MUC17抑制胃癌細胞的轉移

袁 濤， 邢 蕊

北京大學腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所胃腸腫瘤生物學研究室，惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室，北京 100142

根據2020年全球癌癥統計數據顯示，我國胃癌的發病率和死亡率均高居第三位[1]。癌細胞轉移是胃癌患者死亡的主要原因之一[2]，以往研究發現，即便是在腫瘤早期，腫瘤細胞也會發生轉移[3]，因此，鑒定導致轉移的關鍵基因是防治胃癌轉移、延長患者生存期的關鍵[4-5]。

以往研究表明，胃黏膜屏障的破壞是胃癌發生發展的始動因素[6-7]。黏蛋白家族是一種高度糖基化修飾的高分子量蛋白家族，由上皮組織產生，具有組織潤滑及細胞信號轉導等多種功能，是胃黏膜保護屏障的主要組成成分[8]。近年來，黏蛋白作為腫瘤分子標志物倍受重視。如MUC1在胃癌組織中高表達，且與患者預后不良密切相關[9]；MUC16在結直腸癌中高表達，且與患者預后呈負相關[10]。本實驗室主要針對MUC17進行了系統研究。在前期研究中，我們發現MUC17在胃癌組織中高表達，且與患者預后呈正相關[11-12]；進一步研究發現，MUC17可以通過抑制NF-κB通路抵御炎癥因子促進腫瘤細胞增殖的作用，從而延長患者生存期[11]。腫瘤細胞的惡性行為不僅與炎癥相關，更與癌細胞的轉移密不可分，因此，在本研究中我們著重闡述MUC17的表達與胃癌細胞轉移的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 組織標本和胃癌細胞：本研究使用的103例胃癌組織來自于北京大學腫瘤醫院手術樣本，所有患者在取材前均未接受任何放化療等治療，術后病理診斷均為原發胃癌。本研究獲得北京大學腫瘤醫院倫理委員會批準(批號：2018KT14)。本研究所用胃癌細胞系AGS為貼壁細胞，購自ATCC(The Global Bioresource Center)，使用含1%青霉素-鏈霉素、質量濃度為100 g/L胎牛血清的DMEM培養基，在37 ℃、體積分數為5%的CO2條件下培養。

1.1.2 主要試劑：FuGENE HD轉染試劑(E2311，Promega，美國)，兔抗人MUC17抗體(HPA031634，Sigma，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化：胃癌組織樣本經中性福爾馬林溶液固定、石蠟包埋后制備白片，按如下步驟進行免疫組化實驗：石蠟切片脫蠟至水，高壓抗原熱修復，3% H2O2室溫孵育10 min清除內源性過氧化氫酶活性，質量濃度為50 g/L的脫脂奶粉室溫孵育1 h封閉，滴加稀釋后的MUC17抗體4 ℃過夜孵育，PBS沖洗5 min×3次，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色，蘇木素復染，流水返藍，封片。

1.2.2 細胞轉染：參照文獻設計出針對MUC17進行干擾的靶序列：ATACCAACCTCGACTCTTA[11]。根據靶序列，按照pSilencer質粒說明書人工合成一對互補并編碼siRNA的寡核苷酸鏈。將1 μl 2 μmol/L的正、反義寡核苷酸鏈混合，加熱至95 ℃并緩慢冷卻至室溫，形成雙鏈。用BamHI與HindIII雙酶切pSilencer載體質粒，瓊脂糖電泳純化回收后在T4連接酶催化下與退火形成的雙鏈連接，并轉化大腸桿菌DH5α。提取質粒，經測序對重組載體進行驗證。細胞轉染前1 d，將AGS細胞接種于培養皿中，待細胞融合度為60%～80%時，依據Promega FuGENE HD試劑說明書，將混勻后的轉染試劑-質粒混合物加入細胞培養基中(轉染試劑∶質粒=3∶1)，在37 ℃、體積分數為5%的CO2條件下培養48 h。

1.2.3 Transwell實驗：消化AGS細胞于含質量濃度為20 g/L胎牛血清的培養基，將含2×105個細胞的100 μl細胞懸液加入上室中，下室中加入800 μl含質量濃度為100 g/L胎牛血清的培養基，在37 ℃、體積分數為5%的CO2條件下培養24 h。取出Transwell小室，轉移至預先加入PBS的孔中洗3次，4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.1%結晶紫室溫染色15 min。

1.2.4 TCGA數據分析：我們用GEPIA2數據庫(http://gepia2.cancer-pku.cn)[13]分析TCGA胃癌樣本中MUC17和CDH1表達的相關性，使用Pearson相關性分析。

1.3 統計學分析采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。MUC17的表達與胃癌患者轉移相關性分析采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MUC17的表達與胃癌轉移呈負相關為了確定MUC17對胃癌細胞轉移的影響，我們首先利用免疫組化實驗在103例胃癌組織中檢測了MUC17的表達與胃癌遠端轉移的相關性。如表1所示，MUC17的表達與胃癌轉移呈負相關。如圖1所示，相對于發生轉移的原位癌，MUC17高表達于未發生轉移的原位癌。

表1 MUC17的表達與遠端轉移的相關性

圖1 用免疫組化在發生(A)/未發生(B)轉移的原位癌中檢測MUC17的表達(放大100倍)

2.2 MUC17抑制胃癌細胞的轉移為了研究MUC17對胃癌細胞轉移的影響，我們進行了Transwell實驗。如圖2所示，在胃癌細胞AGS中干擾MUC17的表達后，AGS細胞的轉移能力明顯增加。

注：A～B：在AGS細胞中用Transwell實驗檢測干擾MUC17的表達對胃癌細胞轉移的影響，A為CTRL,B為sh-MUC17,放大200倍；C：Transwell實驗中遷移AGS細胞數的直方圖。n=3。

2.3 MUC17的表達與CDH1的表達呈正相關CDH1基因編碼的E-鈣黏蛋白是鈣依賴性細胞黏附蛋白，參與調節細胞粘附、遷移，其功能缺失導致腫瘤細胞的侵襲與轉移[14-15]。為了闡明MUC17抑制胃癌細胞轉移的機制，我們利用TCGA數據分析MUC17與CDH1表達的相關性。如圖3所示，MUC17的表達與CDH1的表達呈正相關(R=0.46，P<0.001)。

圖3 利用TCGA數據分析MUC17與CDH1表達的相關性

3 討論

我們前期的研究發現，MUC17具有抑制胃癌細胞增殖、抵御炎癥因子促進腫瘤細胞增殖的作用，以及抑制幽門螺桿菌毒力蛋白CagA轉運至上皮細胞的功能[11-12]，本研究又發現該基因具有抑制腫瘤細胞遷移的能力。研究發現MUC17在胃癌組織中高表達，即便是在腫瘤早期也可以檢測到MUC17的高表達，且其表達與患者預后呈正相關。綜合MUC17的表達和功能，我們推測MUC17是機體的保護因素，其高表達可抑制腫瘤的惡性行為，延長患者生存期。

已有研究表明，CDH1基因所編碼的E-cadherin具有抑制腫瘤轉移的功能[16]，其低表達是腫瘤細胞發生轉移的重要事件[17]。利用TCGA數據，我們發現在胃癌組織中MUC17的表達與CDH1的表達呈正相關，提示MUC17可能通過調控E-cadherin的表達抑制胃癌的轉移。在下一步研究中我們將闡釋MUC17調控CDH1表達的機制，為揭示胃癌轉移的機制提供新的思路。