical components in Chinese medicine polygonum by high performance liquid chromatography/electrospray-ion trap-time-of-flight mass spectrometry[J]. Chromatography, 2009, 27(4): 425-430. (in Chinese with English abstract)

[40] 賈睿，蔡丹，葛思彤，等. 紅豆皮多酚提取物對兩種致病菌的抑菌活性及作用機理[J]. 食品科學，2021，42(23)：64-71.

Jia Rui, Cai Dan, Ge Sitong, et al. Bacteriostatic activity and mechanism of action of red bean peel polyphenol extract on two pathogenic bacteria[J]. Food Science, 2021, 42(23): 64-71. (in Chinese with English abstract)

Purification process by macroporous resin and antibacterial efficacy of resveratrol from peanut buds

Wang Na1,2,3,4, Ning Cancan1,3, Zhao Zheng1,3, Li Junwei1,3, Wang Fan1,3, Ren Hongtao1,3, Zhan Ke1,3, Yu Qiuying1,3,4※

(1.,,450002,;2.,,450002,; 3.,450002,;4.,,450002,)

Peanut sprout (longevity sprout) is one kind of favored food and therapy, due to its crisp taste and unique flavor. The energy, protein, and crude fat content of peanut buds after germination is significantly higher than that of various vegetables. There is a great increase in the content of vitamins, potassium, magnesium minerals, and various amino acids and trace elements required by the human body, especially the content of resveratrol, a polyphenol with important bioactive functions. Among them, resveratrol (chemically known as 3, 4', 5-astragalotriphenol) has the broad-spectrum antibacterial activity as the "plant antitoxin" in recent years. But, there are only a few reports on the effects of peanut bud resveratrol on. This study was focused on the isolation and purification technique of resveratrol from peanut buds, together with its antibacterial properties. The resins were screened with excellent adsorption and desorption properties for the peanut bud resveratrol compounds, in order to construct the isolation and purification process. The antibacterial efficacy was evaluated to improve the comprehensive utilization of peanut resources. A comparison was made to determine the effects of 16 types of macroporous resins on the separation and purification of arachidonic resveratrol compounds using static adsorption-desorption tests. The LSA-40 was selected as the best adsorption resin for the saturation and plateau in 110 and 90min of static adsorption, respectively. The dynamic adsorption-desorption conditions were optimized as follows. The loading concentration was 120.00g/mL, the flow rate was 1.00 mL/min, the pH value was 4.2, and theoptimum ratio of loading volume to resin was 8.00mL/g. The desorption conditions were the 80% ethanol solution, a pH value of 6.6, and a flow rate of 1.00 mL/min. Ultraviolet (UV) spectral analysis showed that the absorption peaks of the purified arachidonic resveratrol and the control were basically the same under the optimized process conditions, where the purity was calculated to be 84.0%. Fourier infrared spectroscopy and ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry were used to identify the components of the purified samples. It was found that the main components of the purified products were resveratrol and the derivatives. The inhibition effect of the purified product onwas evaluated by multiplicative dilution, inhibition growth curve, and cell membrane permeability. The minimum inhibitory concentration of resveratrol-purified product onwas 250g/mL. In addition,treated with resveratrol purification presented a prolonged lag period and a decreased growth rate in the logarithmic phase at the MIC concentration. The cell membrane permeability significantly increased (< 0.01), according to the growth curve and the protein content of cell contents. The integrity of the cell wall was damaged causing the serious leakage of intracellular proteins, eventually leading to the death of. This finding can provide some theoretical reference for the comprehensive utilization of peanut resources in natural antibacterial agents.

adsorption;bacteriostasis; peanut sprouts; resveratrol;LSA-40 macroporous resin; mass spectrometry identification

10.11975/j.issn.1002-6819.2022.18.032

TS209

A

1002-6819(2022)-18-0293-09

王娜，寧燦燦，趙崢，等. 花生芽白藜蘆醇大孔樹脂純化工藝及抑菌功效[J]. 農業工程學報，2022，38(18)：293-301.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.18.032 http://www.tcsae.org

Wang Na, Ning Cancan, Zhao Zheng, et al. Purification process by macroporous resin and antibacterial efficacy of resveratrol from peanut buds [J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2022, 38(18): 293-301. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.18.032 http://www.tcsae.org

2022-06-25

2022-09-13

“十三五”國家重點研發計劃專項（2019YFC1605700）；鄭州市營養與健康食品重點實驗室項目（KF20190426）；河南省花生產業技術體系項目（2022）

王娜，博士，副教授，研究方向為食品安全與免疫學。Email：na-wang@163.com

余秋穎，博士，講師，研究方向為食品安全與免疫學。Email：yuqiuyingzf@163.com